Introduction
Planter produserer frø, som gir opphav til den neste generasjon. Frø akkumulere store mengder lagringsplass reserver, slik som oljer, karbohydrater og proteiner, for post-germinative vekst. Mennesker utnytte frø lagerbeholdningen som kilder til mat og fôr, og dermed plante frø er en av de største leverandørene av spiselig organisk materiale over hele verden. Økende frø avlinger er en viktig utfordring i plantevitenskap.
Siden frø lagerbeholdningen er kommersielt verdifulle kilder til mat og industrielle materialer, har de molekylære mekanismer som ligger til grunn for regulering av metabolismen av disse reservene blitt vidt undersøkt 1-6. Videre belyse disse mekanismene vil være nyttig for å øke frø avlinger i avlinger. Frø utvikle seg i plante eggstokkene etter befruktning, og de modnes gjennom en rekke utviklingsstadier 1,6,7. Videre forstå den molekylære mekanismen underliggende frø utvikling krever detaljert, Presise genekspresjonsprofiler fra en serie av utviklende frø som skal fremstilles. Imidlertid er store mengder av oljer, proteiner, karbohydrater og polyfenoler i plantefrø gjør det vanskelig å isolere høyt renset RNA, som utelukker nøyaktig profilering av genekspresjon.
Her introduseres en effektiv metode for RNA-isolering fra oljefrø som inneholder store mengder av oljer, proteiner og polyfenoler. Ved hjelp av denne metoden, vil forskerne kunne forberede høyt renset RNA. Slike RNA vil være nyttig for å overvåke transkripsjons endringer i viktige gener som kontrollerer metabolsk regulering av frø lagerbeholdningen i å utvikle og modne oljefrø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utvinning av Total RNA fra plantefrø
- Forbered buffer sett, spin kolonner, 1,5 og 2,0 ml polypropylen rør, og nukleasefritt 1,5 ml polypropylen rør.
- Tilsett 1% (w / v) molekylærbiologi karakter polyvinylpyrrolidon (heretter kalt PVP) til cellelyseringsbuffer for RNA-ekstraksjon og vortex kraftig. Inkuber i 20 minutter ved 25 ° C for å oppløses fullstendig. Etter 20 minutters inkubering, bland buffer forsiktig ved å snu røret opp ned for å hindre dannelse av bobler. Oppbevar ved romtemperatur (15-25 ° C) før bruk.
- Høst frukt fra vårskrinneblom planter og sted i 1,5 ml polypropylen rør på is. Plasser frukt på aluminiumsplater holdt ved 4 ° C og isolere frø fra fruktene under et stereomikroskop.
- Plasserer isolerte frøene (ca. 200 frø) i 1,5 ml polypropylenrør som er lagret i en aluminiumstativ på is og umiddelbart plassere rørene i flytende nitrogen.
- Fjerne rørene fra den flytende nitrogen og returnere dem til aluminium stativet på is. Tilsett 100 ul av bufferen inneholdende 1% PVP og sentrifuger i 1 min ved 1000 xg ved 4 ° C.
- Homogen prøven med en rustfritt stål stampe ved hjelp av en motor-jeksel i 60 s mens du holder røret i aluminiumstativet på is.
- Legg 550 mL av bufferen inneholdende 1% PVP, bland buffer forsiktig ved å snu røret opp ned, og inkuber i 10 min ved 25 ° C.
- Sentrifuger i 5 minutter ved 8000 xg ved 25 ° C og overføre 550 ul av supernatanten til et nytt 1,5 ml polypropylenrør.
- Sentrifuger i 5 minutter ved 10.000 xg ved 25 ° C og overføre 450 ul av supernatanten til et nytt 1,5 ml polypropylenrør.
- Bruk av supernatanten som cellelysatet for RNA-ekstraksjon. Heretter følger du fremgangsmåten som er beskrevet i produsentens instruksjoner i den kommersielt tilgjengelige kit.
- eluerRNA ved hjelp av et minimumsvolum av elueringsbuffer for å sikre en tilstrekkelig høy konsentrasjon av RNA for å overvåke uttrykk mønstre på lavt nivå transkripter. Oppbevar RNA i en dypfryser inntil bruk.
2. Verifikasjon av RNA Kvalitet
- Tine total RNA, bland ved forsiktig tapping, og plassere røret i en aluminiumsstativ på is.
- Mål RNA konsentrasjon, A260 / A280-forhold, og A260 / A230-forhold ved hjelp av en microvolume spektrofotometer.
- Fortynn den totale RNA i RNase-fritt vann til en sluttkonsentrasjon på 70 ng / ul.
3. Revers transkripsjon av Total RNA fra frø
- Tine den totale RNA og buffersett fra kommersielt sett. Hold enzymer fra settet på is etter milde tapping. Forbered nukleasefritt 0,2 ml polypropylen rør.
- Tilsett 5 mL av total RNA, 1 pl Oligo dT-primer (50 uM), og 1 pM av Random 6-mer (50 uM) til 0,2 ml polypropylene tube på is.
