Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.
זריקות subretinal שימשו בהצלחה בשני בני אדם ומכרסמים לספק התערבויות טיפוליות של חלבונים, סוכנים ויראלי, ותאי לתא interphotoreceptor / subretinal כי יש חשיפה ישירה קולטני האור ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). זריקות subretinal של plasminogen וכן ניסויים פרה-קליניים וקליניים האחרונים הוכיחו בטיחות ו / או יעילות של מתן וקטורים ויראליים ותאי גזע ליחידים עם מחלת רשתית מתקדמת. מודלים עכבר של מחלת רשתית, במיוחד dystrophies רשתית תורשתי, חיוניים לבדיקת לטיפולים אלה. הליך ההזרקה הנפוץ ביותר במכרסמים הוא להשתמש transcorneal הקטן או חתכי transcleral עם גישה קדמית לרשתית. עם גישה זו, מחט הזריקה חודר הרשתית הנוירו לשבש את הרשתית הבסיסית ועל החדרת יכול בקלות ניק העדשה, גרימת עכירות העדשה וירידת ערך Imagi פולשניתng. גישה למרחב subretinal באמצעות transcleral, גישה אחורית תמנע בעיות אלה: המחט חוצה את בלובן העין כ 0.5 מ"מ מן עצב הראייה, ללא חדירת רשתית ונמנעה לשבש את הזגוגית. נזק סביבתי מוגבל כי הקשורים מוקדי sclerotomy ואת ההשפעות של חולף, היפרדות רשתית הצפק. הפשטות של השיטה ממזער פגיעה עינית, מבטיחה שחיבור רשתית מהיר והתאוששות, ויש לו שיעור כישלון נמוך. הניזק המינימאלי רשתית הרשתית מאפשר הערכה ברורה של יעילויות התרופות ותופעות ישירות של הסוכנים הטיפוליים עצמם. כתב יד זה מתאר טכניקת ההזרקה subretinal הרומן, שניתן להשתמש בהם כדי למקד וקטורים ויראליים, סוכני תרופתי, תאי גזע או גזע מושרים (iPS) תאים למרחב subretinal בעכברים עם יעילות גבוהה, נזק מינימלי, והתאוששות מהירה.
זריקות subretinal הן האמצעי העיקרי של אספקת סוכנים הסלולר ויראלי אל הרשתית של עכברים ללמוד והשפיע על קולטני אור ואת 1,2 שבבסיס הרשתית. רוב פרוטוקולי הזרקת subretinal בעכברים להשתמש transcorneal או קדמי זריקת transcleral לקו המשווה (איור 1). גישה זו יכולה לגרום נזק סביבתי הגלום הכולל שסחב ו ערפול כתוצאה של העדשה, שיבוש של שלמות, חדירה הזגוגית של הרשתית הנוירו ואיריס, דימום ברשתית, היפרדות רשתית משמעותי ובצקת subretinal קיימא 3-9. מניפולציות ניסוייות חייבות להתגבר על תופעות אלה על מנת להעריך את ההשפעות של התערבויות טיפוליות 3,7,10,11. מחקר זה מספק תיאור מפורט ואימות של שיטת הזרקה אחורית transcleral כי תמנע סיבוכים אלה, ממזער טראומה בעל שיעור הצלחה גבוה של מיקוד המשנהשטח הרשתית.
זריקות מיקוד במרחב subretinal בעכברים הן בדרך כלל מאוד קשות לביצוע רוב החוקרים נתקלים בתדירות גבוהה של ניסיונות כושלים שבו הווקטור מועבר על מיקום לא נכון או שיש פגיעה ברשתית משמעותית, למשל היפרדות רשתית מלאה 6. מספר העיניים מחוץ ניתוח עקב סיבוכי הזרקת בדרך כלל אינו מדווח במחקרי עכבר, אבל הניסיון שלנו והן בדיון עם חוקרים אחרים, מספר זריקות נכשלו יכולה להיות גבוהים ככל 50% ולגוון תלוי הניסיון יכולות של החוקר שמבצע את הזריקות. ההצלחה של ההזרקה נבחנת בדרך כלל על ידי הדמיה הפונדוס ישירה ו / או טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר) 7,9. שיטה לשלוט בקלות עם שיעורי הצלחה גבוהים עבור זריקות subretinal בעכברים יכול לזרז ניסויים ולהפחית את העלות של מחקרים פרה של טרהatments למחלות רשתית כי הם הגורמים העיקריים לעיוורון בארצות הברית.
האחורי, טכניקת הזרקת subretinal transcleral המתוארת כאן היא עיבוד פרוטוקולים קליניים פרה-קליניים 9,12. הערכות האבחנתיות פולשנית שבוצעו עכברים שהוזרקו להדגים ניזק עדין מאוד מקומי וחסרי עדשה בטוחה נוספת ברשתית ופגיעת רשתית. יתר על כן, עם קצת אימון יחסית, נסיין יכול להשיג את התוצאות הללו עם שיעור הצלחה גבוה (80 – 90% או יותר), ובכך להפחית את העלויות הכרוכות מחקרים כאלה. הליך זה יכול לשמש כדי לספק הסלולר, ויראלי, או התערבויות טיפוליות תרופתיות כדי קולטני אור ו / או רשתית במחקרים פרה-קליניים להעריך התערבויות ניסיוני בקלות.
זריקות subretinal הן את שיטת בחירה עבור המשלוח של וקטורים ויראליים גזע טיפול תאים שמקורם מניפולציה קולטני אור ואת הרשתית הוא במחקר בסיסי טיפול מרפאתי. בחולים, זריקות subretinal נעשים בדרך כלל עם sclerotomy הקדמי ליד פלאנה Pars, vitrectomy הליבה האחורי וחדירה של הרשתית על ידי מחט עם להדמיה …
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.
Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
Hamilton Needle 33G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5mm Blade |
22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100mg/ml |
0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |