Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Glaukom-inducerende Procedure i en Published: March 12, 2016 doi: 10.3791/53831
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Western Michigan University, 2Department of Biomedical Sciences, Grand Valley State University

Abstract

Glaukom er en sygdom i centralnervesystemet påvirker retinale ganglieceller (RGC'er). RGC axoner udgør synsnerven bære visuelt input til hjernen for visuelle opfattelse. Skader på RGC'er og deres axoner fører til synstab og / eller blindhed. Selvom de specifikke årsag glaukom er ukendt, den primære risikofaktor for sygdommen er en forhøjet intraokulært tryk. Glaukom-fremkaldende procedurer i dyremodeller er et værdifuldt redskab for forskere studerer den mekanisme af RGC død. Sådanne oplysninger kan føre til udvikling af effektive neurobeskyttende behandlinger, der kunne hjælpe i forebyggelsen af ​​synstab. Protokollen i dette papir beskrives en fremgangsmåde til induktion af glaukom - ligesom forholdene i en in vivo rottemodel hvor 50 pi 2 M hypertonisk saltvand injiceres i episcleral venøse plexus. Blanchering af skibene indikerer vellykket injektion. Denne procedure medfører tab af RGC'er at simulere glaukom. Én måned efterinjektion blev dyrene aflivet, og øjne fjernes. Dernæst hornhinden, linsen og glaslegemet fjernet for at gøre en øjestykket. Nethinden derpå skrællet fra bagsiden af ​​øjet og fastgjort på Sylgard retter med cactus nåle. På dette tidspunkt kan neuroner i nethinden farves til analyse. Resultater fra dette laboratorium viser, at ca. 25% af RGC'er er tabt inden for en måned af proceduren i forhold til de interne kontroller. Denne procedure giver mulighed for kvantitativ analyse af retinal ganglion celledød i en in vivo rotte glaukom model.

Introduction

Glaukom er en gruppe af øjensygdomme påvirker neuroner i nethinden, specifikt angår den retinale ganglieceller 1-2. Axoner af disse celler konvergere at blive synsnerven transporterer visuel information til hjernen, hvor synet opfattes. Skader på RGC'er og deres axoner forårsager derfor visuelle defekter.

De primære egenskaber i tilknytning til glaukom lidelser er RGC degeneration og død, forhøjet intraokulært tryk (IOP), og optisk disk cupping og atrofi. Disse træk fører til synstab felt eller fuldstændig irreversibel blindhed. I øjeblikket har glaukom forårsaget blindhed i 70 millioner mennesker på verdensplan 3. Som sådan, det er verdens tredjestørste årsag til blindhed 4.

Den nøjagtige mekanisme af RGC død i glaukom fortsat ukendt. Megen forskning er blevet gjort for at låse mysteriet. Det er imidlertid kendt, at den primære risikofaktor for grøn stær er en stigning in intraokulære tryk på grund af uregelmæssig cirkulation af kammervæske (AH) i det forreste kammer i øjet. AH fungerer som en transparent og farveløs erstatning for blod i avaskulære forreste kammer i øjet. Det nærer de omkringliggende celler, fjerner udskilte affaldsprodukter fra metaboliske processer, transporterer neurotransmittere, og tillader cirkulation af narkotika og inflammatoriske celler i øjet under patologiske tilstande 1.

Opretholdelsen af ​​kammervand cirkulation involverer corpus ciliare og trabekelværket. Kammervand produceres af corpus ciliare. Det strømmer så ind i det forreste kammer for at opretholde den generelle sundhed i det okulære væv. 75 - 80% af kammervand udstrømning aktivt secerneres gennem ikke-pigmentglaukom ciliære epitel når fluidet filtreres gennem tre lag af svampet væv i den ciliære muskel. Fluidet kommer ud gennem trabekelværket og gennem Schlemm Kanal som træde i stedet forerne i blodsystemet 5 .Den resterende 20 - 25% af udstrømning omgår trabekelværket og passivt udskilles af ultrafiltrering og diffusion gennem uveo-sclerale pathway. Denne vej synes at være relativt uafhængig af intraokulært tryk 1.

Når vandvæskeproduktionen og udstrømning er ude af balance, trykket opbygges inde i øjet. Som nævnt, denne stigning i intraokulært tryk er den primære risikofaktor i udviklingen af ​​glaukom. Sådant tryk medfører skade på indviklede lag af neuroner i nethinden bagerst i øjet. Skader på retina ganglieceller axoner af synsnerven får hjernen til at ikke længere modtage nøjagtig visuel information. Som følge heraf er opfattelsen af ​​synet tabt og fuldstændig blindhed kan forekomme.

Til dato er der ingen kur mod grøn stær. Forskellige behandlingsmetoder findes der primært sigter mod at reducere det intraokulære tryk. Disse omfatter aktueltmedicin klasser såsom beta1-adrenerge receptorblokkere eller aktuelle prostaglandin analoger. Beta-blokkere reducerer det intraokulære tryk ved at reducere produktionen af kammervand 7. Prostaglandiner funktion at reducere IOP ved at øge udstrømningen af vandig humor 8-14. Alfa-adrenerge agonister og kulsyreanhydrasehæmmere anvendes også som sekundære behandlingsmetoder. Alfa-adrenerge agonister øger udstrømning gennem uveosclerale pathway 15-17. Carboanhydrasehæmmere reducere produktionen af AH ved enzymatisk hæmning 18. Meget mere invasive procedurer anvendes også til behandling af glaukom. Laser trabeculoplasty bruges til at øge udstrømningen af vandig humor 19. En anden kirurgisk terapi, kaldet trabekulektomi, skaber en alternativ drænage site at filtrere AH når den traditionelle trabekulære pathway bliver blokeret 20-21.

Disse behandlingsmuligheder har været kendt for effectively reducere IOP. Men op til 40% af glaukom patienter viser normale IOP niveauer indikerer et behov for mere komplette terapeutiske metoder. 22,23 Derudover retinal ganglion celledød set i grøn stær er irreversibel, når det begynder og nuværende behandlinger ikke stoppe progressionen af sygdommen 24-28. Det har understreget behovet for effektive neurobeskyttende behandlingsformer, der er målrettet overlevelsen af ​​neuroner selv. Udvikling af glaukom modeller er afgørende for denne udvikling.

I denne undersøgelse viser vi en fremgangsmåde til induktion glaukom-lignende virkninger i voksne Long Evans-rotter under anvendelse af en modificeret procedure oprindeligt skitseret af Morrison 29. I denne procedure, injektioner af 2 M hypertonisk saltvand ind i episcleral venøse plexus inducerer glaukom-lignende tilstande ved ardannelse væv for at reducere kammervæske udstrømning i trabekelværket fører til en stigning i intraokulært tryk og et betydeligt tab af RGC'er wnden en måned efter proceduren 30-31. Glaukom-fremkaldende procedurer, som den her beskrevne, kan være nøglen til at frigøre nye udviklinger i glaukom behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer ved hjælp af dyr emner har været i overensstemmelse med de standarder for Institute of Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Western Michigan University.

1. Dyr

  1. Bruge han- og hunrotter 3 måneder gamle i denne undersøgelse.
  2. Holde dyr i en 12 timers lys / mørke-cyklus med fri adgang til foder og vand.

2. Udarbejdelse af KAX Cocktail for Animal Anæstesi

  1. Opløs 50 mg xylazin (20 mg / ml) i 5 ml ketamin (100 mg / ml) med 1 ml acepromazin (10 mg / ml) og 3 ml destilleret vand. Bland grundigt.
  2. Sterilisere med en sprøjte filter og opbevar denne opløsning i en 10 ml serum flaske.

3. KAX Injection

  1. Afvejes dyr (g) og vende tilbage til bur indtil den er klar til injektion.
  2. Injicer 0,1 ml KAX / 100 g dyrets legemsvægt intraperitonealt, under anvendelse af en 1 ml insulinsprøjte med en 28 G nål.
  3. Give lov tilfor dyr til at blive bevidstløs. Check reflekser ved at klemme fødder og hale.
  4. Hold alle dyr sikkert i laboratoriet under hele operationen.
  5. Post-kirurgi, erstatte dyr i deres bure og holde godt tilpas i RT, indtil bevidstheden er genvundet. Kun tilbage dyr til dyret facilitet, når dyrene vågner og genoptage normal adfærd.

4. Forberedelse til Kirurgi og mikro Assembly

  1. Foretag en steril 2 M NaCl-opløsning.
  2. Brug en mikroelektrode aftrækker (figur 1C) til at trække en 0,86 mm indre diameter tung poleret standard og tyndvæggede borsilicat rør i to fint tilspidsede glas mikronåle (figur 1D, 1E).
  3. Efterfylde en mikronål fra det foregående trin med 2 M saltvand under anvendelse af en opfyldning sprøjte nål og en 1 ml sprøjte (figur 1B). Taste luftbobler fra spidsen af ​​elektroden.
  4. Fyld en anden 1 ml sprøjte med 2 MNaCl. Tilslut en 18 G nål og derefter vedhæfte en længde (ca. 10 inches) af polyethylen rør (figur 1A). Brug sprøjtens stempel til at fylde polyethylen slange med saltvand gennem nålen.
  5. Når både mikrokanylen og slange er fyldt med saltvand, omhyggeligt forbinde de to. Eliminer eventuel luft i forbindelsen mellem dem (figur 2).
  6. Fint smig spidsen af ​​mikrokanylen ved at skrabe det meget let mod korn af et kursus køkkenrulle.
  7. Kontrollér modstanden af ​​mikrokanylen ved forsigtigt at trykke stemplet på sprøjten, indtil en fin strøm af væske kan ses på køkkenrulle. Strømmen af ​​væske bør ikke være bredere end 0,5 mm.

