Eine Alternative und Validated Injektionsmethode für den Zugriff auf den subretinalen Raum<i> über</i> A Transcleral dorsalen Zugang
Summary
Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.
Abstract
Subretinale Injektionen wurden bei Mensch und Nager zu liefern therapeutische Interventionen von Proteinen, viralen Mitteln und Zellen zur Interphoto / subretinalen Fach, das direkte Exposition muss Photorezeptoren und die retinalen Pigmentepithel (RPE) erfolgreich eingesetzt. Subretinale Injektionen von Plasminogen sowie die jüngsten präklinischen und klinischen Studien haben die Sicherheit nachgewiesen und / oder Wirksamkeit von mit fortgeschrittenen Netzhauterkrankungen viralen Vektoren und Stammzellen an Einzelpersonen zu liefern. Mausmodelle von Netzhauterkrankungen, insbesondere erbliche Netzhautdystrophien, sind für diese Therapien zu testen. Die häufigste Injektionsverfahren bei Nagetieren ist klein transcornealen oder transcleral Einschnitte mit einem vorderen Ansatz zur Netzhaut zu verwenden. Mit diesem Ansatz dringt die Injektionsnadel die neurosensorische Netzhaut des zugrunde liegenden RPE und beim Einsetzen stören kann leicht nick die Linse, so dass Linsentrübung und Beeinträchtigung von nicht invasiver imaging. Zugriff auf den subretinalen Raum über einen transcleral vermeidet hinteren Ansatz, diese Probleme: die Nadel durchquert die Sklera etwa 0,5 mm von der Sehnerv, ohne Netzhautpenetration und vermeidet den Glas zu stören. Kollateralschaden ist nicht auf die beschränkt, die mit der Brenn Sclerotomie zugeordnet ist, und die Auswirkungen eines vorübergehenden, seröse Netzhautablösung. Die Einfachheit des Verfahrens minimiert Augenverletzung, sorgt für eine schnelle Netzhaut Wiederanheftung und Erholung, und hat eine niedrige Ausfallrate. Die minimale Schäden an der Netzhaut und RPE ermöglicht eine klare Beurteilung der Wirksamkeit und direkten Auswirkungen der therapeutischen Mittel selbst. Diese Handschrift beschreibt eine neue subretinalen Injektionstechnik, die verwendet werden können virale Vektoren, pharmakologische Mittel zu zielen, Stammzellen oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) -Zellen in den subretinalen Raum in Mäusen, die mit hoher Wirksamkeit, minimale Beschädigung und schnelle Wiederherstellung.
Introduction
Subretinale Injektionen sind das wichtigste Mittel der auf der Netzhaut von Mäusen zellulären und viralen Mittel liefern ihre Auswirkungen auf die Photorezeptoren zu studieren und die zugrunde liegenden RPE 1,2. Die meisten subretinalen Injektionsprotokolle in Mäusen verwenden eine transcornealen oder eine transcleral Injektionsstelle anterioren zum Äquator (Abbildung 1). Dieser Ansatz kann in inhärenten Kollateralschäden führen , dass nicking und resultierende Trübung der Linse, Störung der Integrität des Glaskörpers, das Eindringen der neurosensorischen Netzhaut und Iris, Netzhautblutungen 3-9, erhebliche Netzhautablösungen und dauerhafte subretinalen Ödem enthält. Experimentelle Manipulationen müssen diese Effekte um 3,7,10,11 überwinden die Auswirkungen von therapeutischen Interventionen zu bewerten. Diese Studie enthält eine detaillierte Beschreibung und Validierung eines hinteren transcleral Injektionsverfahren, das diese Komplikationen vermeidet, minimiert Trauma und hat eine hohe Erfolgsquote der Unter TargetingRetina-Raum.
Einspritzungen den subretinalen Raum in Mäusen Targeting sind oft sehr schwierig durchzuführen und die meisten Forscher in denen eine hohe Frequenz von Fehlversuchen in dem der Vektor an eine falsche Stelle geliefert wird , oder es gibt signifikante Netzhautschäden, beispielsweise in einer vollständigen Netzhautablösung 6. Die Anzahl der Augen von der Analyse ausgeschlossen, da der Einspritz Komplikationen typischerweise nicht in Maus-Studien berichtet, aber in unserer eigenen Erfahrungen und in Diskussion mit anderen Forschern, kann die Anzahl von Fehleinspritzungen so hoch wie 50% und variieren abhängig von der Erfahrung und Fähigkeiten der Ermittler, die Injektionen durchführt. Der Erfolg der Injektion wird typischerweise durch direkte Fundusabbildung und / oder optische Kohärenztomographie (OCT) 7,9 beurteilt. Ein leicht zu beherrschen Verfahren mit hohen Erfolgsraten für subretinalen Injektionen in Mäuse können Experimente zu beschleunigen und die Kosten der präklinischen Studien von tre reduzierenatments für Netzhauterkrankungen, die Hauptursachen für Blindheit in den Vereinigten Staaten sind.
Der hintere, transcleral subretinalen Injektion hier beschriebene Technik ist eine Adaption von klinischen und präklinischen Protokolle 9,12. Die nicht-invasive diagnostische in injizierten Mäusen Einschätzungen zeigen, mild und stark lokalisierte Schaden und es fehlt ihnen zusätzliche Sicherheiten Linse, Netzhaut und RPE Verletzung. Darüber hinaus mit relativ wenig Übung, ein Experimentator können diese Ergebnisse mit einer hohen Erfolgsquote erreichen (80 – 90% oder mehr), um dadurch die Kosten im Zusammenhang mit solchen Studien verbunden sind, reduziert. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um zelluläre, viralen oder pharmakologischen therapeutischen Interventionen zu Photorezeptoren und / oder RPE in präklinischen Studien zu liefern und zu leicht experimentellen Interventionen zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Subretinale Injektionen sind die Methode der Wahl für die Lieferung von viralen Vektoren und Stammzell-abgeleiteten Therapie für Photorezeptoren und den RPE in der Grundlagenforschung und der klinischen Behandlung zu manipulieren. Bei Patienten werden subretinalen Injektionen typischerweise mit einem vorderen Sclerotomie an der Pars plana, einen hinteren Kern Vitrektomie und das Eindringen der Netzhaut durch die Nadel mit direkter Visualisierung erfolgen. Wie bei den meisten Vitrektomie Verfahren ist es üblich, für …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.
Materials
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
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