- Inkuber i 15 minutter ved 37 ºC og legg på is.
- Heretter følger du fremgangsmåten som er beskrevet i produsentens instruksjoner i revers transkripsjon-PCR kit.
- Plasser reverse transkripsjonsprodukter på is før bruk.
4. Kvantitativ Real-time PCR-analyse
- Konstruer plasmider skjuler de mål gensekvenser som bruker produsentens protokoll.
- Juster konsentrasjonene til 100-500,000 kopier / mL for DNA-maler for standardkurvene.
- Fortynn cDNA-løsninger (1: 100) med destillert vann.
- Tilsett 2 mL av de fortynnede cDNA løsninger og plasmidene for standardkurver til master mix fra kvantitativ real-time PCR kit.
- Sett opp real-time PCR ved anvendelse av følgende betingelser: sykling 95 ° C i 30 sek og deretter 40 sykluser ved 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 35 sek.
- Analyser kopiantall i henhold til mannenprodusentens instruksjoner for real-time PCR system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi først undersøkte den optimale konsentrasjonen av PVP bruker Arabidopsis modne frø. Totalt RNA ble isolert fra omtrent 1000 frø i henhold til den protokoll som er beskrevet ovenfor under anvendelse av cellelyseringsbuffer som inneholdt 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% eller 2,0% PVP. Etter homogenisering og sentrifugering, ble supernatanten samlet opp og samtidig unngå oljelaget og frø rester (figur 1A).
Figur 1: Beregning av optimal polyvinylpyrrolidon konsentrasjonen i cellelyseringsbuffer. Total RNA ble ekstrahert med cellelyseringsbuffer inneholdende forskjellige konsentrasjoner av PVP. (A) Et fotografi av frøene etter homogenisering og sentrifugering. (B) De grafiske fremstillinger av absorbans bølgelengde for hver prøve er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Mengdene og renhet av det isolerte RNA ble beregnet fra kurven til absorptansen bølgelengde (figur 1B), som viste at 1,0% PVP var den mest effektive konsentrasjon for isolering av store mengder av renset RNA fra frø.
Utvikling av frø ble isolert fra Arabidopsis thaliana frukt på pre-kjølte aluminiumsplater på is under et stereomikroskop (figurene 2A, 2B). Frøene ble homogenisert med en rustfritt stål støter og motor-jeksel i et rør på en aluminiumsstativ på is (Tall 2C, 2D).
2.jpg "/>
Figur 2: Isolering og homogenisering for å utvikle frø av Arabidopsis thaliana. Utvikling av frø er isolert fra frukt på en kald aluminiumplate under et stereomikroskop (A). Carpels blir skrellet fra stilken (B), og utvikle frø er oppsamlet. Frøene ble homogenisert i lyseringsbuffer inneholdende 1% (vekt / volum) polyvinylpyrrolidon ved hjelp av en rustfri stål stampe (C) i rør i en aluminiumstativ avkjølt på is (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Total RNA ble isolert fra frøene ved 4, 8 og 12 dager etter blomstring (heretter referert til som DAF) ved hjelp av vår nylig utviklet metode eller den konvensjonelle metoden. Konsentrasjonene, A260 / A280-forhold, og A260 /A230-forhold på RNA isolert fra 200 frø er vist i tabell 1.
| Metode | DAF | RNA konsentrasjon | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Konvensjonell | 4 | 72,4 ± 7,4 | 1,90 ± 0,02 | 2,27 ± 0,06 |
| 8 | 10,8 ± 3,0 | 1,50 ± 0,08 | 1,40 ± 0,17 | |
| 12 | 4.9 ± 1.7 | 1,57 ± 0,10 | 0,76 ± 0,18 | |
| Ny | 4 | 63,7 ± 2,6 | 2,10 ± 0,08 | 2,29 ± 0,03 |
| 8 | 46,3 ± 4,9 | 2,15 ± 0,05 | 2,23 ± 0,09 | |
| 12 | 41.77; 3.1 | 2,09 ± 0,04 | 2,17 ± 0,07 |
Tabell 1: Konsentrasjon, A260 / A280-forhold, og A260 / A230 prosenter av RNA isolert fra Arabidopsis frø. Totalt RNA ble isolert fra omtrent 200 frø (fra 190 til 206 frø) ved 4, 8 og 12 DAF ved hjelp av den konvensjonelle metode eller vår nylig utviklet metode. RNA-konsentrasjoner, A260 / A280-forhold, og A260 / A230 forhold ble målt. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.
Resultatene viser at vår metode gjorde oss i stand til å isolere svært renset RNA fra 8 og 12 DAF frø. Det totale RNA ble revers-transkribert til cDNA, og cDNA-løsningene ble fortynnet 100 ganger. Kopi antall WRI1 (rynket 1: AT3G54320), SDP1 (SUGAR DEPENDENT1: AT5G04040) 7 </ sup>, og EIF3K (eukaryote translasjonsinitieringssete faktor 3K: AT4G33250) som en intern kontroll 8 ble målt, og de relative mengder av de transkriptene ble estimert ved kvantitativ real-time PCR-analyser (figur 3).