5. Udarbejdelse af Animal

  1. Påfør 1 - 2 dråber topisk anæstetikum til hornhinden (proparacainhydrochlorid oftalmisk opløsning, USP, 0,5%). Vente, indtil der ikke forekommer nogen okulær refleks.
  2. Trim knurhår med en saks.
  3. Saturate en vatpind med betadinopløsning og vatpind området omkring eksperimentelle øje.
  4. Ved hjælp af et mikroskop, vedhæfte en hæmostat at spænde den nederste øjenlåg at bule øjet, udsætte episcleral vene og begrænse øjenbevægelser. (Figur 3, pilespids)

6. Glaukom-inducerende Saline Injection

  1. Når mikronål samling og dyret fremstilles, begynde injektioner.
  2. Når dyret er bekræftet at være ikke reagerer på fødder / hale knivspids, omhyggeligt gennembore episcleral vene med mikronålen ved at komme i en lav vinkel mellem 10 og 20 grader til venen (Figur 3, hvid pil). En vellykket punktering i venen er tydelig, når blod ind i spidsen af mikronål (figur 3, sort pil).
  3. Langsomt og manuelt injicere ca. 50 pi saltvand ind i venen. Dette bør tage ca. 10 sek. Venerne vil blancher hvid som saltet cirkulerer throUH vaskulaturen (figur 4, pilespids). Nogle regioner kan opretholde en blodrød udseende (figur 4, pil).
    1. Udfør en anden injektion i venen, modsat stedet for det første, for at sikre grundig retinal beskadigelse af komplette retinal ganglion cellelag.
      Bemærk: Inden for få minutter, bør man se et distinkt uklart udseende gennem iris i øjet som saltet cirkulerer gennem karsystemet.
  4. Lad det modsatte øje ubehandlet til brug som en intern kontrol.

7. Animalske Recovery

  1. Fjern arterieklemmen.
  2. Brug en bomuld applikator til at anvende tredobbelt antibiotisk salve (Zinkbacitracin, neomycin sulfat, polymysin B sulfat) til stedet fastspændt ved arterieklemmen og injektionssteder. Vævsbeskadigelse omkring øjet ikke forekommer ved anvendelse arterieklemmen.
  3. > Placer bedøvet dyr i deres bure på en cirkulerende varmt vand tæppe til Tidligereent hypotermi. Hold dyrene under observation, indtil bevidsthed og normal adfærd er genvundet. Transport vågne dyr tilbage til dyret koloni. Dyrene forbliver i koloni indtil tidspunktet for aflivning.

8. Animal Sacrifice og Retina Removal

  1. En måned efter den procedure at fremkalde glaukom, er dyrene aflives ved CO 2 kvælning og sekundær thorax punktering.
    1. Sende dyret i kammeret og lægge låg på en sikker måde.
    2. Åbn CO 2 og gas regulator ventiler til at tillade 20% volumen / min CO 2 fortrængning af oxygen i kammeret.
    3. Tillad fire til 5 min for dyret at udløbe.
    4. Sluk begge ventiler.
    5. Fjern dyr fra kammeret og udfører en sekundær thorax punktering med en steril skalpel.
  2. Efter eutanasi, brug en skalpel til at skære bindevævet i orbital hulrum omkring øjet, being passe på ikke at skære ind i selve øjeæblet.
  3. anvende omhyggeligt buede kant saks til at klippe synsnerven og eventuelt tilbageværende væv for at ekstrahere det intakte øjeæblet. Placer ekstraheret øjeæblet i en steril 60 mm x 15 mm engangs petriskål indeholdende frisk PBS.
  4. Få et øjestykket fra øjeæblet. For at gøre dette, gør et lille snit med skalpel bare posterior til grænsen mellem iris og senehinden. Følg denne snit omkring omkredsen af ​​øjet med lille fjeder saks til at fjerne hornhindens halvkugle fra øjeæblet. Halvkuglen forbundet til synsnerven tilbage.
  5. Find den meget tynde pink / beige nethinden inde øjestykket fra aflivet dyr. Hold pigmenterede lag af nethinden med stumpe pincet til at stabilisere øjestykket. Brug et andet par af lukkede pincet til meget forsigtigt drille hele intakte nethinden off af bagsiden af ​​øjet. Undgå at klemme, trække eller rykke nethinden direkte.
  6. Bruge små spring saks til at klippeområde, hvor synsnerven stadig er fæstnet til nethinden.
  7. Vær sikker på at skære væk enhver resterende pigment epitel eller skleral væv fra nethinden.
  8. Ved hjælp af en overførsel pipette, meget forsigtigt overføre isolerede nethinden til en ren Sylgard overtrukket 35 mm x 10 mm petriskål indeholdende frisk PBS.

9. Hele-Mount Retina Forberedelse

  1. Når i Sylgard fad, bruge pincet og en kaktus nål til pin nethinden på plads. Hold retinal ganglion cellelag opad og synsnerven ned. Retinas halvkugleform er bemærkelsesværdigt, selv efter optagelsen. Krumningen af ​​nethinden vil krølle mod loftet, når den retinale ganglion cellelag er i den ønskede orientering.
  2. Brug en lille saks til at klippe nethinden i fire kvadranter, hvilket gør formen af ​​en fire blade kløver udstrålende fra det optiske nervehoved.
  3. Pin kvadranter af nethinden med yderligere cactus nåle til at gøre nethinden så flade som muligt without strækning (figur 5).
  4. Fastgør fastgjorte nethinder i Sylgard skålen med 3 ml 4% paraformaldehyd O / N ved stuetemperatur.

10. Antistof Farvning af Retina

Bemærk: Stain faste nethinder med primære og sekundære antistoffer til visning neuroner i nethinden (figur 6).

  1. Skyl faste, plane monterede nethinder tre gange i 2 min hver i PBS.
  2. Permeabilisere nethinder med 1% Triton X-100 med 1% føtalt bovint serum i PBS i 60 min.
  3. Skyl nethinder tre gange, 2 minutter hver, i PBS.
  4. Skyl to gange med 0,1% Triton X-100 i PBS, 5 min per vask.
  5. Skyl to gange med PBS, 5 min per vask.
  6. Inkuber med 1% Triton X-100 og 1% føtalt bovint serum i PBS ved stuetemperatur i 45 minutter.
  7. Skyl to gange med 0,1% Triton X-100 i PBS, 5 min per vask.
  8. Skyl to gange med PBS, 5 min per vask.
  9. Inkuber hver nethinden i 3 ml 1% kalvefosterserum i PBSmed oprenset muse-anti-rotte-CD90 / mus CD90.1 (1: 300 fortynding) O / N ved stuetemperatur.
  10. Skyl nethinder en gang med 0,1% Triton X-100 i PBS i 5 min.
  11. Skyl to gange med PBS, 5 min per vask.
  12. Inkuber hver nethinden i 3 ml PBS (ingen FBS) med sekundær Alexa Fluor 594 gede-anti-muse-IgG (1: 300) O / N ved stuetemperatur.
  13. Vask nethinder med PBS gavmildt.
  14. Ved hjælp af en dissektionsmikroskop, forsigtigt fjerne kaktus nåle fra nethinden.
  15. overføre forsigtigt nethinder på objektglas med en overførsel pipette. Vær sikker på at opretholde orientering med retinal ganglion cellelag står til loftet. Retinas halvkugleform er bemærkelsesværdigt, selv efter optagelsen. Krumningen af ​​nethinden vil krølle mod loftet, når den retinale ganglion cellelag er i den ønskede orientering.
  16. Absorber overskydende PBS med Kimwipe eller andre sådanne absorberende materiale. Pas på ikke at absorbere nethinden.
  17. Tilsæt 5 dråber ½ glycerol og ½ PBS efter vægt som amounting medier.
  18. Dæk nethinden med dækglas, undgå luftbobler.
  19. Sikker dækglas hjælp klar neglelak, lim eller anden lim.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette afsnit illustrerer apparatet komponenter og procedure anvendes til at fremkalde glaukom-lignende forhold i en in vivo rotte glaukom model. Vi viser de enkelte værktøjer og udstyr, der anvendes til at udføre en hypertonisk saltvand injektion som forårsager en stigning i intraokulært tryk. Vi viser injektion i episcleral venøse plexus med det karakteristiske blanchering virkning og uklart udseende af det forreste kammer, der resulterer. Vi beskriver også processen med nethinden fjernelse og fladskærms-montage til analyse af tabte RGC'er. Endelig viser vi virkningerne af indsprøjtning på retinal ganglion celle overlevelse. Da fordelingen af RGC'er er ujævn i forskellige regioner af rotteretina er billeder opnået fra fire 200 um 2-regioner i hver nethinde, 4 mm væk fra midten af det optiske nervehoved. Det samlede antal Thy 1.1 mærkede RGC'er i hver sektion tælles, gennemsnit og sammenlignet i eksperimentel og contr ol nethinder 31. Under anvendelse af denne metode, RGC tællinger ændret fra et gennemsnit på 225 i et billede af kontrol- ubehandlede betingelser til 168 en måned efter den procedure, der inducere glaukom-lignende betingelser (N = 30). Tilsammen kan de procedurer, der er beskrevet her, skal følges skridt for skridt at analysere død af retinale ganglion celle organer og axoner.

figur 1
Figur 1. mikro-komponenter. (A) sprøjte med polyethylenrør anvendes til saltvand injektion. (B) udfyldning sprøjte anvendes til at efterfylde borsilicat mikronål. (C) Narishige elektrode aftrækker bruges til at lave borsilicat mikronåle. (D) borsilikatglas elektroder før og efter at blive trukket i elektroden puller. (E) Forstørret visning af mikroelektrode nålespidsen efter at være trukket.ftp_upload / 53.831 / 53831fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Komplet mikro forsamling. Mikronål knyttet til polyethylen slange fastgjort til sprøjte med hypertonisk saltvand. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Glaukom-inducerende Saline injektion i episclerale veneplexus. Billede af saltvand injektion i episcleral vene af en levende, anæstetiseret Long Evans rotter. Pilehovedet angiver placeringen af ​​hæmostat anvendes til at bule øjet og forhindre dens bevægelse. Den hvide pil angiver placering af det injicerede vene. Den sorte pil viser blodet tilbage strømmer ind mikronålen spidsen indikerer vellykket venepunktur. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Blanchering Effekt af hypertonisk saltvand injektion. Billede af rotteøjet blive injiceret med hypertonisk saltvand. Pilespidsen viser den karakteristiske blanchering effekt af saltvand i episcleral venøse plexus. Pilen viser en del af den episcleral venøse plexus, som endnu ikke blancheres. Klik her for at se en større version af dette tal.

31 / 53831fig5.jpg "/>
Billede af hele mount nethinden Figur 5. Flad-mount af Rat Retina. Fjernet fra rotte øjet og pinned lejlighed i en Sylgard fad hjælp kaktus nåle. Den sorte pil viser synsnerven hoved. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Skader på retina-ganglieceller efter Glaukom-inducerende Surgery. Sammenligning af kontrol ubehandlede øje (A) til eksperimentel øjet (B) en måned efter modtagelsen glaukom inducerende saltvand injektion. Nethinder blev mærket med et antistof mod RGC markering, Thy 1.1 (CD90). Tynde pile angiver individuelle RGC'er i både kontrol- og eksperimentelle betingelser. Proceduren fører til en reduktion i antallet af RGC'er, defascikulationer af axoner fra de vigtigste bundter Axon, og forvrængning til cirkulær resterende RGC'er. Blok Pilene angiver de karakteristiske defasciculating axoner følge af saltvandsinjektion. Pilespidsen viser et blodkar i nethinden. Dobbelt-ended pile label Axon bundter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til induktion glaukom-lignende forhold i en in vivo rottemodel. Denne procedure anvender en injektion af hypertonisk saltvand til at inducere ardannelse i trabekelværket 29, 32. Udvikling arvæv okkluderer udstrømningen af kammervæske, som forøger trykket i det forreste kammer. Med nedsat udstrømning og trykopbygning, linsen suspenderet af elastiske ledbånd skubber tilbage i den glasagtige kammer. Glaslegemet gælder så tryk på nethinden beskadige de skrøbelige retinale neuroner. Vores resultater ved hjælp af denne procedure viser, at retinal ganglion celle tal begynder at svinde ind på 2 uger med betydeligt tab af ganglion celle tab på en måned efter procedure.

Denne protokol er kun en fremgangsmåde til induktion glaukom hos gnavere. Der er mange andre forsøgsmodeller, hvor beskadigelse af retina-ganglieceller opnås enten ved en forøgelse i intraokulært tryk eller ved direkte datroldmand til synsnerven 30. Ofte er disse metoder blevet udviklet i større dyr og modificeret til anvendelse på mus og rotter 33. Intraokulære injektioner af toksiner, såsom staurosporin 34 og NMDA, den ikke-hydrolyserbare glutamat analogen 35 inducerer hurtig retinal ganglion celledød. Undersøgelser har imidlertid vist, at sådanne toksiner følge en dosis-respons-kurve i mus og andre end målet ganglieceller 35 effekt celler. Derudover beskadigelse retinale ganglieceller i denne model er meget mere direkte end gradvis progression af human glaukom.

Direkte skader på synsnerven kan også påført. Laser aksotomi er en almindelig måde at adskille de axoner, der udgør synsnerven hos mus 36. Men denne metode præsenterer nogle komplikationer. Den lille størrelse af gnaver baner gør det vanskeligt præcist beskadige synsnerven uden at påvirke blodstrømmen gennem den centrale retinale arterieog vene. For at overvinde dette, nogle forskere udnytte en mere invasiv tilgang involverer fjernelse af en lille del af hjernen for at give bedre adgang til synsnerven 37. Optiske nerveknusning modeller adgang synsnerven intraorbitalt samt. I denne model er nerven klemt af selvlukkende pincet og okulær blodgennemstrømning ikke kompromitteres. Denne procedure resulterer i en umiddelbar fornærmelse og synkron død retinal ganglion celle. Undersøgelser ved hjælp af denne model viser betydeligt tab af RGC'er 38. Nogle hævder imidlertid, at det kan fremkalde mere skade end det er forårsaget af forhøjet IOP alene 39. Derudover er glaukom kendetegnes ved langsom, kronisk, asynkron tab af retinale ganglieceller 33, 39-42 .Derfor tidsforløbet og underliggende mekanisme af skade påført med synsnerven crush kunne være helt anderledes end den, der forekommer i human glaukom. I modsætning hertil modellen diskuteret i dette dokument undgår behovet for direkte access af synsnerven, eliminerer enhver dissektion af hjernevæv, og giver mulighed for gradvis retinal ganglion celleskader.

Mikroperler okklusion modeller af glaukom brug polystyren eller magnetiske perler injiceres i de forreste kamre i rotter eller mus til at ophøje IOP. Det meste af dette arbejde er blevet udført i mus og de ​​viser kun en lav til moderat niveau af skader i synsnerven med stor variation i resultaterne, og inkonsistente data 43-50. Når du bruger rotter, varigheden af forhøjet IOP var for kort til at forårsage skade nok til cellerne 48. Selv med ændringer af proceduren, modellen stadig forårsagede omfattende skader i korte varighed, der repræsenterer en akut neuropatisk model snarere end en kronisk glaukom model 51. Smedowski et al 43 har for nylig udviklet en yderligere modificeret microbead procedure ved hjælp af en ekstra indledende 'højtryk skade «for at opnå længerevarende IOP elevation med kroniske skader, does show løfte. Flere undersøgelser ved hjælp af denne teknik er nødvendige for yderligere at validere denne model.

