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Genetics

El uso de un TMEM184A GFP-etiquetados Constructo para la Confirmación de heparina receptor de Identidad

doi: 10.3791/55053 Published: February 17, 2017

Summary

A TMEM184A construcción que codifica con una etiqueta GFP en el extremo carboxi-terminal diseñado para la expresión eucariótica, se empleó en ensayos diseñados para confirmar la identificación de TMEM184A como un receptor de heparina en las células vasculares.

Abstract

Cuando nuevas proteínas se identifican mediante el aislamiento y la bioinformática análisis basado en afinidad, que a menudo son en gran parte no caracterizado. Los anticuerpos contra péptidos específicos dentro de la secuencia predicha permiten algunos experimentos de localización. Sin embargo, otras posibles interacciones con los anticuerpos a menudo no pueden ser excluidas. Esta situación proporciona una oportunidad para desarrollar un conjunto de ensayos que dependen de la secuencia de la proteína. Específicamente, se obtuvo un constructo que contiene la secuencia del gen acoplado a la secuencia que codifica GFP en el extremo C-terminal de la proteína y emplea para estos fines. Los experimentos para caracterizar la localización, la afinidad del ligando, y la ganancia de la función se diseñaron y llevaron a cabo para confirmar la identificación de TMEM184A como un receptor de heparina 1 en un principio. Además, el constructo se puede emplear para estudios relacionados con preguntas topología de la membrana y de las interacciones proteína-ligando detalladas. El presente informe se presenta arange de protocolos experimentales basados ​​en el constructo GFP-TMEM184A expresado en las células vasculares que podrían ser fácilmente adaptado para otras proteínas novedosas.

Introduction

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Identificación de proteínas candidatas para nuevas funciones a menudo depende de protocolos de aislamiento basados ​​en afinidad seguido por determinación de la secuencia parcial. Ejemplos recientes de proteínas recientemente identificados incluyen la proteína transmembrana 184A (TMEM184A), un receptor de heparina identificado después de interacciones de afinidad de heparina 1, y TgPH1, una proteína de dominio de homología pleckstrin que se une PI phosphoinositide (3,5) P 2 2. Otros novela identificación de proteínas implica el análisis de secuencia directa de péptidos como la que por Vit, et al. que se utiliza para identificar péptidos transmembrana productos proteicos de genes previamente caracterizados 3. Del mismo modo, la identificación de nuevas secuencias de proteínas se puede lograr usando la bioinformática en busca de familias de proteínas previamente caracterizadas, como la identificación de nuevas proteínas 4TM 4. El examen de las secuencias de genes de la familia de acuaporina tiene alasí producido la identificación de nuevos miembros con nuevas funciones 5. Después de la identificación, el análisis de la función de proteínas es típicamente un siguiente paso, que a veces puede ser examinada usando un ensayo específico de la función de proteínas, tales como en el caso de acuaporina.

Cuando sea posible, la función de una proteína recientemente identificada puede ser examinado con enzimático específico o ensayos de la función similares in vitro. Debido a que muchas funciones de nuevas proteínas dependen de interacciones complejas que ocurren sólo en las células intactas o los organismos, en ensayos in vitro no siempre son eficaces. Sin embargo, los ensayos in vivo deben ser diseñados de tal manera que dependen de la secuencia del gen. En el cultivo de células y / o organismos modelo simples, desmontables puede aportar elementos de prueba para la identificación de proteínas / función 6. Con nuevas proteínas identificadas como se señaló anteriormente, a menudo es insuficiente para simplemente derribar una proteína para confirmar la función, unad el diseño de ensayos funcionales in vivo que dependen de la secuencia del gen se convierte en importante para la caracterización de nuevas proteínas.

La reciente identificación de TMEM184A como un receptor de heparina (que modula la proliferación en el músculo liso vascular y las respuestas inflamatorias en las células endoteliales) utilizando cromatografía de afinidad y MALDI MS 1, 7 proporcionan una oportunidad para desarrollar una colección de ensayos después de caída produjeron resultados coherentes con la identificación . Una revisión reciente confirmó que la heparina interactúa específicamente con muchos factores de crecimiento, sus receptores, componentes de matriz extracelular, receptores de adhesión celular, y otras proteínas 8. En el sistema vascular, la heparina y proteoglicanos heparán sulfato (que contiene cadenas de heparán sulfato similares en estructura a la heparina) interactuar con varios cientos de proteínas 9. Para confirmar funcionalmente that TMEM184A estaba involucrado con la absorción de la heparina y vinculante, se han desarrollado técnicas que emplean para la construcción del gen TMEM184A. El presente informe incluye una colección de ensayos basados ​​en un GFP-TMEM184A construir para su uso en la confirmación de la identidad de TMEM184A como un receptor de heparina.

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Protocol

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1. Diseño de una construcción GFP-proteína

  1. Compra, o el diseño y la construcción, una construcción GFP-etiquetado basado en la proteína en cuestión.
    NOTA: Para obtener una construcción de comprar, los vectores estándar están disponibles en los laboratorios comerciales que incluyen algunas o todas de las siguientes sugerencias: Para una proteína de membrana, seleccione una ubicación C-terminal de la GFP debido a que es menos probable que interfiera con el tráfico de proteínas de membrana. Considere la posibilidad de una extensión entre el gen de interés y la GFP si hay razón para creer que el C-terminal de la proteína en cuestión se pliega de forma compacta en un dominio de la proteína. Seleccione el constructo de expresión general de células eucariotas, pero permitir construir la producción en sistemas bacterianos. Incluir un sitio de escisión (tal como para la proteasa TEV) por la que GFP puede eliminarse si se desea para algunos experimentos en los que la GFP podría interferir con la actividad de la proteína. Añadir otros insertos tal como una etiqueta adicional para la localización o afinidad eninteracciones (por ejemplo, His6). Este no era necesario para los ensayos descritas en este documento, pero podría facilitar otros ensayos, o ser útil directamente adyacente al gen, antes de la GFP, Si se desea la eliminación de GFP.

2. Expresión de GFP-TMEM184A en las células vasculares

  1. Endotelial Cultura o células musculares lisas vasculares en 0,2% de gelatina recubierta placas de cultivo de tejido como se informó anteriormente 1, 6, 7.
  2. Añadir 5 solución de cultivo celular tripsina ml (0,5% w / v) a un enjuagado 100 mm, o más grande, plato confluente de células. Incubar a 37 ° C hasta que las células se acaba de salir de la placa, y transferir las células a un tubo de centrífuga de polipropileno estéril.
  3. Añadir un inhibidor de tripsina (por ejemplo, un volumen igual de medio de cultivo regular), como se usa en el cultivo de rutina, a la solución de células / tripsina para limitar la actividad de la tripsina. Sedimentar las células durante 5 min a aproximtamente 600 xg (o la velocidad adecuada y tiempo para simplemente sedimentar las células de cultivo de tejidos estándar). Aspirar el sobrenadante.
  4. Resuspender las células en 1 ml de tampón de electroporación (tamponada con Hepes Saline) HeBS, lo que limita la cantidad de células de tiempo son en el sedimento o suspensión. Coloque la suspensión de células en hielo y llevar a cabo los pasos restantes en el hielo.
    NOTA: Pellet se puede lavar una vez con HeBS antes de la resuspensión.
  5. Añadir un volumen suficiente de plásmido TMEM184A GFP-etiquetado a las células para conseguir una concentración final de ADN 20 mg / ml. Utilizar un protocolo idéntico para una construcción GFP.
  6. Coloque aproximadamente 0,4 ml de la solución de células en HeBS en una cubeta de electroporación. Pre-enfriar las cubetas antes de su uso.
  7. Electroporar las células usando las siguientes condiciones: Exponential Decay, 500 mF, ∞ ohmios, y 170 V.
    NOTA: El voltaje para un tipo de célula dado debe ser optimizado. Los estudios preliminares con endoteliales y de músculo liso celtipos l se llevaron a cabo con una construcción de GFP-vinculina para determinar el valor de tensión óptimo observado aquí, por ejemplo 10.
    1. Para optimizar la electroporación, comenzar con las recomendaciones del fabricante del equipo (que incluyen las condiciones de algunos tipos de células normales). Utilice la construcción deseada o una proteína fluorescente de control de construcción similar en tamaño y las características fluorescentes de la construcción deseada.
      NOTA: Pequeño ácidos nucleicos parecen entrar en las células más fácilmente que las construcciones más grandes, por lo que un constructo con sólo una proteína fluorescente pueden ser más fáciles de expresar que uno más grande.
    2. Utilice microscopía de fluorescencia para determinar la viabilidad celular, el porcentaje de células en las que se expresa el constructo fluorescente después de 24 y 48 h, y la intensidad de expresión.
      NOTA: Disminución de la tensión y / o tiempo ligeramente si la supervivencia es baja. Objetivo para el menor tiempo posible entre la liberación de las células de la superficie de cultivo y volviendocélulas a la cultura para aumentar la supervivencia. un ligero aumento en el tiempo o un segundo impulso puede mejorar la absorción de construcción si la supervivencia es alta y la expresión es baja. Las condiciones óptimas y la expresión variarán entre los tipos de células. Si el porcentaje de células que expresan el constructo es alta, pero la intensidad es baja, el aumento de la concentración de ADN y el seguimiento de las células transfectadas con el tiempo de la intensidad óptima, que variará en función de proteínas de vida media así como la expresión, puede mejorar la intensidad. intensidad de la tinción se puede ampliar para algunos ensayos, en caso necesario, por la tinción de inmunofluorescencia de GFP con anticuerpos anti-GFP
  8. Después de la electroporación, sembrar las células en seis pocillos de cultivo de tejidos de 30 mm con cubreobjetos para formación de imágenes o en placas de cultivo de tejidos. Cultivar las células utilizando procedimientos estándar de cultivo celular.
  9. Opcional: Cambie el medio de cultivo después de 24 h para eliminar cualquier tampón de electroporación HeBS.

3. Visualización de GFP-TMEMLa localización 184A

  1. Enjuagar las células con PBS y agitación suave después de cultivar durante al menos 24 h. Limitar la exposición a la luz brillante para evitar la decoloración GFP.
  2. Fijar las células con 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS durante 15 min a TA con agitación suave. Evitar el uso de reactivos que contienen metanol que puede permeabilizar las células. La fijación con metanol se puede utilizar si no es necesario para evaluar las interacciones de ligando.
    Precaución: El paraformaldehído es tóxico. Use equipo de protección personal adecuado. El uso en una campana de humos, con cuidado, y desechar correctamente.
  3. Enjuague con PBS como anteriormente. Para la tinción basados ​​en anticuerpos, ver 3.6 más abajo.
  4. Monte cubreobjetos a portaobjetos utilizando Mowiol u otro medio de montaje adecuado.
  5. Las diapositivas de imágenes utilizando un microscopio confocal de fluorescencia o con los conjuntos de filtros apropiados para la excitación GFP y espectros de emisión. La microscopía confocal se prefiere debido a la capacidad para separar las muestras en el plano z. Guardar las imágenes en escala de grises para qufines antitation en formato TIF (además de imágenes a todo color para las ilustraciones).
  6. Para la comparación con WT TMEM184A expresado por las células, preparar otras células para inmunofluorescencia utilizando anticuerpos primarios preparados a un péptido (s) a partir de la secuencia de TMEM184A, por ejemplo 1. Identificación de GFP-TEMEM184A también se puede realizar utilizando anticuerpos contra la GFP. Evaluar tanto las muestras de células por técnicas de microscopía idénticas.

4. Rodamina-Heparina Encuadernación y colocalización con células transfectadas con GFP-TMEM184A

  1. Tratar las células GFP-TMEM184A expresan con 100 mg / ml de heparina-rodamina añadido al medio de cultivo, y permitir que las células se incuban durante un período de tiempo específico, por lo general menos de 10 min para las células A7R5. Enjuague y fijar como en 3.1 y 3.2.
    NOTA: El tiempo y la concentración de ligando óptima dependerá de la respuesta celular, la intensidad de fluorescencia de la intensidad de ligando y la imagen obtenida. este concentratSe empleó ion de heparina porque da lugar a la respuesta de más de 50% en otros ensayos 11. Esta concentración puede ser visualizado utilizando técnicas estándar de microscopía de fluorescencia, por lo que no era necesario para aumentarlo. La dilución de la rodamina-heparina con resultados de heparina no marcados en la fluorescencia más bajo en las células, por lo tanto es más difícil de imagen y cuantificar.
  2. Para cuantificar la unión debido a las buenas prácticas agrarias-TMEM184A transfección rodamina-heparina, preparar células idénticas sin transfectadas GFP-TMEM184A.
  3. Image las células utilizando un microscopio confocal con la GFP apropiada (488 nm) y rodamina (543 nm) de excitación y emisión - valores (500 530 nm para la GFP y mayor que 560 nm para rodamina) para determinar co-localización. Obtener imágenes de al menos 50 células de al menos tres experimentos separados para obtener estadísticas. Mantener ajustes idénticos dentro de los experimentos, y emplear una muestra de control (s) (por ejemplo, células transfectadas con ningún tratamiento) ºa se puede utilizar para normalizar los datos para el análisis de múltiples experimentos.
  4. Examine las imágenes utilizando un programa de ordenador para determinar / captación de unión en cada celda para la cuantificación de la unión rodamina relativa.
    NOTA: las imágenes TIF deben ser empleados como que son convenientes para el análisis y se pueden convertir a escala de grises en muchos programas de ordenador si no se guardan inicialmente en ese formato. Image J (freeware) se empleó en el presente análisis y permite que el área y la intensidad de píxeles que deben medirse para cualquier área definida por el usuario en una imagen.
    1. Utilice una herramienta de mano alzada para rodear una celda dentro de una imagen fluorescente y utilizar la herramienta de medida para determinar la intensidad dentro de ese espacio.
      NOTA: Estas mediciones proporcionan la información necesaria para calcular la intensidad total para un área definida por el usuario (de células enteras, núcleo, etc.) que proporciona una manera de comparar diferentes células con diferentes geometrías. intensidad sobre un área de fondo se puede informar significan, y que facilitans colección de intensidad de fondo para su análisis.
    2. Exportar a una hoja de cálculo para calcular el área multiplicada por la intensidad y restar el fondo de la misma cantidad de área. Promediar la fluorescencia / célula de suficientes células / experimento para obtener la significación estadística.

5. Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de GFP-TMEM184A a rodamina-heparina

  1. Preparar células transfectadas y se incuba con 200 mg / ml ligando rodamina-etiquetado como en 3.1. Tenga en cuenta que el tiempo de incubación con el ligando fluorescente es de tipo celular dependiente. Fijar sólo con PFA, y montar diapositivas de imágenes.
  2. En primer lugar, excitar a 405 nm y la imagen para la emisión de rodamina (566 - 685 nm; FRET). En segundo lugar, excitar a 488 GFP (imagen en 493 - 530) para, y en tercer lugar, excitar a 561 de rodamina (imagen al 566 - 685). Controles sin GFP-TMEM184A o sin rodamina-heparina son críticos.

6. Células vivas imágenes de Rodamina-Heparin captación

  1. Sembrar la GFP-TMEM184A células transfectadas en platos individuales diseñados para imágenes de células vivas y tratar como en el protocolo 3.
    NOTA: El número de células necesarias depende del tipo de célula y la densidad deseada. Para reducir al mínimo la cantidad de tiempo las células están en suspensión, no contar células. Se siembran las células confluentes de un plato de 100 mm en seis platos de imágenes en vivo de 35 mm para obtener células cerca de la confluencia en 48 h.
  2. Después de 48 h, sustituir el medio con medio de cultivo sin rojo fenol.
  3. Transferir una placa de células a un microscopio confocal con una etapa de calentamiento para mantener la temperatura, y enfocar el microscopio.
  4. Pipeta de 100 mg / ml de rodamina-heparina en el plato y mezclar suavemente.
  5. Inmediatamente comienza a grabar imágenes en vivo. Si no la captación celular de la heparina se produce dentro de la región a la vista, mover el plato ligeramente para identificar las células con al menos una vesícula verde que contiene el marcador de rodamina.
    NOTA: excitación formación de imágenes y de emisión específicos son losmismas que para el protocolo de absorción de heparina (sección 5). El período de tiempo entre las imágenes fue de aproximadamente 16 s. Las condiciones del experimento y el microscopio normalmente determinarán la velocidad a la que pueden obtenerse imágenes.

7. Aislamiento de GFP-TMEM184A y GFP de células cultivadas

  1. Después de retirar el medio de cultivo y de enjuagar con PBS, añadir 2 ml 0,2% (w / v) de solución de CHAPS 1x PBS con inhibidores de proteasa a una placa de 150 mm de células que expresan GFP-TMEM184A o GFP (para ensayos de unión de control). Raspar las células del plato, colocar la solución de células / CHAPS en un tubo de polipropileno de 15 ml en hielo, y mezclar bien tocando. Completar todos los pasos en la luz brillante para asegurar la etiqueta GFP se blanquea para el ensayo de unión a continuación.
  2. Para unirse específicamente GFP-TMEM184A (o un control GFP apropiado), añadir 2 mg / ml de anticuerpo anti-GFP biotinilado a la solución y se incuba durante la noche a 4 ° C con agitación.
  3. Añadir 500 lde perlas de estreptavidina-agarosa para al menos 0,2 ml 5% de CHAPS / PBS y centrifugar a aproximadamente 600 xg durante 3 a 5 min. Eliminar el sobrenadante. Repetir dos veces más con CHAPS fresca / PBS cada vez. Añadir cuentas a la solución de anticuerpos y de células y se incuba durante la noche a 4 ° C con agitación para permitir que las perlas se unan al anticuerpo anti-GFP biotinilado unido a la GFP o GFP-TMEM184A.
  4. Sedimentar las perlas por centrifugación (como en 7.3) y eliminar el material no unido. Añadir inhibidores de al menos 5 ml 0,2% CHAPS / PBS / proteasa de lavar. Repetir el lavado y centrifugación al menos 3 veces para eliminar eficazmente cualquier proteína no unida.
  5. Después de quitar el último lavado, se incuban las perlas con 1 ml de glicina 0,2 M / 0,2% de CHAPS en PBS (pH a 2,0 usando HCl) en hielo durante 3 min para disociar el anticuerpo-GFP de unión (que resulta en libre GFP-TMEM184A o libre GFP). Mezclar suavemente tocando cada 30 s.
  6. Se centrifuga a aproximadamente 600 xg y transferir el sobrenadante que contiene el p purificadarotein a un nuevo tubo de 15 ml seguido de neutralización inmediata con 5 ml de 1 M de bicarbonato de sodio (llevar el pH a 7).
  7. Se concentra la muestra usando un peso molecular de 10.000 Dalton de corte de concentrador centrífugo (emplear la velocidad de centrifugación recomendado por el proveedor). Cuando el volumen llega a aproximadamente 0,5 ml, añadir 0,2% CHAPS / PBS. Continuar la concentración y la adición de más de 0,2% de CHAPS / PBS hasta / PBS se han añadido al menos diez volúmenes (veces el volumen de la muestra de partida) de la CHAPS 0,2%.
  8. Para determinar una estimación de la cantidad de GFP aislado o proteína GFP-etiquetados, obtener una lectura de absorbancia a 280 nm y compararlo con una curva estándar preparada a partir de albúmina de suero bovino u otra proteína de control en el mismo tampón.
    NOTA: Debido a las diferencias de coeficiente de extinción, esta concentración es una estimación, pero puede proporcionar una concentración de proteína aproximada para facilitar su posterior análisis sin perder la muestra. concentración de proteínas precisa puede disuadirextraído usando un ensayo de proteína micro-Lowry asegurándose de preparar la proteína estándar en el mismo tampón que la muestra. Un análisis más detallado de la proteína aislada se puede lograr mediante transferencia Western de la proteína aislada (usando la detección de anticuerpos para GFP) y la comparación con el peso molecular predicho. Alternativamente, el uso de los anticuerpos TMEM184A debería resultar en una banda del tamaño predicho construcción, sino que también podría dar lugar a una banda WT TMEM184A si dímeros (u oligómeros de orden superior) están presentes en la muestra. Una estimación de la pureza se puede obtener mediante la tinción de un blot para la proteína total de la muestra aislada vs proteína total de una alícuota del material de partida.

8. En Vitro Ensayo de unión de heparina

  1. Preparar una avidina-revestido placa de 96 pocillos negro por lavado con 200 l 0,2% CHAPS / PBS tres veces durante 5 min con agitación. Preparar un no revestido placa de 96 pocillos negro idéntica empleando el mismo procedimiento de lavado. Prepara unel diseño de las muestras experimentales (por triplicado) a seguir durante el ensayo. Incluir pozos para concentraciones estándar de heparina, controles de tampón, y los pocillos con muestras de GFP sin heparina para confirmar blanqueo de GFP.
    NOTA: Si optimizados de aislamiento o de interacción ligando tampones son diferentes para la proteína en cuestión, hacer todas las preparaciones de lavado de placas y con el sistema de amortiguación óptima.
  2. Añadir 100 ml de 60 pmol / pocillo biotinilado anti-GFP a todos los pocillos de la placa de avidina-revestido donde se desea la unión de GFP. La cantidad de anticuerpo es suficiente para simplemente saturar la avidina de alta afinidad en los pocillos.
    1. Añadir tampón sólo a todos los pozos utilizados para fines de control (sin GFP o GFP-unión deseadas TMEM184A). Sellar las pozos con una cubierta de la placa para evitar la evaporación. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente, con agitación.
      NOTA: Los volúmenes añadidos a los pozos y los tiempos de incubación se basan en las recomendaciones del proveedor.
  3. Lavar los pocillos tres vecesdurante 5 min con 200 l 0,2% de CHAPS / PBS.
  4. Añadir 100 ml de 5 nmol / pocillo-GFP o GFP TMEM184A a los pocillos apropiados de la placa recubiertos con avidina y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Lavar a continuación como en 8.3.
    NOTA: Se eligió este concentración de proteínas para asegurar que todos los sitios se saturaron con exceso de GFP o GFP-TMEM184A. Esto es importante para asegurar que la misma cantidad de proteína está unida a cada pocillo. cantidades menores de proteína también pueden saturar los sitios, una posibilidad que podría ser examinado por la evaluación de la proteína no unida que queda después de la incubación de varias concentraciones de proteína con la placa y la comparación de la proteína no unida y el ligando de ensayos de unión.
  5. Preparar varias concentraciones de heparina marcado con fluoresceína, como por ejemplo, 10, 25, 50, 75, 100, 200 mg / ml, en 0,2% de CHAPS / PBS. Para ello, y todo el trabajo que queda en la oscuridad.
    NOTA: Antes de la preparación de concentraciones, las concentraciones específicas de otros ligandos deben determinarse para el protein objetivo de que se trate. La concentración más baja debe ser detectable en el lector de placas. Por lo tanto es importante determinar primero la gama que se puede detectar con precisión en el sistema tampón empleado. A continuación, determinar el rango necesario para obtener la unión mensurable. Las concentraciones de fluoresceína heparina por debajo de 10 mg / ml no se registraron sistemáticamente en el lector de placas bajo las condiciones de tampón empleadas. Del mismo modo, mientras que la rodamina-heparina tal como se utiliza en los otros ensayos, podría ser visualizado en el lector de placas, en las condiciones de tampón y en las concentraciones necesarias para la unión, las lecturas de fluorescencia para los estándares no eran de forma reproducible con diferente que fluoróforo.
  6. Añadir 100 ml de fluoresceína-heparina a los pocillos de ensayo apropiados en la placa y la concentración estándar pozos recubiertas con avidina, tanto en el la placa no recubierto y recubierto con avidina. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Se mantienen las placas en la oscuridad (o papel de aluminio cubierto).
  7. Usando una placa de reader, grabar la emisión de fluorescencia inicial de la heparina en los pocillos de control de las dos placas y la fluorescencia inicial de emisión (total) de los pozos con inmovilizada GFP-TMEM184A o GFP en la placa de avidina-revestido. Si es necesario, ajustar la ganancia del instrumento para asegurar la detección fluorescente de heparina entre las más bajas y más altas concentraciones.
    NOTA: Asegúrese de que el lector de placas de pozos lee desde arriba y lee en la ubicación óptima de los pozos si eso es ajustable. Para el estudio en cuestión, la ubicación óptima era de 75% menos que los pozos. Información disponible con el lector de placas debe proporcionar sugerencias que son únicos para el lector de placas en cuestión para la lectura de los ensayos de muestra unida en placas negras.
  8. Retire la heparina fluorescente no unido de los pocillos con inmovilizada-GFP o GFP TMEM184A y colocar en los pocillos correspondientes de la placa sin recubrimiento negro. Inmediatamente leer la emisión de fluorescencia.
  9. Añadir 100 ml frescos 0,2% CHAPS / PBS volver into pozos, de donde se extrajo el fluoresceína heparina, y leer la emisión de fluorescencia.
  10. Repita los pasos 8.8 a 8.9 3x.
    NOTA: Estas lecturas de la placa recubierta con heparina indican fluoresceína que queda en los GFP o GFP-TMEM184A pozos. Si se determina que la fluorescencia significativa en la tercera muestra no unida, si se produce un lavado adicional. Si la fluorescencia continúa siendo eliminado en cada lavado, la unión del ligando podría ser baja afinidad, y las condiciones debe ser reevaluado. La lectura final constituye la lectura heparina fijada.
  11. Registro de emisión de fluorescencia de las desinstalados, no unidas, las muestras en la placa no revestido, la obtención de números para cada lavado. Estos son los valores "sin consolidar".
  12. Utilice valores de emisión total de heparina obtenidos en 8.7 para confirmar los niveles correctos de heparina añadieron a cada pocillo. Restar las lecturas promedio de los valores de fondo.
    NOTA: Wells sin fluoresceína heparina servir como fondo debido a anticuerpo, GFP y tampón. average el fondo se repite para obtener el valor de fondo. lecturas de fondo promedio de restar de la lecturas consolidadas y no consolidadas para obtener valores reales.
  13. Emplear una parcela de emisión con respecto al total de fluoresceína-heparina añadió para determinar la magnitud de las emisiones vs. cantidad de heparina.
    NOTA: anticuerpo solo o anticuerpo y antígeno dado lugar a algunos extinción de la fluorescencia. Por lo tanto, se determinó la heparina total basado en la heparina añadido total como se indica en 8.7.
  14. Trazar la heparina unida corregida frente a la heparina añadido para los triplicados, tanto en el caso de GFP-TMEM184A y el caso de GFP.
  15. Determinar el ligando libre mediante la adición de las lecturas no unido de todos los lavados para una concentración específica.

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Representative Results

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Mientras que, en teoría, la transfección de cualquier constructo de ADN en las células podría lograrse con reactivos de transfección lipófilos, los informes anteriores indican transfección más eficaz de GFP construcciones en células endoteliales utilizando electroporación 12. El protocolo aquí proporcionada típicamente logra GFP-construcción de expresión en más del 80% de las células endoteliales primarias derivadas de músculo liso y células utilizadas. Diseño del constructo empleado utiliza un sistema disponible en el mercado que puede entregar esta construcción rápidamente. El uso previsto principal se centraba en temas de localización, por lo tanto, la entrega correcta de la membrana, junto con la expresión de la proteína eucariota óptima y la producción continua construcción eran consideraciones primarias. Otras consideraciones podrían incluir: una ubicación diferente de la GFP para las proteínas de manera diferente localizados o proteínas con un extremo C-terminal que es parte de una región plegada, la posibilidad de Wanting para eliminar la GFP (la adición de un sitio de escisión de la proteasa), y un sitio de afinidad secundaria. Esto último sería proporcionar formas alternativas de la purificación de la construcción de GFP y la estabilización en una superficie para el ensayo de unión. Para confirmar los patrones de tinción para diferentes anticuerpos comerciales contra TMEM184A, las células vasculares que expresan GFP-TMEM184A se compararon con células idénticas teñidas con los anticuerpos comerciales. La longitud de tiempo después de la distribución de los impactos de transfección de GFP-TMEM184A, que parecía acumularse sobre al menos 72 h. El período de tiempo después de la transfección que resulta en la expresión óptima varía según el tipo de célula y debe ser optimizada para cada técnica. Con el tiempo, más etiqueta GFP estaba en la región peri-nuclear. Dependiendo de la manipulación, el blanqueado GFP también se produjo. Los resultados indicaron GFP-TMEM184A en la superficie celular y en las estructuras vesiculares peri-nucleares y otros similares a la localización observada con la tinción de anticuerpos TMEM184A (Figura 1). Las células primarias de Figura 5, donde también se utilizó la técnica para evaluar topología de la membrana.

El uso de un ligando fluorescente (rodamina-heparina) facilitó la evaluación de co-localización de ligando y el receptor con el tiempo, y las dos etiquetas hizo posible para llevar a cabo formación de imágenes en vivo (Figura 2 y la película 1). Figura 2C fue fotografiada por la excitación de la GFP a 405 nm, pero la captura de emisión de la rodamina (imágenes intermedias). la excitación de GFP se limita a 405 nm rendimiento de emisión limitada también, pero esto impidió la excitación de la rodamina y una señal de FRET falsa. Del mismo modo, la FRET-Inducemisión de rodamina ed era débil. En los controles con la expresión de GFP-TMEM184A, pero no rodamina-heparina, y otros sólo con rodamina-heparina no hubo emisión de rodamina con 405 nm de excitación. Posteriormente, las buenas prácticas agrarias totales (imágenes izquierda) y rodamina totales (imágenes de la derecha) se midieron utilizando longitudes de onda de excitación / emisión estándar para cada fluoróforo. Los datos en la C más apoyo la co-localización del ligando y la GFP-TMEM184A. la captación de rodamina-heparina en RAOEC requiere de incubación más largo en comparación con células A7R5. No se observó evidencia de FRET en las células sin rodamina-heparina o en las células no transfectadas. Un experimento ideal sería incluir otra superficie GFP-constructo que no debe tener ningún co-localización con el ligando.

Adquisición o recuperación de la función también se podrían lograr con construcciones de GFP-proteína y rodamina-heparina. Esto proporcionó la oportunidad de utilizar la GFP como prueba para el nivel de expresión y co-ligandoLa localización y cuantificar las interacciones. Específicamente, la absorción de la heparina se incrementó en GFP-TMEM184A células A7R5 (Figura 3) Construir transfectadas. Desmontables células estables que ocupan muy limitada rodamina-heparina se produjeron 1, y éstos proporcionan un sistema en el que la ganancia de la función podría ser evaluado. La transfección de GFP-TMEM184A dado lugar a células que podrían internalizar nuevo rodamina-heparina a nivel de las células de tipo salvaje o por encima (Figura 3). Debe tenerse en cuenta que la imagen "sin heparina" es de desmontables células estables, que no expresan GFP como reportero para la construcción de caída. La fluorescencia de fondo era más alta en estas células, como se observa en la imagen mostrada.

Por lo general es útil usar receptor aislado para la determinación de la especificidad de ligando para disminuir la probabilidad de otras proteínas que interactúan con el ligando. El uso de un GFP-protein constructo proporciona una ventaja significativa en este sentido que la etiqueta GFP puede servir como un mango para el aislamiento de la proteína y evita posibles interacciones de anticuerpos u otros reactivos de afinidad con proteínas adicionales. GFP puede expresarse también en poblaciones idénticas de las células y se aisló usando el mismo procedimiento afinidad GFP. Esto proporciona una proteína de control para los estudios de interacción ligando. En el sistema TMEM184A, la GFP-TMEM184A aislado utilizando un procedimiento de afinidad de anticuerpos anti-GFP resultó en heparina específica, saturable de unión, mientras que la GFP de control no se unió cualquier heparina (Figura 4).

Típicamente, las etiquetas de GFP en las construcciones se colocan en un extremo de una proteína. La ubicación C-terminal facilita el tráfico correcto de proteínas a una membrana. Por lo tanto, la disponibilidad de GFP en un lado particular de una membrana puede proporcionar evidencia de topología específica de una proteína de la membrana si plegado y topología no son unalready conocido. La tinción de inmunofluorescencia simple con anticuerpos contra GFP (como en la Figura 5) puede proporcionar evidencia de la localización de GFP basada en el acceso de anticuerpos en las células no permeabilizadas. Los anticuerpos anti-GFP reconocen GFP incluso si blanqueada. La tinción inmunofluorescente muestra en la figura 5 sugiere significativa tinción anti-GFP sin permeabilización de las células GFP-TMEM184A transfectadas proporcionan evidencia preliminar de que la GFP en la membrana plasmática es extracelular. Claramente, la proteína intracelular de vesículas también se mancha en las células permeabilizadas. Imágenes de FRET en la Figura 2C son consistentes con esta topología propuesta.

Figura 1
Figura 1: Localización-GFP en células TEMEM184A Confirma TMEM184A localización Determinado por inmunofluorescencia. A) BAOECs transfectadas con GFP-TMEM184A se fijaron con PFA al 4%. células no transfectadas fueron procesados ​​ya sea con fijación enfriado con hielo metanol (MeOH) y permeabilización o 4% PFA seguido de Triton X-100 de permeabilización (como se indica). Las células no transfectadas se tiñeron utilizando un anticuerpo contra un péptido C-terminal de TMEM184A (CTD) o un péptido N-terminal de TMEM184A (NTD) y un anticuerpo secundario anti-conejo marcado con TRITC. B) Ejemplos de clonado (A7r5) y BAOSMC células musculares lisas primarias () se procesaron de manera similar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Imágenes de GFP-TMEM184A con Rodamina-heparina. A) A7r5s a electroporación con GFP-TMEM184A fueron tratados con 100 mg / ml de rodamina-heparina para ellos tiempos indicados y después se fijaron con PFA al 4%. Las imágenes son representativos de dos experimentos separados. B) Las células A7R5 fueron transfectadas con GFP-TMEM184A y rodamina-heparina se añadió con imágenes en vivo inmediata. Los cuadros seleccionados de la película se muestran con una barra vertical blanca que apunta a la localización inicial de una vesícula que contiene GFP recubierto de rodamina-heparina. La etiqueta GFP y de la rodamina se mueven juntos. Barras de escala = 2 m. C) RAOECs tratadas como en A se obtuvieron imágenes por resonancia de fluorescencia la transferencia de energía por medio de estimular a 405 (GFP, por FRET) y se comparan con los ajustes estándar, véase el protocolo 3.5. El panel A, y los dos puntos de tiempo en B, se publicaron originalmente en la revista Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. 1. Derechos de autor de la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. Por favor, haga clic aquí para vIEW una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: La transfección de GFP-TMEM184A Proporciona ganancia de función. A) De manera significativa los niveles más bajos de rodamina-heparina se observan en células A7R5 desmontables estables en comparación con los de tipo salvaje A7r5s, ver imágenes de ejemplo. La imagen de "no heparina" es de desmontables células estables que expresan GFP como marcador de la presencia de constructo. Barras de escala = 10 m. B) La transfección de GFP-TMEM184A en tanto de tipo salvaje y desmontables células estables aumenta significativamente la señal de rodamina-heparina en estas células basadas en el análisis de más de 50 células / condición en tres experimentos independientes. Las barras de error representan SEM. p <0,0001 basado en una prueba de Tukey. Esta cifra fue publicado originalmente en la revista Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. 1. Derechos de autor de la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Aislado GFP-TMEM184A liga heparina. GFP-TMEM184A o GFP fue aislado y unido a placas de ensayo recubiertas con avidina. Fluoresceína-heparina se añadió a concentraciones de 0,056 nmol través de 1.111 nmol. Heparina unida se determinó mediante la medición de emisión a 519 nm. GFP-TMEM184A (cuadrados). control GFP (círculos). Esta cifra fue publicado originalmente en la revista Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. 1. Derechos de autor de la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: GFP-TMEM184A y membrana de topología. transfectadas las células GFP-TMEM184A o bien se fijaron con PFA al 4% (arriba) o se fijaron con PFA al 4% y se permeabilizaron usando Triton X-100 (parte inferior). Las células se tiñeron de forma idéntica con anti-GFP anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios marcados con Cy3. Barras de escala = 10 m. Se muestran dos experimentos diferentes. Secundarios células sólo teñidos con mostraron esencialmente ninguna tinción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

película 1
pload / 55053 / movie.mp4 "target =" _ blank "> Película 1:.. en vivo de imágenes de GFP-TMEM184A con Rodamina-Heparina (clic derecho para descargar) A7R5 células se trataron como en la figura 2B La película ilustra la GFP TMEM184A y la vesícula rodamina-heparina en la parte superior se mueven juntos. versiones de color por separado, además de la versión combinada de la película se muestran. la vesícula con GFP y que contienen rodamina es un círculo.

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Discussion

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Los protocolos divulgados aquí fueron diseñados para proporcionar evidencia confirmatoria para la identificación de TMEM184A como un receptor de heparina en las células vasculares 1. técnicas desmontables se utilizan habitualmente como un mecanismo para confirmar la identificación de nuevas proteínas. Sin embargo, una cierta pérdida funcional después de la caída no suele ser suficiente prueba de que una proteína candidata es en realidad el receptor correcto (u otra proteína funcional). También es importante tener evidencia de que la proteína candidata en realidad exhibe la función. El empleo de una construcción de un nuevo gen etiquetado con GFP permite ganancia de experimentos de la función y facilita el aislamiento de la proteína etiquetada basado en afinidad GFP. La electroporación empleado en este protocolo facilitado muy alta eficiencia de la transfección del constructo (mayor que 80% de las células expresó la construcción). Sin embargo, otros mecanismos de transfección se podrían utilizar si la electroporación no está disponible o no se desea. Hay varias ventajas para la selección de una construcción de GFP-etiquetado para la confirmación de una función nueva proteína. En primer lugar, la GFP sirve como reportero para la transfección y la expresión génica y permite la sobreexpresión de ser monitoreado a través de GFP si una línea celular sin expresión de la proteína no está disponible. En segundo lugar, la etiqueta GFP proporciona una herramienta para la purificación de la proteína que no depende de cualquiera de afinidad de ligando o anticuerpos contra péptidos. En tercer lugar, la etiqueta GFP proporciona una herramienta para examinar la localización inmunofluorescente complejo visualizaron utilizando anticuerpos generados contra los péptidos únicos en la secuencia de la proteína diana para determinar si el producto del gen real se localiza de manera similar.

Ganancia de ensayos de la función con construcciones de genes se utilizan para una serie de propósitos, incluyendo el cribado de alto rendimiento para la identificación de la función nueva proteína 13. Idealmente, la ganancia de ensayos de la función emplearía un li celular clonada bien estudiadone que no expresa el gen en cuestión (las células todavía deben expresar productos génicos que permiten la función del gen de nueva expresión cooperar). Cuando se utiliza una construcción específica GFP-etiquetado como en los presentes ensayos, es fundamental usar células en las que la GFP-proteína puede funcionar. Por lo tanto, la elección de las células depende de la función y, probablemente, del tipo de célula en el que la función le ocurrirían normalmente a asegurar proteínas cooperantes están presentes. GFP-etiquetado permite una forma adicional de la función de monitorización en el caso en el que la fluorescencia de la proteína GFP-etiquetado puede ser seguido como parte de un ensayo funcional (por ejemplo, ver las figuras 2 y 3). Una limitación de estos estudios sería si GFP alguna manera altera la función de la proteína. Al vincular la GFP a la C-terminal de la proteína, un gran número de proteínas que ya se han estudiado sin una alteración funcional aparente, pero que sí existe tal posibilidad.

Radioisotopicaligandos LLY etiquetados a menudo se han utilizado para estudiar la unión a células intactas 11 ligando. Sin embargo, estos ensayos no permiten la simple determinación de la ubicación ligando después de la unión, ni tampoco facilitan las comparaciones de ligando y receptor juntos como en el presente informe. Una construcción GFP también proporciona nuevas oportunidades para examinar una proteína de membrana marcada como en este caso. Debido a la ubicación C-terminal de la etiqueta de GFP, es posible examinar la ubicación de la etiqueta de GFP en las células transfectadas a lo largo de un ensayo. Inmunofluorescencia utilizando anticuerpos para GFP permite la comparación de GFP accesibles a los anticuerpos con y sin permeabilización (Figura 5). Aplicaciones adicionales de GFP-TMEM184A se aprovechan de imágenes GFP como la colocalización con rodamina-heparina (Figura 2). El empleo de FRET para permitir la emisión de GFP para excitar la rodamina-heparina como se muestra en 2C proporciona una manera interesante evaluar tra unión e intracelularfficking. Además, FRET datos indican que la GFP está lo suficientemente cerca (a menos de 10 nm) a la rodamina-ligando para transferir de excitación. La evidencia de que dicha transferencia de GFP a una planta de ligando ha sido publicado por la hormona paratiroidea etiquetadas con tetrametil-rodamina 14. La tecnología alternativa FRET (foto-blanqueo y / o los patrones de formación de imágenes de equipo impulsado) se pueden emplear también para el análisis más complejo que lo que se muestra aquí como un ejemplo. Del mismo modo, las interacciones de otras proteínas con el candidato podrían ser examinados utilizando FRET con etiquetas fluorescentes optimizados para FRET como en el sistema EGFP / mCherry informado por Albertazzi et al. 15 y la PPC / YFP y GFP pares utilizados en los estudios del canal de potasio por Wang y colegas 16. Muchas de las nuevas pequeñas moléculas fluorescentes están siendo diseñados, por ejemplo 17. Estas moléculas se incrementará el número de casos en los que FRET interacciones entre proteínas y f GFP-etiquetadosligandos luorescent pueden ser examinados. Los estudios futuros también puede implicar cambios en el gen blanco, lo que permite la construcción para ayudar a determinar los aspectos específicos de la secuencia de la función del gen. Una limitación de las proteínas de membrana GFP-etiquetados es cuando el C-terminal de la proteína es normalmente en el interior. En tales casos, los ensayos de FRET con ligandos fluorescentes solubles en agua pueden no ser posibles. Sin embargo, los mecanismos alternativos para colocar GFP en el constructo en otras partes aún podría ser posible que algunas de tales proteínas, y todavía podrían emplearse los otros ensayos divulgados aquí.

Además de la función, localización, e in vivo interacciones ligando, una proteína GFP-etiquetados puede ser aislado utilizando un anticuerpo anti-GFP y la proteína aislada utilizado para examinar la función empleando ensayos in vitro donde la GFP permite un aislamiento imparcial de la proteína y un control relativamente aislados (GFP libre). En conjunto, estos ensayos pueden proporcionar una fuerte evidencia adicional necesaria para demostrar THen las funciones de la proteína candidata como hipótesis.

Además, puesto que GFP es resistente a menos modificado con sitios que se extienden lejos de la estructura compacta 18 proteasa, tratamiento con proteasa limitado de células debe liberar GFP extracelular. La escisión de la proteasa se produciría en la proteína a la que está unido GFP o en una región de ligamiento diseñado. El producto liberado sería GFP con una extensión N-terminal a la secuencia de GFP. La tripsina no deben liberar GFP si el C-terminal de la proteína a la que está unido GFP es intracelular. Un análisis preliminar de los productos potenciales podría indicar un tipo de peso molecular clara con una proteína GFP-marcados y liberados por la tripsina. Para muchas proteínas de membrana, tales técnicas darían lugar a una clara evidencia de topología de la membrana por la liberación de GFP, o falta de ella.

En conjunto, los ensayos específicos presentados y / o propuestos en este informe proporcionar una amplia muestra de las técnicas de tsombrero puede ser empleada para examinar nuevas proteínas partiendo de una construcción de marcado con fluorescencia. Tales construcciones se pueden obtener fácilmente en el comercio. La oportunidad de usarlos para una amplia gama de técnicas que los hace económicamente factible, incluso para los pequeños laboratorios con presupuestos limitados.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GFP-TMEM184A construct OriGene RG213192
Rhodamine-Heparin Creative PEGWorks HP-204 Light Sensitive
Fluorescein-Heparin Creative PEGWorks HP-201 Light Sensitive
Mowiol EMD Millipore 475904-100GM
Paraformaldehyde (PFA, methanol free) Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific PI28908 at Fisher Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96-well dishes) Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific PI15510 at Fisher Pay attention to shelf-life
Black 96-well plates Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific 064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line ATCC CRL 1444 Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. B304-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells Cell Applications, Inc. B354-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. R304-05a Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads Sigma S1638
HeBS Available from Bio-Rad Can be prepared in the lab. The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus Santa Cruz Biotechnology sc292006 Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus Obtained from ProSci Inc, Poway, CA  Pro Sci 5681 ProSci used in Figure 1
GFP antibodies Santa Cruz Biotechnology sc9996 Used in Figure 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC)
715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)
Minimal cross-reactivity to minimize any nonspecific staining.
CHAPS Purchased from Sigma C5849 Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35-mm dishes MatTek (Ashland MA) P35G-1.0 – 20 mm - C
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope Nikon C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens Used for images in Figure 5
Confocal Microscope Zeiss Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment Bio-Rad Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes Available from MidSci EC2L Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader TECAN TECAN Infinite® m200 Pro plate reader Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Program and information available on-line
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail  
Cell Culture trypsin solution Sigma T4174 purchased as a 10x solution

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References

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El uso de un TMEM184A GFP-etiquetados Constructo para la Confirmación de heparina receptor de Identidad
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Farwell, S. L. N., Slee, J. B., Li, Y., Lowe-Krentz, L. J. Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity. J. Vis. Exp. (120), e55053, doi:10.3791/55053 (2017).More

Farwell, S. L. N., Slee, J. B., Li, Y., Lowe-Krentz, L. J. Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity. J. Vis. Exp. (120), e55053, doi:10.3791/55053 (2017).

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