Identifisering av lite molekyl bindende proteiner i en Native Cellular Miljø via Live-celle Photoaffinity Merking
Summary
We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.
Abstract
Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.
Introduction
Bioaktive små molekyler prinsipielt virker ved å kommunisere med, og å endre funksjonen til en eller flere av "target" molekyler, oftest proteiner, i cellen. I drug discovery, når en aktiv forbindelse blir oppdaget gjennom fenotypisk screening, er identifisering av den molekylære mål (e) av denne forbindelse viktig, ikke bare for å forstå virkningsmekanismen og potensielle bivirkninger av forbindelsen, men også for potensielt å oppdage ny biologi underliggende sykdomsmodell og legge til rette for utvikling av nye mekanistiske klasser av therapeutics 1. Selv om målet identifikasjon ikke er nødvendig for et medikament som skal brukes terapeutisk, i de senere årene har det vært en økende erkjennelse av at nye legemiddelkandidater er mer sannsynlig å lykkes i kliniske studier, og dermed gi bedre avkastning på investeringen, hvis en validert mål er kjent 2. Således har det vært en økende interesse for fremgangsmåter for å identifisere småmolekyl target proteiner.
En klassisk mål identifisering eksperiment avhenger typisk av affinitetsrensing, hvor den lille molekylet av interesse er immobilisert på en harpiks og inkubert med helcellelysater, hvoretter ikke-bundne proteiner blir vasket bort, og de gjenværende proteiner ble eluert og identifisert tre. Selv om denne teknikken har blitt brukt for å identifisere mål i mange små molekyler 4, er det uegnet som en universell mål-identitet metode av flere grunner. For det første må målproteinet beholde sin naturlige konformasjon ved cellelysering for å beholde sin evne til å binde til det lille molekylet. Dette kan være spesielt problematisk for membranproteiner, som ofte undergår konformasjonsendringer etter å ha blitt fjernet fra sitt opprinnelige miljø, eller ganske enkelt aggregat og utfelles fra løsningen. For det andre må det lille molekylet modifiseres kjemisk på en slik måte at den kan immobiliseres på harpiksen og samtidig opprettholdedens evne til å binde mål-proteinet. Dype bindende lommer kan derfor bli utilgjengelige til et lite molekyl når den er festet til harpiksen. For det tredje må bindingsaffiniteten være tilstrekkelig høy til at vekselvirkningen blir opprettholdt i løpet av vasketrinnene, noe som gjør identifikasjon av lavere affinitetsinteraksjoner utfordrende. Fjerde, miljømessige forhold som pH, ion-konsentrasjon, eller tilstedeværelse av andre endogene molekyler kan variere romlig inne i cellen og er ofte en forutsetning for narkotika-målet interaksjoner. Dermed finne de riktige betingelser for å gi og opprettholde bindingen utsiden av cellen kan kreve en betydelig mengde av prøving og feiling.
Photoaffinity merking omgår disse problemene ved at den kovalente binding av et lite molekyl, og dens mål innenfor det native rammen av en celle. I stedet for å immobilisere det lite molekyl til et stort voluminøse harpiks, er molekylet i stedet kjemisk modifisert for å installere to liten funksjonell groups: en photoactivatable gruppe som tillater kovalent tverrbinding til målproteinet når de bestråles med en bestemt bølgelengde av lys, og en rapportørgruppe som lar målproteinet som skal påvises og deretter isolert. Levende celler er behandlet med den photoaffinity sonde, proben binder og kovalent kryssbinder til målet protein, og sonden-proteinkomplekset blir deretter isolert intakt. Spesifisiteten av proben bindes til målet blir påvist ved å utføre et konkurranseeksperiment i parallell, hvor et overskudd av den opprinnelige forbindelsen blir brukt til å konkurrere vekk binding av proben til mål-proteinet.
Design og syntese av photoaffinity sonder varierer fra ett lite molekyl til et annet, og vil ikke bli dekket i denne protokollen; har imidlertid flere gode diskusjoner om emnet publisert 5-9. Hovedgrunnen er at sonden beholder bioaktivitet av modersubstansen, derfor presumably binding til det samme målet (s). Struktur-aktivitetsforhold (SAR) studier må utføres for å avgjøre hvilke deler av molekylet kan endres uten tap av bioaktivitet. En rekke forskjellige kjemiske grupper er blitt anvendt som photoactivatable tverrbindingsmidler, inkludert diazirine, benzofenon, og aryl azid, som hver har fordeler og ulemper 10. Likeledes er det flere rapportør koder som har blitt brukt til å isolere probe-bindende proteiner. Rapportørgrupper kan være funksjonelle på egenhånd, slik som vanligvis anvendes biotin eller fluoriserende koder, eller kan være forløpere som krever ytterligere funksjonalisering etter at fototverrbindingen steg, som har fordelen av å være mindre og derfor mindre tilbøyelige til å gå på akkord bioaktivitet 11.
I denne protokollen, har vi brukt en photoaffinity sonde som inneholder en diazirine fototverr gruppe, og en terminal alkyn for feste av en reporter gruppe gjennom en Cu (I) -catalyzed Azid-alkyn Sharpless-Hüisgen cykloaddisjon (eller klikk) reaksjon 12-15. SAR-studier undersøke design og syntese, og resultatene av disse studiene er publisert andre steder 16-18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ulike tilnærminger til å identifisere målene for små molekyler kan grovt grupperes i to kategorier: top-down, hvor den cellulære fenotype av stoffet er brukt til å begrense sine potensielle mål basert på deres kjente funksjoner, eller bottom-up, hvor målet er direkte identifisert ved kjemisk eller genetisk betyr tre. Top-down eller fenotypiske undersøkelser kan identifisere visse cellulære prosesser som påvirkes av narkotika (f.eks transkripsjon / oversettelse / syntese DNA, cellesyklus b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Ben Nacev for advice on design of the photoaffinity labeling protocol, Dr. Wei Shi for synthesizing the itraconazole photoaffinity probe, Dr. Yongjun Dang for advice on affinity pull-down experiments, and other members of the J.O.L. laboratory for helpful comments and support. This work was supported in part by a PhRMA Foundation Fellowship in Pharmacology/Toxicology (to S.A.H.); National Cancer Institute Grant R01CA184103; the Flight Attendant Medical Research Institute; Prostate Cancer Foundation (J.O.L.); and the Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, which is funded in part by Grant UL1 TR 001079 from the National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).
Materials
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20°C. |
| Copper Sulfate (CuSO4-5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20°C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptamycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2X) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
- Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca’s drug pipeline: a five-dimensional framework. Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).
- Titov, D. V., Liu, J. O. Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules. Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).
- Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).
- Sumranjit, J., Chung, S. J. Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes. Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).
- Robles, O., Romo, D. Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies. Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).
- Zhou, Q., Gui, J., et al. Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds. J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).
- Li, Z., Hao, P., et al. Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling. Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).
- Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion. ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).
- Mackinnon, A. L., Taunton, J. Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).
- Smith, E., Collins, I. Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification. Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).
- Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. 1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen. Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Head, S. A., Shi, W., et al. Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells. P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).
- Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling. J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).
- Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole. ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