Modeller af kronisk okulær hypertension formål at hindre vandig humor outflow. Laserfotokoagulation af episcleral og limbale vener 52 og episcleral veneokklusion 53 er to sådanne fremgangsmåder. Det har imidlertid også vist, at laser ablation teknikker producerer kun forbigående IOP elevation og et moderat niveau af faktiske celletab 36, 54-55.

Glaukom er en kronisk sygdom, som skyldes skade og tab af retinale ganglieceller, hvis axoner udgør synsnerven. Mekanismen for dette tab er ukendt. Mens en stigning i intraokulært tryk er kendetegnende risikofaktor, har nogle foreslået inddragelse af andre faktorer. Sådanne faktorer omfatter inflammatoriske processer, oxidativt stress, metaboliske uregelmæssigheder eller blod flowforstyrrelser 56-58. For at afdække den præcise mekanisme for cell død i denne sygdom, forskere brug for enkle, gentagelig, og funktionelle måder at nøjagtigt efterligne betingelser i menneskelig glaukom. Først da kan håber forskerne at udtænke en måde at beskytte retinale ganglieceller fra at dø. Den i dette dokument procedure bruger en kunstigt induceret forøgelse af IOP at frembringe en gradvis, irreversibelt tab af retinale ganglion svarende til den, der ses i glaukompatienter 31 celler. Proceduren er minimalt invasiv. Signifikant retinal ganglion celletab måles inden for en måned af kirurgi. Denne metode er en væsentlig værktøj til studiet af glaukom. En potentiel begrænsning ved denne metode er den manuelle injektion af hypertonisk saltvand. På grund af denne manuelle metode, er det muligt at forvente stor variation i resultaterne. Vi har imidlertid identificeret den blanchering virkning i venen for at være et kritisk trin. Hvis der opstår blanchering, retinal ganglion celle tab er altid mellem 18 og 29%. For at understøtte dette, kan alle fremtidige studier Modify proceduren til at omfatte rutinemæssige IOP målinger for at sikre, at disse injektioner føre til en målbar stigning i IOP. 29,31. Måske denne model af RGC død vil føre til udvikling af en mere komplet neurobeskyttende behandling, der bekæmper den ødelæggende synstab påvirker millioner af mennesker verden over.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% Sigma, Life Science X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml  Putney, Inc NDC 26637-411-01 10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml Phoenix Pharmaceutical, Inc NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml VWR 16171319 Borosilicate glass
1 ml insulin syringe  VWR BD329410 28 G needle 
Sodium chloride Sigma  S7653 2 M Solution 
Microelectrode Puller  Narishige Group PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing  Sutter Instruments B150-86-10HP without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes World Precision Instruments, Inc MF28G
18 gauge Luer-Lock needle Fisher Scientific 1130421 Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing Fisher Scientific 22046941 0.034 inch diameter, approximately 10 inches 
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% Akorn, Inc NDC 17478-263-12 15 ml  sterile bottle 
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-11
Microscope Leica  StereoZoom 4
Hemostat Clamp  Fine Science Tools 1310912 curved edge
Triple Antibiotic Ointment  Fisher Scientific NC0664481
Scalpel handle Fine Science Tools  10004-13
Scalpel blade #11 Fine Science Tools  10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish VWR 351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate Sigma, Life Science  P7059-1L 1x dilution 
Spring Scissors Fine Science Tools  15009-08
Forceps (2), Dumont # 5 Fine Science Tools 11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile BD Biosciences 357524 or 52947-948 1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish  BD Biosciences 351008
Sylgard 184 VWR 102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde EMD Millipore  PX0055-3 or 818715.0100 Made into a 4% solution 
Triton X-100 Sigma  T9284-100 ml Made into both a 1% and 0.1% solution 
Fetal Bovine Serum  Atlanta Biological S11150 500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 BD Pharmingen Cat 554892 1:300 dilution 
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse  Life Technologies  A11005 1:300 dilution 
Microscope Slides Corning  2948-75x25
Glycerol  Sigma  G5516-100 ml  50% glycerol to 50% PBS, by weight 
Coverglass  Corning  2975-225 Thickness 1 22 x 50 mm 
Confocal Microscope Nikon  C2 Eclipse Ti

