Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.
Subretinal injeksjoner har blitt brukt i både mennesker og gnagere å levere terapeutiske intervensjoner av proteiner, virale midler, og celler til interphotoreceptor / subretinal rommet som har direkte eksponering mot fotoreseptorer og retinal pigment epitel (RPE). Subretinal injeksjoner av plasminogen samt nyere prekliniske og kliniske studier har vist sikkerhet og / eller effekt av å levere virale vektorer og stamceller til personer med avansert retinal sykdom. Musemodeller av retinal sykdom, spesielt arvelig retinal dystrophies, er avgjørende for å teste disse terapi. Den vanligste injeksjonsprosedyren i gnagere er å bruke lite transcorneal eller transcleral snitt med en anterior tilnærming til netthinnen. Med denne tilnærmingen, kanylen penetrerer nevrohinnen forstyrre den underliggende RPE og ved innsetting kan lett nick objektivet, slik linse opasifikasjon og nedskrivning av ikke-invasiv Imaging. Tilgang til subretinal plass via et transcleral, unngår posterior tilnærming disse problemene: nålen krysser sclera ca 0,5 mm fra synsnerven, uten retinal penetrasjon og unngår å forstyrre glasslegemet. Collateral Damage er begrenset til at forbundet med midt sclerotomy og virkningene av en forbigående, serøs netthinneavløsning. Enkelheten av metoden minimerer okulær skade, sikrer rask retinal reattachment og utvinning, og har en lav strykprosent. Den minimale skader på netthinnen og RPE tillater klar vurdering av effekt og direkte virkninger av de terapeutiske midler i seg selv. Dette manuskriptet beskriver en ny subretinal injeksjonsteknikk som kan brukes til å målrette virale vektorer, farmakologiske midler, stamceller eller indusert pluripotent stammen (IPS) celler til subretinal plass i mus med høy effekt, minimal skade, og rask restitusjon.
Subretinal injeksjoner er den viktigste måten å levere cellulære og virale midler til netthinne til mus for å studere deres virkninger på fotoreseptorene og den underliggende RPE 1,2. De fleste subretinal injeksjon protokoller i mus bruker en transcorneal eller en transcleral injeksjonsstedet anterior til ekvator (Figur 1). Denne tilnærmingen kan føre iboende collateral damage som inkluderer nicking og resulterende uklarhet i linsen, forstyrrelse av integriteten av glasslegemet, penetrering av nevronetthinnen og iris, retinal blødning, betydelige retinal avdelinger og varig subretinal ødem 3-9. Eksperimentelle manipulasjoner må overvinne disse effektene for å evaluere effekten av terapeutiske intervensjoner 3,7,10,11. Denne studien gir en detaljert beskrivelse og validering av en posterior transcleral injeksjon metode som unngår disse komplikasjonene, minimerer traumer og har en høy suksessrate på målretting mot underretinal plass.
Injeksjoner rettet mot subretinal plass i mus er ofte svært vanskelig å utføre, og de fleste etterforskere støter på en høy frekvens av mislykkede forsøk der vektoren blir levert til en feil plassering eller det er betydelig retinal skade, for eksempel i en komplett netthinneavløsning 6. Antallet øyne ekskludert fra analysen på grunn av injeksjons komplikasjoner er vanligvis ikke rapportert i musestudier, men i vår egen erfaring og i samarbeid med andre forskere, kan antallet mislykkede injeksjoner være så høyt som 50% og varierer avhengig av erfaring og egenskapene til etterforsker som utfører injeksjoner. Suksessen til injeksjon er vanligvis vurdert av direkte fundus bildebehandling og / eller optisk koherens tomografi (OCT) 7,9. En lett mestret metode med høy suksessrate for subretinal injeksjoner i mus kan fremskynde eksperimentering og redusere kostnadene for prekliniske studier av treatments for netthinnesykdommer som er viktige årsaker til blindhet i USA.
Den bakre, transcleral subretinal injeksjonsteknikken som beskrives her er en tilpasning fra kliniske og prekliniske protokoller 9,12. De ikke-invasiv diagnostisk vurderingene i injisert mus demonstrere mild og svært lokaliserte skader og mangler ytterligere sikkerhet linse, netthinne og RPE skade. Videre, med relativt lite praksis, kan en eksperimentator oppnå disse resultatene med en høy suksessrate (80-90% eller bedre), og dermed redusere kostnadene forbundet med slike studier. Denne prosedyren kan brukes til å levere mobilnettet, virus, eller farmakologiske terapeutiske intervensjoner til fotoreseptorene og / eller RPE i prekliniske studier og for enkelt å evaluere eksperimentelle intervensjoner.
Subretinal injeksjoner er metoden for valg for levering av virale vektorer og stamcelle-avledet terapi for å manipulere fotoreseptorene og RPE i både grunnforskning og klinisk behandling. Hos pasienter, er subretinal injeksjoner vanligvis gjort med en anterior sclerotomy på Pars plana, en bakre kjerne vitrectomy og penetrasjon av netthinnen av nålen med direkte visualisering. Som med de fleste vitrektomi prosedyrer, er det vanlig for katarakt å oppstå for tidlig, med mindre øyet er allerede pseudo. I mus, er subr…
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.
Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
Hamilton Needle 33G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5mm Blade |
22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100mg/ml |
0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |