Summary
Nous présentons une méthode pour l'isolement et la culture du canal de Wolff de la souris (WD). Nous démontrons également une procédure détaillée pour l'ensemble de l'immunocoloration mont de culture / WDs fraîchement isolés avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l'étude du développement WD, enroulement, et la différenciation.
Abstract
morphogenèse Tubal est une exigence fondamentale pour le développement de la plupart des organes de mammifères, y compris le système reproducteur masculin. L'épididyme, une partie intégrante de l'appareil reproducteur masculin, est responsable de la conservation de sperme, la maturation et le transport. L'épididyme adulte est un tube très enroulé qui se développe à partir d'un précurseur embryonnaire simple et droite connu comme canal de Wolff (WD). lovage correcte de l'épididyme est essentiel pour la fertilité masculine, comme le sperme dans les testicules sont incapables de féconder un ovocyte. Cependant, le mécanisme responsable du développement de l'épididyme et lovage reste incertaine, en partie à cause du manque de culture d'organes et d'imagerie méthodes entières. Dans cette étude, nous décrivons un système de culture in vitro et le protocole entier immunofluorescence mount pour mieux visualiser le processus de WD lovage et le développement, qui peut également être appliquée à l' étude d' autres organes tubulaires.
Introduction
Le système reproducteur mâle se compose essentiellement de testiculaire, le site pour le développement et la différenciation des cellules germinales et un système ductal complexe qui est nécessaire pour la maturation, le transport et le stockage du sperme. Épididyme est un organe tubulaire qui relie testis avec déférent et principalement impliquée dans le développement post-testiculaire et la maturation des cellules germinales 1. L'épididyme fortement enroulées de souris adulte se développe à partir d' un simple tube et droite précurseur, canal de Wolff (WD) 1. La structure complexe et enroulée du épididyme est essentiel pour les spermatozoïdes d'acquérir la capacité de fertiliser les cellules germinales femelles 2. Comment un tel organe essentiel pour la fertilité masculine se développe et se retrouve dans la forme ne sont pas bien compris. Diverses voies de signalisation ont été révélés être impliqués dans le développement de WD telles que la voie de signalisation Wnt 3,4 et la voie 5 de signalisation des androgènes. Nos travaux récents ont mis en place l'exigence de balbrée signalisation Wnt pour WD lovage au cours du développement prénatal 4. Toutefois, d'autres études sont nécessaires pour comprendre les mécanismes impliqués dans postnatale lovage épididymaire, la différenciation cellulaire, et la communication de cellule à cellule dans l'épithélium de l'épididyme et avec des cellules interstitielles.
Modèles de souris génétiquement modifiées ont été révélés être un outil puissant pour l' identification / validation des mécanismes moléculaires sous - jacents du développement et de la maladie de divers systèmes d'organes 6. En dépit de son utilisation intensive, il y a des limites importantes de modèles de souris génétiquement modifiés, y compris le phénotype unpredicted de mutants de souris ciblés en ce qui concerne la fonction présumée du gène, et aucun phénotype mutants nuls dans certains modèles, l'influence des facteurs génétiques et environnementaux, de main-d'œuvre et temps processus de développement des modèles de souris. Par conséquent, l'interprétation de la signification des résultats seulement de génétiquement modifiésmodèles de souris fiés est pas toujours simple 6. Ces limitations peuvent être surmontées en utilisant dans le système de culture d'organe in vitro qui nous donne la souplesse nécessaire pour manipuler les multiples voies de signalisation en temps réel dans des conditions de culture contrôlées. Système de culture d'organes joue un rôle dans la compréhension de la physiologie et de la pathologie des organes entiers 7. En outre, l' imagerie d'organes entiers colorés avec des anticorps fluorophores marqués nous permet de visualiser les marqueurs d'intérêt dans un contexte tridimensionnel, tel qu'il existe in vivo, fournissant ainsi une meilleure compréhension de la forme de l'organe, la structure et la fonction 8.
Ici, nous avons décrit les méthodes d'isolement des souris crêtes gonadiques embryonnaires, la culture in vitro et toute la montagne immunofluorescence imagerie de WDs, qui peuvent être appliquées pour répondre à une variété de questions relatives à la morphogenèse des organes tubulaires tels que WDS. Dans ce protocole, nousisolées souris embryonnaires crêtes urogénitales de 15,5 jours après le coït (dpc) barrages enceintes et les cultivées pendant 3 jours, suivi par immunocoloration pour un marqueur des cellules épithéliales (cytokératine 8, CK8), un marqueur de prolifération cellulaire (phospho-histone 3, PH3) et active βcatenin.
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Protocol
Les soins et les procédures expérimentales ont été menées en conformité avec les directives du soin et du Comité d'éthique animale de l'Université de Newcastle et confirmé à la Loi sur Nouvelle-Galles du Sud animal recherche, Pays de Galles règlement Animal Research New South, et le code australien pour les soins et utiliser des animaux à des fins scientifiques. Toutes les procédures menées sur des souris ont été approuvées par le soin et Comité d'éthique animale de l'Université de Newcastle.
1. Time Mating
- Paire 6 - 8 semaines chez les souris femelles juste avant la fin du cycle de lumière du jour et mâle.
- Vérifiez les femelles pour la présence de bouchons vaginaux tôt le matin (ou avant 08h00), tous les jours. Jour de la prise est considérée comme 0,5 dpc.
- Transférer la femelle avec bouchon vaginal dans une nouvelle cage (sans mâle) et l'étiquette de la date de prise.
2. Isolement de souris embryonnaires gonadiques Ridges
- Isoler embryon de sourisic crêtes gonadiques de 15,5 dpc les femmes enceintes comme décrit dans 9, avec quelques modifications , comme décrit ci - dessous.
- Effectuer la dissection avant midi que le temps des femmes enceintes sont considérées comme d'entrer dans le lendemain de la grossesse, l'après-midi.
- Sacrifiez 15,5 dpc femmes enceintes à l'aide de la dislocation cervicale (ou selon le protocole approuvé par le Comité d'éthique animale institutionnelle).
- Gardez la souris sur le dos sur du papier de soie absorbant et pulvériser la face ventrale de l'abdomen avec 70% d'éthanol.
- Soulever la peau abdominale inférieure (face ventrale) avec une pince et faire une incision latérale en utilisant des ciseaux chirurgicaux, allant de l'ouverture urogénitale à la fin de la cage thoracique. Tirez la peau vers la tête de l'animal afin d'exposer l'abdomen.
- Couper les muscles abdominaux avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer la cavité péritonéale. Prenez l'utérus gravide avec une pince juste au-dessus du col et faire une coupe. Maintenant soulevez l'utérus en se tenant to la vessie et découper le ligament large de l'utérus, suivi par des coupures au niveau des jonctions utéro pour détacher l'utérus de la fixation péritonéale.
- Transférer l'utérus dans un tube de 50 ml contenant de la glace froide HBSS (solution saline équilibrée de Hank). Laver l'utérus gravide doucement avec glacée HBSS pour éliminer l'excès de sang.
- Gardez l'utérus dans une boîte de Pétri contenant de la glace-froid HBSS et garder sur la glace. Couper la paroi utérine et enlever les embryons. Garder les embryons dans une boîte de Petri frais avec HBSS sur la glace.
- Prenez un mouchoir en papier propre et stérile et le mettre sur une nouvelle boîte de Pétri. Vaporiser éthanol à 70% sur le papier de soie. Gardez l' embryon sur ce papier de soie sur le côté latéral et le couper du bas - ventre à l' aide d' une lame stérile dans la direction indiquée par la ligne pointillée sur la figure 1.
- Fixer l'embryon sur une base éponge stérile en épinglant la colonne vertébrale.
- Placez-le sous le stéréomicroscope disséquant et découpez soigneusement le long de la ligne médiane ventrale. Retirer le foie et les intestins. Le système urogénital de la souris (rein, uretère, testiculaires, WD et déférent) doit maintenant être visible.
- Découpez le testicule et WD, et de garder dans une boîte de Petri frais avec HBSS, sur la glace. Pour retirer le WD et testiculaire, couper les canaux déférents à proximité de son attachement à l'urètre et couper la fixation de la partie inférieure de WD de gubernaculum.
- Réunir les testicules et WDs à partir des embryons d'un même groupe (cela peut varier selon le plan expérimental).
3. Culture Embryonnaire gonadique Ridges (Figure 2)
- Préparer le milieu pour cultiver les crêtes génitales d'embryons en complétant DMEM / F12 avec 10% de FBS (sérum bovin fœtal), 1% de pénicilline / streptomycine et 1% de L-glutamine. Réchauffez les médias à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Ajouter 300 ul de milieu par puits d'une plaque de culture cellulaire à 24 puits.
- Prenez une boîte de Pétri fraîche et mettre une petite goutte de HBSS stérile sur elle. Mettez une membrane piste de polycarbonate de gravure (0,881; m) sur cette goutte de HBSS avec sa surface brillante face à la HBSS.
- Utiliser une pince propre mis deux WDs et gonades sur la membrane (sur sa surface rugueuse, orientée vers le haut) et retirer le montant maximum de HBSS en utilisant des lingettes stériles / papier absorbant. Ne pas toucher le tissu avec du papier absorbant; sinon, il risque d'endommager le tissu.
- Veiller à ce que ni les WDs ni les gonades se touchent. Sinon, ils vont coller ensemble pendant une incubation ultérieure.
- Transférer la membrane avec les tissus dans le puits d'une plaque à 24 puits contenant 300 pi de milieu de culture et de leur culture à l'interface air-milieu. Trop de milieu de culture sur membranes se traduit par une croissance kystique WDS.
- Incuber la plaque à 37 ° C incubateur en présence de 5% de CO 2.
- Changer le milieu de culture tous les jours. Pour modifier le milieu avec la pipette, éliminer le milieu du puits d'abord, puis ajouter 300 ul du milieu frais préchauffée.
Remarque:Pour étudier l'effet de différentes voies de signalisation sur la morphogenèse WD, activateurs et / ou des inhibiteurs chimiques aux concentrations requises peuvent être ajoutés au milieu de culture. - Culture des tissus pour 3 d. Dans 3 d, WDs spiralées recueillies à partir d' un embryon dpc 15.5 se transforment en tubes très alambiquées (figure 3B). L'ajout de l'inhibiteur de Wnt, IWR1, se traduit par une inhibition de WD enroulant (figure 3C).
- Pour la récolte de ces tissus prennent une boîte de Pétri avec du PBS glacé. Transférer la membrane avec gonades cultivé et WD dans la boîte de Pétri. La membrane flottera sur le PBS. Appuyez sur la membrane pour le couler dans du PBS et prendre la gonade et WD.
- Fixer les tissus avec 4% de paraformaldehyde (PFA) O / N à 4 ° C ou pendant 1 h à température ambiante. Si nécessaire, prendre des images lumineuses des WDs sur le terrain avant la fixation.
4. Whole immunofluorescence Mont
- Laver les tissus fixés 3x avec du PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) avec basculement lent, 10 minutes chacun, à la température ambiante.
- Déshydrater les tissus dans une série graduée d'éthanol (25%, 50%, 75% et 100%), 10 minutes à chaque fois à 4 ° C, avec une bascule lente (~ 30 min). A ce stade, les tissus peuvent être stockés à 4 ° C dans 75% d'éthanol.
- Pour changer l'éthanol, garder les tissus intacts pendant 2 min et laisser les tissus se calment. Retirez autant surnageant que possible, puis ajouter la prochaine concentration plus élevée d'éthanol. Pour éviter tout dommage aux tissus, la pointe de la pipette ne doit pas toucher les tissus à tout moment.
- À la suite de la déshydratation, réhydrater les tissus dans une série graduée d'éthanol (100%, 75%, 50% et 25%), 10 minutes à chaque fois à 4 ° C avec balancement lent.
- Laver les tissus avec du PBS-T (PBS + 0,1% de Triton X-100), 4x, 20 minutes à chaque fois, à température ambiante, sous légère bascule (~ 30 min).
- Bloquer les tissus pendant 1 h à température ambiante avec un tampon de blocage (PBS + 1% BSA + 0,2% de lait en poudre écrémé en poudre + 0,3% de Triton X-100).
- after bloquant, transférer les tissus à une solution d'anticorps primaire (dilué dans un tampon de blocage) et incuber O / N à 4 ° C avec doux balancement (~ 30 rpm). Les dilutions des anticorps primaires utilisés sont décrits dans le tableau des matériaux.
- Le lendemain, lavez les tissus avec du PBS-MT (PBS + 2% de lait écrémé en poudre sèche + 0,5% de Tween-20), 4x, 30 minutes chacun, à la température ambiante, avec doux balancement (~ 30 rpm).
- Après cette étape de lavage, ajouter un anticorps secondaire à une dilution de 1: 250 (cette étape a besoin d'optimisation pour les anticorps individuels) dans un tampon de blocage et incuber pendant 1 h à température ambiante, avec doux balancement.
- A partir de maintenant garder partir des tissus recouverts d'une feuille d'aluminium pour empêcher l'exposition à la lumière que les anticorps secondaires sont marqués avec des fluorophores sensibles à la lumière.
- Laver les tissus 3x avec du PBS-T (PBS + 0,1% de Tween-20), 30 min chacun, avec doux balancement.
- Préparer des lames pour le montage des tissus colorés.
- Pour cela, couper les lamelles de verreen fines lamelles à l'aide d'un stylo à diamant et coller deux bandes l'une sur l'autre sur la lame de verre en utilisant le vernis à ongles. Faire deux lieux tissus frontières et entre ces deux limites.
- Ajouter DAPI contenant un milieu de montage et mis sur une lamelle. Appliquer le vernis à ongles dans les coins de la lamelle pour le fixer à la diapositive.
Remarque: Les tissus sont maintenant prêts pour l'imagerie. Conservez ces diapositives à -20 ° C.
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Representative Results
Au cours du développement, le WD subit des changements significatifs dans lequel un tube simple et droite se transforme en un conduit très complexe et enroulé. En utilisant des procédés décrits ci-dessus, WDs subissent une transformation similaire dans des conditions de culture. Ici , nous avons montré les résultats de WDs cultivés pendant 3 d (figure 3). Pour disséquer les mécanismes moléculaires impliqués dans la morphogenèse WD, le milieu de culture peut être complétée avec des inhibiteurs et des activateurs ciblant différentes voies de signalisation. La figure 3C montre déroulée WD après 3 jours de culture en présence de l'inhibiteur spécifique de signalisation Wnt, IWR1 10. Flèches marque enroulées (figure 3B) et spiralées WDs (figures 3A et C) indiquant que la suppression des résultats de la signalisation Wnt dans l' inhibition de WD enroulant (figure 3C). Ainsi, ce système de culture peut être utilisé pour disséquer les mécanismes moléculaires impliqués au cours du développement de WDs (ou d'autres organes).
Pour étiqueter différents types de cellules, nous avons effectué toute immunocoloration de montage sur WDs (Figure 4). Nous présentons ici des données de validation de l'utilisation de ce protocole pour l'étiquetage du cytosquelette, cytoplasmique, et les protéines nucléaires. La figure 4A représente cytokératine 8 (CK8, un marqueur des cellules épithéliales) immunocoloration de WDs (marqué par une flèche) en culture pendant trois jours. Nous avons également appliqué le même protocole pour évaluer la prolifération des cellules par immunocoloration pour PH3 (phospho-histone 3, un marqueur de prolifération cellulaire). La figure 4B montre une image représentative de l' ensemble de PH3 immunocoloration monture. Les points verts marqués par une flèche représentent des cellules proliférantes donc positives PH3. Figure 4C montre immunocoloration pour β-caténine active sur WDs fraîchement isolés de 18,5 embryons de souris dpc. Le contrôle négatif (contrôle IgG) dans la figure 4D montre aucune coloration. Ces résultats mettent en évidencela robustesse de l'ensemble de ce protocole de montage d'immunocoloration, qui peut également être utilisé pour de nombreux anticorps différents.
Figure 1. Illustration du site d'incision pour l' isolement des gonades embryonnaires de 15,5 dpc embryon. La ligne en pointillé blanc marque le site pour faire une incision dans un embryon de 15,5 dpc pour isoler des crêtes urogénitales. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Flux de schéma décrivant la procédure pas à pas pour la culture d'organes. S'il vous plaît cliquez ici pour view une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Normale WD morphogenèse dans des conditions de culture. (A) Testicules et WD isolés de 15,5 dpc embryon. (B) Enroulé WD après 3 jours de culture en présence de DMSO (témoin). (C) Non WD lovage a été observée avec le traitement IWR1 (un inhibiteur de Wnt). Sous-marque WD; t, marque testiculaire. Bars égal à 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Le total immunomarquage de WDs montage. (A - B) Le total d'immunocoloration mont de WDs isolacié de 15,5 dpc et les embryons cultivés pendant 3 jours pour CK8 (A) et PH3 (B). (C) actif βcatenin ensemble immunofluorescence montage sur WD isolé de 18,5 dpc embryon. (D) Contrôle négatif (contrôle IgG) pour βcatenin actif sur 18,5 dpc WD montrant aucune coloration. Flèche marques enroulées WD; t, marque testiculaire. Bars égal à 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le système de culture d'organe présente de nombreux avantages par rapport au système de culture cellulaire traditionnel. Ce système conserve les relations structurales originales et des interactions entre les différents types de cellules. Il imite dans des systèmes in vivo et donne des informations plus précises que les études de culture cellulaire , où le facteur de niche est absent. L'utilisation de systèmes de culture d'organes ont même des avantages par rapport à l'aide l'animal entier. Ceux - ci comprennent le coût plus élevé de l' utilisation de l'animal entier, facilité d' entretien et la maintenance du système de culture d'organes, etc. De plus, divers agents pharmacologiques ou des médicaments peuvent être testés sur des organes isolés / culture et réponse directe de l'organe et non pas l'ensemble du corps peut être étudié.
Il y a plusieurs étapes critiques qui doivent être pris en considération pour la culture réussie de WDs embryonnaires. Les tissus doivent être collectés avec soin, sans porter atteinte à leur intégrité, comme les tissus endommagés ne poussent pas bien et devenir kystique. Excédent des médias sur le haut defiltre conduit également à une croissance kystique du WDS. Nous avons effectué l'isolement et la culture des tissus à l'extérieur de la hotte de culture de tissu sans aucune contamination. Le milieu de culture a été préparée et ajoutée à des plaques à 24 puits à l'intérieur de la hotte de culture tissulaire. Par conséquent, en utilisant une technique appropriée, travailler rapidement et en prenant les précautions nécessaires, WDs recueillies en dehors de la culture tissulaire hotte peuvent être cultivées sans contamination. Alors que la récolte des tissus cultivés, il faut prendre soin car ils sont très fragiles et ne doivent pas être saisies directement avec une pince. Les tissus doivent plutôt être repris dans un film mince de PBS qui se forme entre les deux bras de la pince.
Nous avons également décrit une procédure de montage immunofluorescence ensemble détaillée dans ce manuscrit. imagerie Z-pile de tissus après toute coloration de montage en utilisant la microscopie confocale ou stéréoscopie donne un avantage à la section à travers tout le tissu sans coupes sériées et coloration plusieurs diapositives. Ainsi, il donne une meilleure idée dela localisation de l'expression des protéines cibles. la pénétration d'anticorps est difficile dans les tissus à teneur élevée en fibres / matrice extracellulaire contenu résultant d'un signal plus faible. perméabilisation plus longue et une plus longue durée d'incubation avec les anticorps primaires pourraient être utiles dans de tels cas. L'autre inconvénient de toute coloration de montage est que la résolution à un niveau cellulaire unique est difficile à réaliser et peut avoir besoin d'objectifs / microscopes spéciaux. Nous avons effectué deux 1 h et O / N fixation dans 4% PFA et a constaté que ces méthodes ont bien fonctionné pour la majorité des anticorps testés dans notre laboratoire, y compris CK8, PH3, et des anticorps βcatenin actifs. Nous avons également colocalisés avec succès CK8 avec PH3 ou βcatenin active. Pour colocalisation, des anticorps primaires pour les deux marqueurs ont été ajoutés simultanément. Ces anticorps doivent être soulevées dans les différentes espèces. Pendant toute la procédure d'immunofluorescence montage, le plus grand soin doit être pris lors de l'ajout ou la suppression de solutions que les tissus peuvent être facily aspirée dans la pointe de pipette / pipette de transfert et de se coincer à la matière plastique. Pour éviter cela, changer des solutions avec une pointe de pipette 200 pi sous un stéréoscope ou de dissection microscope et laisser un peu de solution au fond des tubes. Nous recommandons la collecte des solutions de déchets dans un récipient en verre transparent propre. Après chaque changement de solution, compter le nombre de tissus dans les tubes sous un stéréoscope. En cas de perte accidentelle de tissus, ils peuvent être récupérés à partir du récipient en verre. Les pointes de pipette pour le transfert de solutions ne doit jamais toucher les tissus car cela pourrait endommager les tissus et les laisser impropres à l'imagerie.
Pour le montage du WDS tachées, nous avons utilisé les diapositives de la cavité que de mettre des lamelles directement sur le dessus de WDs peut les comprimer et déformer leur morphologie. En fonction de l'épaisseur des tissus, la profondeur de la cavité peut être facilement manipulée en faisant varier le nombre de bandes de lamelle utilisées. Cette méthode de diapositive préparation est économique car il ne nécessite que des lamelles et un stylo en diamant. L'imagerie peut également être fait avant Lamelles car il est facile d'orienter et de déplacer les WDs colorés avant qu'ils ne soient fixés sous des lamelles. Avec l'ensemble immunocoloration montage, imagerie Z-stack donne de meilleures images et fournit plus d'informations. Pour prendre des images à partir de différents groupes de traitement, l'exposition doit être maintenue même.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres du groupe d'oncologie gynécologique pour la lecture critique de ce manuscrit. Ce travail est en partie subventionnée par le Conseil australien de la recherche Conseil de recherches médicales de la Santé nationale et, et le cancer Institut NSW (PST). MK est un destinataire de l'Université de Newcastle Postgraduate Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 µm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| phospho-Histone 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | - |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
References
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