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous Humor Dynamics: A Review. Open Ophthalmol. J. 4, 52-59 (2010).
  2. Thylefors, B., Negrel, A. D. The global impact of glaucoma. Bull. World Health Organ. 72 (3), 323-326 (1994).
  3. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bull. World Health Organ. 73 (1), 115-121 (1995).
  4. Roodhooft, J. M. Leading causes of blindness worldwide. Bull Soc. Belge. Ophtalmol. 283, 19-25 (2002).
  5. Sacca, S., Pulliero, A., Izzotti, A. The Dysfunction of the Trabecular Meshwork During Glaucoma Course. J. Cell. Physiol. 230 (3), 510-525 (2014).
  6. McKinnon, S. J., Goldberg, L. D., Peeple, P., Walt, J. G., Bramley, T. J. Current Management of Glaucoma and the Need for Complete Therapy. Am. J. Manag. Care. 14 (1 Suppl), S20-S27 (2008).
  7. Lee, D. A., Higginbotham, E. J. Glaucoma and its treatment: a review. Am. J. Health Syst. Pharm. 62, 691-699 (2005).
  8. Brandt, J. D., Vandenburgh, A. M., Chen, K., Whitcup, S. M. Bimatoprost Study Group. Comparison of once- or twice-daily bimatoprost with twice-daily timolol in patients with elevated IOP: a 3-month clinical trial. Ophthalmology. 108, 1023-1031 (2001).
  9. Camras, C. B. Comparison of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension and glaucoma: a six-month masked, multicenter trial in the United States. The United States Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 138-147 (1996).
  10. Netland, P. A., et al. Travoprost compared with latanoprost and timolol in patients with open-angle glaucoma or ocular hypertension. Am. J. Ophthalmol. 132, 472-484 (2001).
  11. Sherwood, M., Brandt, J. Bimatoprost Study Groups 1 and 2. Six-month comparison of bimatoprost once-daily and twice-daily with timolol twice-daily in patients with elevated intraocular pressure. Surv. Ophthalmol. 45 (Suppl 4), S361-S368 (2001).
  12. Watson, P., Stjernschantz, J. A six-month, randomized, double-masked study comparing latanoprost with timolol in open-angle glaucoma and ocular hypertension. The Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 126-137 (1996).
  13. Hedman, K., Alm, A., Gross, R. L. Pooled-data analysis of three randomized double-masked, six-month studies comparing intraocular pressure-reducing effects of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension. J. Glaucoma. 12 (6), 463-465 (2003).
  14. Schumer, R. A., Podos, S. M. The nerve of glaucoma! Arch. Ophthalmol. 112, 37-44 (1994).
  15. Tsai, J. C., Chang, H. W. Comparison of the effects of brimonidine 0.2% and timolol 0.5% on retinal nerve fiber layer thickness in ocular hypertensive patients: a prospective, unmasked study. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 21 (6), 475-482 (2005).
  16. Wilhelm, B., Ludtke, H., Wilhelm, H. The BRAION Study Group. Efficacy and tolerability of 0.2% brimonidine tartrate for the treatment of acute non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION): a 3-month, double-masked, randomised, placebo-controlled trial. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 244, 551-558 (2006).
  17. Fazzone, H. E., Kupersmith, M. J., Leibmann, J. Does topical brimonidine tartrate help NAION? Br. J. Ophthalmol. 87, 1193-1194 (2003).
  18. Harris, A., Arend, O., Kagemann, L., Garrett, M., Chung, H. S., Martin, B. Dorzolamide, visual function and ocular hemodynamics in normal-tension glaucoma. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 15, 189-197 (1999).
  19. Leahy, K. E., White, A. J. Selective laser trabeculoplasty: current perspectives. Clin. Ophthalmol. 11 (9), 833-841 (2015).
  20. Nesaratnam, N., Sarkies, N., Martin, K. R., Shahid, H. Pre-operative intraocular pressure does not influence outcome of trabeculectomy surgery: a retrospective cohort study. BMC Ophthalmol. 15 (1), 17 (2015).
  21. Cairns, J. E. Trabeculectomy. Preliminary report of a new method. Am. J. Ophthalmol. 66 (4), 673-679 (1968).
  22. Cheng, J. W., Cai, J. P., Wei, R. L. Meta-analysis of medical intervention for normal tension glaucoma. Ophthalomology. 116 (7), 1243-1249 (2009).
  23. Dielmans, I., Vingerling, J. R., Wolfs, R. C. W., Hofman, A., Grobbee, D. E., deJong, P. T. V. M. The prevalence of primary open-angle glaucoma in a population based study in The Netherlands: the Rotterdam Study. Ophthalmology. 101, 1851-1855 (1994).
  24. Lichter, P. R., et al. Interim clinical outcomes in the Collaborative Initial Glaucoma Treatment Study comparing initial treatment randomized to medications or surgery. Ophthalmology. 108 (11), 1943-1953 (2001).
  25. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1268-1279 (2002).
  26. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Arch. Ophthalmol. 120 (6), 701-713 (2002).
  27. Beidoe, G., Mousa, S. A. Current primary open-angle glaucoma treatments and future directions. Clin. Ophthalmol. 6, 1699-1707 (2012).
  28. Jeong, J. H., Park, K. H., Jeoung, J. W., Kim, D. M. Preperimetric normal tension glaucoma study: long-term clinical course and effect of therapeutic lowering of intraocular pressure. Acta. Ophthalmol. 92 (3), e185-e193 (2014).
