Introduction
Planter producerer frø, som giver anledning til den næste generation. Frø akkumulere store mængder af opbevaring reserver, såsom olier, kulhydrater og proteiner, til post-germinative vækst. Mennesker anvender frø opbevaring reserver som kilder til fødevarer og dyrefoder, og dermed plantefrø er en af de største leverandører af spiselige organisk stof i hele verden. Stigende frøudbytter er en vigtig udfordring i plante videnskab.
Da frø opbevaring reserver er kommercielt værdifulde fødekilder og industrielle materialer, har de molekylære mekanismer, der ligger til grund for reguleringen af metabolismen af disse reserver blevet bredt undersøgt 1-6. Yderligere belyse disse mekanismer vil være nyttige for at øge frøudbytter i afgrøder. Frø udvikle sig i plante æggestokke efter befrugtningen, og de modnes gennem en række udviklingsstadier 1,6,7. Yderligere forstå den molekylære mekanisme underliggende frø udvikling kræver detaljeret, Præcise genekspressionsprofiler fra en række udviklende frø, der skal fremstilles. Imidlertid er de høje mængder af olier, proteiner, kulhydrater og polyphenoler i plantefrø gør det vanskeligt at isolere højt oprenset RNA, som udelukker nøjagtig profilering af genekspression.
Her introducerer vi en effektiv fremgangsmåde til RNA-isolering fra oliefrø indeholder store mængder af olier, proteiner og polyphenoler. Ved hjælp af denne metode, vil forskerne kunne udarbejde højt oprenset RNA. En sådan RNA vil være nyttig til overvågning transkriptionelle ændringer i vigtige gener, der kontrollerer den metaboliske regulering af frø opbevaring reserver i at udvikle og modne oliefrø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udvinding af Total RNA fra plantefrø
- Forbered puffersystemer sæt, spin-søjler, 1,5 og 2,0 ml polypropylenrør og nukleasefrit 1,5 ml polypropylenrør.
- Tilsæt 1% (vægt / volumen) molekylærbiologisk kvalitet polyvinylpyrrolidon (i det følgende benævnt PVP) til cellelyse-buffer til RNA-ekstraktion og vortex kraftigt. Inkuber i 20 minutter ved 25 ° C for at opløses fuldstændigt. Efter 20 minutters inkubation, bland bufferen forsigtigt ved at dreje røret på hovedet for at forhindre dannelsen af bobler. Opbevar ved stuetemperatur (15-25 ° C) før brug.
- Harvest frugter fra Arabidopsis thaliana planter og sted i 1,5 ml polypropylen rør på is. Placer frugter på aluminiumsplader holdt ved 4 ° C og isolere frø fra frugterne under et stereo mikroskop.
- Placer isolerede frø (ca. 200 frø) i 1,5 ml polypropylen rør, der er gemt i en aluminium rack på is og straks placere rørene i flydende nitrogen.
- Fjern rørene fra den flydende nitrogen og returnere dem til aluminium rack på is. Tilsæt 100 pi af buffer indeholdende 1% PVP og centrifugeres i 1 min ved 1000 xg ved 4 ° C.
- Homogenisere prøven med en rustfri stål pistil ved anvendelse af en motor-mølle i 60 s og samtidig holde røret i aluminium rack på is.
- Tilføj 550 pi af buffer indeholdende 1% PVP, bland bufferen forsigtigt ved at dreje røret på hovedet, og inkuberes i 10 minutter ved 25 ° C.
- Centrifuger i 5 minutter ved 8000 xg ved 25 ° C og overførsel 550 pi af supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml polypropylenrør.
- Centrifuger i 5 minutter ved 10.000 x g ved 25 ° C og overførsel 450 pi af supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml polypropylenrør.
- Brug supernatanten som cellelysatet til RNA-ekstraktion. Herefter følges proceduren i producentens instruktioner i kommercielt tilgængelige kit.
- eluereRNA under anvendelse af en minimalt volumen af elueringspufferen for at sikre en tilstrækkelig høj koncentration af RNA til overvågning af ekspressionsmønstre for lavt transkripter niveau. Opbevar RNA i en dybfryser indtil anvendelse.
2. Kontrol af RNA Kvalitet
- Optø den samlede RNA, bland ved en let banken, og placer røret i en aluminium rack på is.
- Mål RNA koncentration, A260 / A280-forholdet, og A260 / A230-forholdet ved hjælp af en microvolume spektrofotometer.
- Fortynd det totale RNA i RNase-frit vand til en slutkoncentration på 70 ng / pl.
3. revers transkription af totalt RNA fra Seeds
- Optø det totale RNA og buffer-sæt fra den kommercielt kit. Hold enzymerne fra sættet på is efter forsigtig aflytning. Forbered Nuclease-Free 0,2 ml polypropylenrør.
- Tilsæt 5 pi af total RNA, 1 pi oligo dT primer (50 uM) og 1 uM af Random 6-mer (50 uM) til 0,2 ml polypropylene rør på is.
- Inkuber i 15 minutter ved 37 ºC og placer på is.
- Herefter følges proceduren i producentens instruktioner i revers transkription-PCR kit.
- Placer reverse transskriptionsprodukter på is før anvendelse.
4. kvantitativ real-time PCR-analyse
- Konstruere plasmider, der huser mål-gensekvenser under anvendelse af fabrikantens protokol.
- Justere koncentrationerne til 100-500,000 kopier / pi til DNA skabeloner til standardkurverne.
- Fortynd cDNA opløsninger (1: 100) med destilleret vand.
- Tilsæt 2 pi af den fortyndede cDNA løsninger og plasmider til standardkurverne til master mix fra det kvantitative real-time PCR-kittet.
- Oprettet realtids-PCR under anvendelse af følgende cykliseringsbetingelser: 95 ° C i 30 s og derefter 40 cykler ved 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 35 s.
- Analyser kopi numre i henhold til mandencentens anvisninger for real-time PCR-system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi først undersøgt den optimale koncentration af PVP hjælp Arabidopsis modne frø. Totalt RNA blev isoleret fra ca. 1.000 frø ifølge protokollen beskrevet ovenfor under anvendelse cellelyse-buffer indeholdende 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% eller 2,0% PVP. Efter homogenisering og centrifugering blev supernatanten opsamlet og samtidig undgå olielaget og frø debris (figur 1A).
Figur 1: Estimering af optimal koncentration polyvinylpyrrolidonen i cellen lysisbuffer. Totalt RNA blev ekstraheret med cellen lysisbuffer indeholdende forskellige koncentrationer af PVP. (A) Et fotografi af frøene efter homogenisering og centrifugering. (B) Graferne for bølgelængde absorbans for hver prøve er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Mængderne og renheden af de isolerede RNA'er blev estimeret ud fra grafen for bølgelængde-absorbans (figur 1B), som viste, at 1,0% PVP var den mest effektive koncentration til isolering af store mængder oprenset RNA fra frø.
Frø til udvikling blev isoleret fra Arabidopsis thaliana frugter på præ-kølet aluminiumplader på is under et stereomikroskop (figur 2A, 2B). Frøene blev homogeniseret med en rustfri stål støder og motor-kværn i et rør på en aluminium rack på is (figurerne 2C, 2D).
2.jpg "/>
Figur 2: Isolering og homogenisering af frø til udvikling af Arabidopsis thaliana. Udviklende frø isoleres fra frugter på en kold aluminiumsplade under et stereomikroskop (A). Frugtblade er skrællet fra stilken (B), og frø til udvikling opsamles. Frøene homogeniseres i lysepuffer indeholdende 1% (vægt / volumen) polyvinylpyrrolidon under anvendelse af en rustfri stål pistil (C) i rør i en aluminium rack afkølet på is (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Totalt RNA blev isoleret fra frøene ved 4, 8, og 12 dage efter blomstring (i det følgende benævnt DAF) ved hjælp af vores nyudviklede metode eller den konventionelle metode. Koncentrationerne, A260 / A280-forhold, og A260 /A230-forhold på RNA isoleret fra 200 frø er vist i tabel 1.
| Metode | DAF | RNA-koncentrationen | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Konventionel | 4 | 72,4 ± 7,4 | 1,90 ± 0,02 | 2,27 ± 0,06 |
| 8 | 10,8 ± 3,0 | 1,50 ± 0,08 | 1,40 ± 0,17 | |
| 12 | 4,9 ± 1,7 | 1,57 ± 0,10 | 0,76 ± 0,18 | |
| Ny | 4 | 63,7 ± 2,6 | 2.10 ± 0,08 | 2,29 ± 0,03 |
| 8 | 46,3 ± 4,9 | 2,15 ± 0,05 | 2,23 ± 0,09 | |
| 12 | 41,77; 3.1 | 2,09 ± 0,04 | 2,17 ± 0,07 |
Tabel 1: Koncentrationer, A260 / A280 nøgletal, og A260 / A230 forhold mellem RNA isoleret fra Arabidopsis frø. Totalt RNA blev isoleret fra ca. 200 frø (fra 190 til 206 frø) ved 4, 8, og 12 DAF anvendelse af den konventionelle metode eller vores nyligt udviklede metode. RNA-koncentrationer, A260 / A280 forhold og A260 / A230-forhold blev målt. Værdier repræsenterer middel ± SD af tre uafhængige forsøg.
Resultaterne viser, at vores metode muligt for os at isolere højtrenset RNA fra 8 og 12 DAF frø. Den totale RNA blev revers-transkriberet til cDNA, og cDNA'et opløsninger blev fortyndet 100 gange. Numrene kopi af WRI1 (rynket 1: AT3G54320), SDP1 (SUKKER DEPENDENT1: AT5G04040) 7 </ sup>, og EIF3K (eukaryot translationsinitiering faktor 3K: AT4G33250) som en intern kontrol 8 blev målt, og de relative mængder af de transkripter blev estimeret ved kvantitativ realtids-PCR-analyser (figur 3).
Figur 3: Kvantificering af lave niveau udskrifter i udviklingslandene frø. Totalt RNA blev ekstraheret fra 4, 8, og 12 DAF frø ved hjælp af vores fremgangsmåde, og cDNA blev fremstillet. De relative mængder af WRI1 (A) og SDP1 (B) transkripter blev målt ved kvantitativ realtids-PCR. EIF3K blev anvendt som en intern kontrol. Værdier repræsenterer mean ± SD af tre uafhængige forsøg. DAF; dage efter blomstring. Klik hanre for et større version af denne figur.
Selvom mængderne af WRI1 og SDP1 transkripter er relativt lav i frø til udvikling, var det muligt at påvise ekspression ændringer mellem frø på forskellige udviklingsstadier. At verificere, at vores metode kan anvendes i andre oliefrø, blev totalt RNA isoleret fra modne frø af Brassica napus og Glycine max. RNA-koncentrationer, A260 / A280 forhold og A260 / A230-forhold er vist i tabel 2.
| Metode | Plante | RNA-koncentrationen | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Konventionel | B. napus | 7,7 ± 0,8 | 1,5 ± 0,12 | 0,75 ± 0,11 |
| G. max | 1,61 ± 0,06 | 0,69 ± 0,09 | ||
| Ny | B. napus | 143,2 ± 19,0 | 2,17 ± 0,03 | 2,23 ± 0,13 |
| G. max | 152,3 ± 4,4 | 2,17 ± 0,02 | 2,30 ± 0,02 |
Tabel 2: Koncentrationer, A260 / A280 nøgletal, og A260 / A230 forhold mellem RNA isoleret fra modne frø af Brassica napus og Glycine max. Totalt RNA blev isoleret fra ca. 100 mg af Brassica napus og Glycine max frø ved hjælp af den konventionelle metode eller vores nyligt udviklede metode. Frøene var tidligere knust og groft homogeniseres med en morter og støder afkølet i flydende nitrogen. RNA-koncentrationer, A260 / A280 nøgletal og A260 / A230-forhold blev målt. Værdier repræsenterer middel ± SD af tre uafhængige forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genekspressionsprofiler bidrage til vores forståelse af plantefysiologi; Derfor har specifikke RNA isolation metoder blevet udviklet til hver prøve tilstand 9-12. Vi undersøgte de processer, der blev inhiberet under RNA-isolering fra frø og fundet, at RNA-binding til silica-membraner blev alvorligt inhiberet. Store mængder olie, proteiner og polyfenoler hæmme RNA isolation. Vi ændret RNA-ekstraktion for at fjerne disse forbindelser med en lyseopløsning før processen af RNA-binding til silica membraner. De vigtige ændringer omfattede tilføjelsen af 1% PVP (trin 1.2) og indsamling af supernatanten fra centrifugerede lysis løsning (trin 1.7, 1.8). Formålet med tilsætning af 1% PVP er at fjerne polyphenoler. Vi undersøgte den mest effektive koncentration af PVP at bruge og bekræftede, at 1% PVP er den mest effektive koncentration for denne proces. Formålet med at indsamle supernatanten fra centrifugeres lysis løsninger at fjerne olie og proteiner. Supernatanten bør indsamles omhyggeligt for at undgå at fastholde et olielag i supernatanten og pelleten i røret. Disse to simple modifikationer drastisk forbedret inddrivelse, A260 / A280-forhold, og A260 / A230 forhold mellem det isolerede RNA fra frø på midten og sene faser af udvikling (tabel 1).
Vores metode, som repræsenterer en simpel modifikation af standard protokol, anvender kommercielt tilgængelige kits til RNA-isolation. Således er vores metode er praktisk til isolering højtrenset RNA fra frø uden behov for besværlige yderligere trin, såsom phenol-chloroformekstraktion og ethanolfældning ved hjælp lithiumchlorid. Vores metode er også effektiv til anvendelse med modne rapsfrø og sojabønnefrø (tabel 2), hvilket indikerer, at ændringerne fungerer godt for olie- og proteinrige afgrøde frø. De satser RNA nyttiggørelse fra 4 DAF frø (tabel 1) og unge rods, blade og stængler var lavere ved hjælp af vores metode, hvilket indikerer, at vores metode er ikke egnet til RNA isoleret fra væv, som er fattige i olie og proteiner. Derfor er fremgangsmåden fordelagtigt kun til isolering af RNA fra væv, som indeholder olie, proteiner og polyphenoler, såsom frø og frugter.
Samlet set vores metode er egnet til at erhverve højtrenset RNA fra plantefrø uden brug af phenol, chloroform, eller yderligere fremgangsmåder til RNA oprensning. Denne metode vil fremme en mere præcis profilering af genekspression i frø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takke personalet i Functional Genomics faciliteten og spektrografi og Bioimaging Facility, NIBB Core forskningsfaciliteter, og model Plant Research Facility, NIBB Bioressource Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