Figur 3: Kvantifisering av lavt nivå transkripsjoner i utviklings frø. Total RNA ble ekstrahert fra 4, 8 og 12 DAF frøene ved hjelp av vår metode, og cDNA ble fremstilt. De relative mengder av WRI1 (A) og (B) SDP1 transkripter ble målt ved hjelp av kvantitativ real-time PCR. EIF3K ble anvendt som en intern kontroll. Verdier representerer betyr SD av tre uavhengige forsøk. DAF; dager etter blomstring. Klikk hanre for å se en større versjon av dette tallet.
Selv om mengder WRI1 og SDP1 transkripsjoner er relativt lav i utviklings frø, var det mulig å påvise uttrykk endringer mellom frøene på ulike utviklingsstadier. For å bekrefte at vår metode kan benyttes i andre oljefrø, ble totalt RNA isolert fra modne frø av Brassica napus og Glycine max. RNA-konsentrasjonen, A260 / A280-forhold, og A260 / A230-forhold er vist i tabell 2.
| Metode | Plante | RNA konsentrasjon | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Konvensjonell | B. napus | 7.7 ± 0.8 | 1.5 ± 0.12 | 0,75 ± 0,11 |
| G. max | 1,61 ± 0,06 | 0,69 ± 0,09 | ||
| Ny | B. napus | 143,2 ± 19,0 | 2,17 ± 0,03 | 2,23 ± 0,13 |
| G. max | 152,3 ± 4,4 | 2,17 ± 0,02 | 2,30 ± 0,02 |
Tabell 2: Konsentrasjoner, A260 / A280-forhold, og A260 / A230 prosenter av RNA isolert fra modne frø av Brassica napus og Glycine max. Totalt RNA ble isolert fra omtrent 100 mg av Brassica napus Glycine max og frø ved hjelp av den konvensjonelle metode eller vår nylig utviklet metode. Frøene tidligere var knust og grovt homogenisert med en morter og pistill kjølt i flytende nitrogen. Den RNA-konsentrasjoner, A260 / A280 forholdstall og A260 / A230 forhold ble målt. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genuttrykk profiler bidra til vår forståelse av plantefysiologi; derfor har bestemt RNA isolasjon metoder er utviklet for hver prøve tilstand 9-12. Vi undersøkte de prosessene som ble hemmet under RNA isolert fra frø og fant at RNA binding til silika membraner var sterkt hemmet. Store mengder olje, proteiner og polyfenoler hemme RNA isolering. Vi modifisert RNA ekstraksjon prosessen for å fjerne disse forbindelser med en lyseringsoppløsning før prosessen med binding til RNA silika membraner. De viktige modifikasjoner inkludert tilsetning av 1% PVP (trinn 1.2) og samling av supernatanten fra sentrifugert lysis oppløsning (trinn 1.7, 1.8). Formålet med tilsetning av 1% PVP er å fjerne polyfenoler. Vi har undersøkt den mest effektive konsentrasjon av PVP til bruk, og bekreftet at 1% PVP er den mest effektive konsentrasjon for denne prosessen. Målet med å samle supernatanten fra sentrifugeres lysis løsninger å fjerne olje og proteiner. Supernatanten samles opp forsiktig for å unngå å beholde et oljelag i supernatanten og pelleten i røret. Disse to enkle modifikasjoner drastisk forbedret utvinning, A260 / A280-forhold, og A260 / A230 prosenter av den isolerte RNA fra frø på midten og slutten faser av utvikling (tabell 1).
Vår metode, hvilket representerer en enkel modifikasjon av standard protokoll benytter kommersielt tilgjengelige sett for RNA-isolering. Således er vår metode praktisk for å isolere høyt renset RNA fra frø, uten behov for tunge tilleggstrinn som fenol-kloroform ekstraksjon og etanol utfelling ved hjelp av litium-klorid. Vår fremgangsmåte er også effektiv for bruk sammen med moden raps og soyabønner frø (tabell 2), noe som indikerer at modifikasjonene fungerer godt for olje- og proteinrik Planter. De RNA utvinningsgraden fra 4 DAF frø (Tabell 1) og ung rots, blader og stengler var lavere ved bruk av vår metode, noe som indikerer at vår fremgangsmåte er ikke egnet for RNA isolering fra vev som er fattig på olje og proteiner. Derfor er fremgangsmåten fordelaktig bare for isolering av RNA fra vev som inneholder olje, proteiner, og polyfenoler, slik som frø og frukter.
Samlet er vår metode egnet for å skaffe sterkt renset RNA fra plantefrø uten bruk av fenol, kloroform eller flere fremgangsmåter for RNA rensing. Denne metoden vil bidra til mer presis profilering av genuttrykk i frø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker de ansatte for funksjonell genom Facility og spektrografi og Bioimaging Facility, NIBB kjerneforskningsfasiliteter, og Model Plant Research Facility, NIBB Bioresource Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