  29. Morrison, J. C., Moore, C. G., Deppmeier, L. M., Gold, B. G., Meshul, C. K., Johnson, E. C. A Rat Model of Chronic Pressure-Induced Optic Nerve Damage. Exp. Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
  30. Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat Models for Glaucoma Research. Prog. Brain Res. 173, 285-301 (2008).
  31. Iwamoto, K., Birkholz, P., Schipper, A., Mata, D., Linn, D. M., Linn, C. L. A Nicotinic Acetylcholine Receptor Agonist Prevents Loss of Retinal Ganglion Cells in a Glaucoma Model. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (2), 1078-1087 (2014).
  32. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal Microvasculature of the Rat Eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36 (3), 751-756 (1995).
  33. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse Models of Retinal Ganglion Cell Death and Glaucoma. Exp. Eye Res. 88 (4), 816-824 (2009).
  34. Maass, A., et al. Assessment of Rat and Mouse RGC Apoptosis Imaging in Vivo with Different Scanning Laser Ophthalmoscopes. Curr. Eye Res. 32 (10), 851-861 (2007).
  35. Li, Y., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Experimental induction of retinal ganglion cell death in adult mice. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 40 (5), 1004-1008 (1999).
  36. Gross, R. L., et al. A mouse model of elevated intraocular pressure: retina and optic nerve findings. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 101, 163-171 (2003).
  37. Cenni, M. C., Bonfanti, L., Martinou, J. C., Ratto, G. M., Strettoi, E., Maffei, L. Long-term survival of retinal ganglion cells following optic nerve section in adult bcl-2 transgenic mice. Eur. J. Neurosci. 8 (8), 1735-1745 (1996).
  38. Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol. Vis. 18, 2147-2152 (2012).
  39. Schlamp, C. L., Johnson, E. C., Li, Y., Morrison, J. C., Nickells, R. W. Changes in Thy1 gene expression associated with damaged retinal ganglion cells. Mol. Vis. 7, 192-201 (2001).
  40. Libby, R. T., et al. Susceptibility to neurodegeneration in a glaucoma is modified by Bax gene dosage. PLoS Genet. 1, 17-26 (2005).
  41. Yang, Z., et al. Changes in gene expression in experimental glaucoma and optic nerve transection: the equilibrium between protective and detrimental mechanisms. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (12), 5539-5548 (2007).
  42. Huang, W., Fileta, J., Guo, Y., Grosskreutz, C. L. Downregulation of Thy1 in retinal ganglion cells in experimental glaucoma. Curr. Eye Res. 31 (3), 265-271 (2006).
  43. Smedowski, A., Pietrucha-Dutczak, M., Kaarniranta, K., Lewin-Kowalik, J. A rat experimental model of glaucoma incorporating rapid-onset elevation of intraocular pressure. Sci. Rep. 4, 1-11 (2014).
  44. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp. Eye Res. 91 (3), 415-424 (2010).
  45. Pease, M. E., Cone, F. E., Gelman, S., Son, J. L., Quigley, H. A. Calibration of the TonoLab tonometer in mice with spontaneous or experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (2), 858-864 (2011).
  46. Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 99, 27-35 (2012).
  47. Frankfort, B. J., et al. Elevated intraocular pressure causes inner retinal dysfunction before cell loss in a mouse model of experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (1), 762-770 (2013).
  48. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  49. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (7), 3847-3857 (2012).
  50. Cone-Kimball, E., et al. Scleral structural alterations associated with chronic experimental intraocular pressure elevation in mice. Mol. Vis. 19, 2023-2039 (2013).
  51. Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
  52. WoldeMussie, E., Ruiz, G., Wijono, M., Wheeler, L. A. Neuroprotection of retinal ganglion cells by brimonidine in rats with laser-induced chronic ocular hypertension. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 (12), 2849-2855 (2001).
  53. Garcia-Valenzuela, E., Shareef, S., Walsh, J., Sharma, S. C. Programmed cell death of retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 61 (1), 33-44 (1995).
  54. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (10), 4314-4320 (2003).
  55. Ji, J., et al. Effects of elevated intraocular pressure on mouse retinal ganglion cells. Vision Res. 45 (2), 169-179 (2005).
  56. Flammer, J., et al. The eye and the heart. Eur. Heart J. 34 (17), 1270-1278 (2013).
  57. Gugleta, K., et al. Association between risk factors and glaucomatous damage in untreated primary open-angle glaucoma. J. Glaucoma. 22 (6), 501-505 (2013).
  58. Mozaffarieh, M., Flammer, J. New insights in the pathogenesis and treatment of normal tension glaucoma. Curr. Opin. Pharmacol. 13 (1), 43-49 (2013).

Tags

Medicin rotte glaukom injektion, nethinde hel-mount fladskærms-mount neurovidenskab retina-ganglieceller okulær hypertension øjensygdomme
Glaukom-inducerende Procedure i en<em&gt; In vivo</em&gt; Rat Model og Whole-mount Retina Forberedelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn,… More

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn, C. Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation. J. Vis. Exp. (109), e53831, doi:10.3791/53831 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter