Introduction
النباتات تنتج البذور، والتي تؤدي إلى الجيل التالي. بذور تتراكم كميات كبيرة من احتياطيات تخزين، مثل الزيوت والكربوهيدرات، والبروتينات، للنمو بعد منتش. البشر الاستفادة من احتياطيات تخزين البذور كمصدر للتغذية الأغذية والأعلاف الحيوانية، وبالتالي بذور النباتات هي واحدة من الموردين الرئيسيين للمواد العضوية الصالحة للأكل في جميع أنحاء العالم. زيادة محصول البذور يشكل تحديا هاما في علم النبات.
منذ احتياطيات تخزين البذور هي مصادر ذات قيمة تجارية عالية من المواد الغذائية والمواد الصناعية، الآليات الجزيئية الكامنة وراء تنظيم عملية الأيض هذه الاحتياطيات تم التحقيق على نطاق واسع 1-6. وعلاوة على ذلك توضيح هذه الآليات يكون مفيدا لزيادة محصول البذور للمحاصيل. بذور تطور في المبايض المصنع بعد الإخصاب، وتنضج من خلال سلسلة من المراحل التنموية 1،6،7. فهم كذلك تطوير الآلية الجزيئية البذور الكامنة يتطلب تفصيلاودقيقة ملامح التعبير الجيني من سلسلة تطوير البذور التي يتم إنتاجها. ومع ذلك، فإن كميات كبيرة من الزيوت والبروتينات، والكربوهيدرات، ومادة البوليفينول في بذور النباتات تجعل من الصعب عزل الحمض النووي الريبي عالي النقاء، والذي يحول دون التنميط دقيقة في التعبير الجيني.
هنا، ونحن نقدم وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي من البذور الزيتية التي تحتوي على كميات كبيرة من الزيوت والبروتينات ومادة البوليفينول. باستخدام هذه الطريقة، وسوف يقوم الباحثون أن يكون قادرا على إعداد RNA عالي النقاء. وهذا RNA يكون مفيدا لرصد التغيرات النسخي في الجينات الرئيسية السيطرة على تنظيم التمثيل الغذائي للاحتياطيات تخزين البذور في البلدان النامية والبذور الزيتية ناضجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من بذور النباتات
- إعداد مجموعات العازلة، أعمدة الدوران، 1.5 و 2.0 أنابيب البولي بروبلين مل، وأنابيب البولي بروبلين 1.5 مل nuclease خالية.
- إضافة 1٪ (ث / ت) البيولوجيا الجزيئية الصف بوفيدون (يشار إليها فيما PVP) إلى الخلية تحلل العازلة لاستخراج الحمض النووي الريبي ودوامة بقوة. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية إلى حل تماما. بعد 20 دقيقة الحضانة، مزيج المخزن المؤقت بلطف من خلال تحويل أنبوب رأسا على عقب لمنع تشكيل فقاعات. تخزين في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) قبل الاستخدام.
- ثمار الحصاد من النباتات thaliana نبات الأرابيدوبسيس ومكان في 1.5 مل أنابيب البولي بروبلين على الجليد. أبقى مكان الفواكه على لوحات الألومنيوم في 4 درجات مئوية، وعزل البذور من ثمار تحت المجهر ستيريو.
- وضع بذور معزولة (حوالي 200 البذور) إلى 1.5 مل أنابيب البولي بروبلين التي تم تخزينها في حامل الألومنيوم على الجليد وعلى الفور وضع الأنابيب في ن السائلitrogen.
- إزالة الأنابيب من النيتروجين السائل وإعادتها إلى الرف الألومنيوم على الجليد. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على 1٪ PVP وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية.
- تجانس العينة مع مدقة الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام طاحونة المحرك لمدة 60 ثانية مع الحفاظ على أنبوب في رف الألومنيوم على الجليد.
- إضافة 550 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على 1٪ PVP، ومزيج المخزن المؤقت بلطف من خلال تحويل أنبوب رأسا على عقب، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 8000 x ج عند 25 درجة مئوية، ونقل 550 ميكرولتر من طاف لأنبوب 1.5 الجديد البولي بروبلين مل.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10000 x ج عند 25 درجة مئوية، ونقل 450 ميكرولتر من طاف لأنبوب 1.5 الجديد البولي بروبلين مل.
- استخدام طاف مثل المحللة خلية لاستخراج الحمض النووي الريبي. الآخرة، اتبع الإجراء هو موضح في إرشادات الشركة المصنعة في عدة متاحة تجاريا.
- أزلRNA باستخدام حجم الحد الأدنى من شطف العازلة لضمان تركيز عال بما فيه الكفاية من الحمض النووي الريبي لرصد أنماط التعبير النصوص مستوى منخفض. تخزين الحمض النووي الريبي في التجميد العميق حتى استخدامها.
2. التأكيد من الحمض النووي الريبي الجودة
- ذوبان الجليد في الحمض النووي الريبي مجموع، ومزيج من خلال استغلال طيف، ووضع أنبوب في رف الألومنيوم على الجليد.
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي، ونسبة A260 / A280، ونسبة A260 / A230 باستخدام معمل microvolume.
- تخفيف الحمض النووي الريبي مجموع في المياه خالية من ريبونوكلياز إلى تركيز النهائي من 70 نانوغرام / ميكرولتر.
3. النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي مجموع من بذور
- ذوبان الجليد مجموع RNA وعازلة مجموعات من عدة التجارية. الحفاظ على الانزيمات من هذه المجموعة على الجليد بعد التنصت لطيف. إعداد أنابيب 0.2 مل البولي بروبلين nuclease خالية.
- إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مجموع، 1 ميكرولتر من جزئية DT التمهيدي (50 ميكرون)، و 1 ميكرومتر من عشوائية 6 مير (50 ميكرومتر) إلى مل polypropy 0.2أنبوب لين على الجليد.
- احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ومكان على الجليد.
- الآخرة، اتبع الإجراء هو موضح في إرشادات الشركة المصنعة في عكس عدة نسخ-PCR.
- وضع منتجات النسخ العكسي على الجليد قبل الاستخدام.
4. في الوقت الحقيقي تحليل PCR الكمي
- بناء البلازميدات إيواء تسلسل الجين المستهدف باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
- ضبط تركيزات إلى 100-500،000 نسخ / ميكرولتر لقوالب الحمض النووي للالمنحنيات القياسية.
- تمييع الحلول كدنا] (1: 100) مع الماء المقطر.
- إضافة 2 ميكرولتر من الحلول كدنا] المخففة والبلازميدات لمنحنيات القياسية لمزيج الرئيسي من الوقت الحقيقي عدة PCR الكمي.
- إعداد الوقت الحقيقي PCR باستخدام الشروط التالية الدراجات: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ثم 40 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 35 ثانية.
- تحليل الأرقام نسخة وفقا للرجلتعليمات ufacturer لنظام PCR الوقت الحقيقي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
علينا أولا التحقيق في تركيز الأمثل لحماية الأصناف النباتية باستخدام نبات الأرابيدوبسيس البذور الناضجة. تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من حوالي 1،000 البذور وفقا لبروتوكول المذكورة أعلاه باستخدام عازلة خلية تحلل تحتوي على 0٪، 0.25٪، 0.5٪، 1.0٪ أو 2.0٪ PVP. بعد التجانس والطرد المركزي، تم جمع طاف مع تجنب طبقة النفط والحطام البذور (الشكل 1A).
الشكل 1: تقدير تركيز بوفيدون الأمثل في المخزن المؤقت خلية تحلل. تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع مع العازلة خلية تحلل تحتوي على تركيزات مختلفة من حماية الأصناف النباتية. (أ) صورة من البذور بعد التجانس والطرد المركزي. (ب) ويشار إلى الرسوم البيانية لإمتصاص الطول الموجي لكل عينة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقدرت كميات ونقاء الرنا المعزولة من الرسم البياني لإمتصاص الطول الموجي (الشكل 1B)، والتي أظهرت أن 1.0٪ PVP كان تركيز الأكثر فعالية لعزل كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي تنقيته من البذور.
تم عزل البذور النامية من ثمار نبات الأرابيدوبسيس thaliana على لوحات الألومنيوم قبل المبردة على الجليد تحت (2A الأرقام، 2B) مجهر تشريحي. والمتجانس للبذور مع مدقة الفولاذ المقاوم للصدأ ومحرك طاحونة في أنبوب على الرف الألومنيوم على الجليد (أرقام 2C، 2D).
2.JPG "/>
الشكل 2: عزل والتجانس تطوير بذور thaliana نبات الأرابيدوبسيس. يتم عزل البذور النامية من الفواكه على طبق من الألومنيوم الباردة تحت مجهر تشريحي (A). ومقشر الكرابل من عنيق (B)، ويتم جمع البذور النامية. والمتجانس للبذور في تحلل العازلة التي تحتوي على 1٪ (ث / ت) بوفيدون باستخدام مدقة الفولاذ المقاوم للصدأ (C) في أنابيب في رف الألومنيوم المبرد على الجليد (D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من البذور في 4 و 8 و 12 يوما بعد المزهرة (يشار إليها فيما DAF) باستخدام طريقة لدينا وضعت حديثا أو للطريقة التقليدية. تركيزات، ونسب A260 / A280، A260 و /وتظهر نسب A230 من الحمض النووي الريبي معزولة عن 200 البذور في الجدول 1.
| طريقة | DAF | تركيز الحمض النووي الريبي | A260 / A280 | A260 / A230 |
| تقليدي | 4 | 72.4 ± 7.4 | 1.90 ± 0.02 | 2.27 ± 0.06 |
| 8 | 10.8 ± 3.0 | 1.50 ± 0.08 | 1.40 ± 0.17 | |
| 12 | 4.9 ± 1.7 | 1.57 ± 0.10 | 0.76 ± 0.18 | |
| جديد | 4 | 63.7 ± 2.6 | 2.10 ± 0.08 | 2.29 ± 0.03 |
| 8 | 46.3 ± 4.9 | 2.15 ± 0.05 | 2.23 ± 0.09 | |
| 12 | 41.77؛ 3.1 | 2.09 ± 0.04 | 2.17 ± 0.07 |
الجدول 1: التركيزات، نسب A260 / A280، A260 و / A230 نسب من الحمض النووي الريبي معزولة عن بذور نبات الأرابيدوبسيس. تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من حوالي 200 البذور (190-206 البذور) في 4 و 8 و 12 DAF باستخدام الطريقة التقليدية أو طريقة لدينا وضعت حديثا. تم قياس تركيز الحمض النووي الريبي، ونسب A260 / A280، ونسب A260 / A230. وتمثل القيم SD ± متوسط لثلاث تجارب مستقلة.
وأظهرت النتائج أن أسلوبنا مكنتنا من عزل الحمض النووي الريبي عالي النقاء من 8 و 12 بذور DAF. تم نسخه العكسية الحمض النووي الريبي مجموع كدنا]، وكانت مخففة الحلول كدنا] 100 أضعاف. الأرقام نسخة من WRI1 (التجاعيد 1: AT3G54320)، SDP1 (سكر DEPENDENT1: AT5G04040) 7 <قيست الرقابة الداخلية 8، وقدرت المبالغ النسبية للنصوص التي كتبها الكمي في الوقت الحقيقي تحليل PCR (الشكل 3): / سوب>، وEIF3K (AT4G33250 ترجمة حقيقية النواة عامل بدء 3K).
الشكل (3): الكمي النصوص مستوى منخفض في البذور النامية. تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من 4، 8، و 12 بذور DAF باستخدام طريقة لدينا، وأعدت حلول كدنا]. تم قياس الكميات النسبية للWRI1 (A) وSDP1 (ب) النصوص التي كتبها الكمي في الوقت الحقيقي PCR. وقد استخدم EIF3K باعتبارها الرقابة الداخلية. وتمثل القيم يعني SD من ثلاث تجارب مستقلة. DAF. يوما بعد المزهرة. الرجاء الضغط هوإعادة لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
على الرغم من أن كميات من WRI1 وSDP1 النصوص منخفضة نسبيا في البذور النامية، كان من الممكن للكشف عن تغيرات التعبير بين البذور في مراحل النمو المختلفة. للتحقق من أن لدينا وسيلة يمكن استخدامها في البذور الزيتية الأخرى، تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من البذور الناضجة من الكرنب napus وجليكاين ماكس. ويبين تركيز الحمض النووي الريبي، ونسب A260 / A280، ونسب A260 / A230 في الجدول 2.
| طريقة | نبات | تركيز الحمض النووي الريبي | A260 / A280 | A260 / A230 |
| تقليدي | B. napus | 7.7 ± 0.8 | 1.5 ± 0.12 | 0.75 ± 0.11 |
| G. ماكس | 1.61 ± 0.06 | 0.69 ± 0.09 | ||
| جديد | B. napus | 143.2 ± 19.0 | 2.17 ± 0.03 | 2.23 ± 0.13 |
| G. ماكس | 152.3 ± 4.4 | 2.17 ± 0.02 | 2.30 ± 0.02 |
الجدول 2: تركيزات، ونسب A260 / A280، A260 و / A230 نسب من الحمض النووي الريبي معزولة من البذور الناضجة من الكرنب napus وجليكاين ماكس. تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من حوالي 100 ملغ من الكرنب napus وجليكاين البذور ماكس باستخدام الطريقة التقليدية أو طريقة لدينا وضعت حديثا. كانت بذور سحقت من قبل ومتجانسة تقريبا مع هاون ومدقة المبردة في النيتروجين السائل. تركيزات RNA، A260 / Aتم قياس 280 النسب، والنسب A260 / A230. وتمثل القيم SD ± متوسط لثلاث تجارب مستقلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تساهم ملامح التعبير الجيني في فهمنا لفسيولوجيا النبات. لذا، وضعت أساليب عزل الحمض النووي الريبي محددة لكل حالة عينة 9-12. نحن التحقيق في العمليات التي تحول دون خلال عزل الحمض النووي الريبي من البذور وجدت أن الحمض النووي الريبي ملزمة لأغشية السيليكا كانت تحول دون بشدة. كميات كبيرة من النفط، والبروتينات، والبوليفينول تمنع عزل الحمض النووي الريبي. نحن تعديل عملية استخراج الحمض النووي الريبي لإزالة هذه المركبات مع حل تحلل قبل عملية من الحمض النووي الريبي ملزمة لأغشية السيليكا. وتضمنت التعديلات الهامة إضافة 1٪ PVP (الخطوة 1.2) وجمع من طاف من حل تحلل طرد (الخطوات 1.7، 1.8). الهدف من إضافة 1٪ PVP هو إزالة مادة البوليفينول. درسنا تركيز الأكثر فعالية لحماية الأصناف النباتية لاستخدام وأكد أن 1٪ PVP هو تركيز الأكثر فعالية لهذه العملية. والهدف من جمع طاف من حل تحلل طردهو إزالة الزيت والبروتينات. طاف ينبغي جمع بعناية لتجنب الاحتفاظ طبقة النفط في وطاف بيليه في الأنبوب. هذان تعديلات بسيطة تحسنت بشكل كبير من الانتعاش، ونسب A260 / A280، ونسب A260 / A230 من الحمض النووي الريبي معزولة من البذور في الوسط والمراحل المتأخرة من تطوير (الجدول 1).
طريقة لدينا، وهو ما يمثل تعديل بسيط للبروتوكول قياسي يستخدم مجموعات المتاحة تجاريا لعزل الحمض النووي الريبي. وهكذا، أسلوبنا هو عملي لعزل الحمض النووي الريبي عالي النقاء من البذور دون الحاجة إلى اتخاذ خطوات إضافية مرهقة مثل استخراج الفينول كلوروفورم وهطول الأمطار الإيثانول باستخدام كلوريد الليثيوم. لدينا وسيلة فعالة أيضا للاستخدام مع اللفت ناضجة وبذور فول الصويا (الجدول 2)، مشيرا إلى أن التعديلات تعمل بشكل جيد لبذور المحاصيل للنفط والغنية بالبروتين. معدلات الاسترداد الحمض النووي الريبي من 4 بذور DAF (الجدول 1) والجذر الشبابكانت الصورة والأوراق والسيقان أقل باستخدام طريقة لدينا، مشيرا إلى أن لدينا وسيلة غير مناسبة لعزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة التي هي فقيرة في النفط والبروتينات. وبالتالي، فإن هذه الطريقة مفيدة فقط لعزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة التي تحتوي على زيت والبروتينات ومادة البوليفينول، مثل البذور والثمار.
عموما، لدينا وسيلة مناسبة للحصول على الحمض النووي الريبي عالي النقاء من بذور النباتات دون استخدام الفينول، والكلوروفورم، أو عمليات إضافية لتنقية الحمض النووي الريبي. وهذه الطريقة سوف تسهل التنميط أكثر دقة في التعبير الجيني في البذور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر موظفي مرفق الجينوم وظيفية والتصوير الطيفي وBioimaging مرفق، NIBB مرافق البحوث الأساسية، ومرفق نموذج بحوث النباتية، NIBB مركز Bioresource.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
