Summary
Nós apresentamos um método para isolamento e cultura do duto de Wolff rato (WD). Também demonstramos um procedimento detalhado para toda a imunocoloração monte da cultura / WDs recentemente isolados com anticorpos marcados fluorescentes. Em conjunto, estas técnicas permitem o estudo do desenvolvimento WD, de enrolamento, e a diferenciação.
Abstract
morfogénese tubária é um requisito fundamental para o desenvolvimento da maioria dos órgãos de mamíferos, incluindo o sistema reprodutivo masculino. O epidídimo, parte integrante do sistema reprodutor masculino, é responsável pela estocagem de esperma, maturação e transporte. O epidídimo adulto é um tubo altamente enrolada que se desenvolve a partir de um precursor embrionária simples e direto conhecido como duto de Wolff (WD). enrolamento adequada do epidídimo é essencial para a fertilidade masculina, como o esperma no testículo são incapazes de fertilizar um óvulo. No entanto, o mecanismo responsável pelo desenvolvimento e epididimal de enrolamento permanece pouco clara, parcialmente devido à falta de métodos de cultura de órgãos e de imagem inteiros. Neste estudo, descrevemos um sistema de cultura in vitro e todo o protocolo de imunofluorescência de montagem para visualizar melhor o processo de enrolamento de WD e desenvolvimento, o que pode também ser aplicada ao estudo de outros órgãos tubulares.
Introduction
O sistema reprodutor masculino é composto principalmente de testículo, o local para o desenvolvimento de células germinativas e diferenciação, e um sistema ductal complexo que é necessário para a maturação, de transporte, de armazenamento e de esperma. Epidídimo é um órgão tubular que liga testículo com vasos deferentes e, principalmente, envolvidos no desenvolvimento pós-testicular e maturação das células germinativas 1. O epidídimo altamente enrolados do rato adulto desenvolve a partir de um tubo simples e direto precursor, duto de Wolff (WD) 1. A estrutura complexa e enrolada de epidídimo é essencial para o esperma para adquirir a capacidade de fertilizar células germinativas femininas 2. Como tal órgão essencial para a fertilidade masculina e desenvolve fica em forma não é bem compreendido. Várias vias de sinalização foram mostradas para ser envolvido no desenvolvimento de WD, tais como a via de sinalização Wnt 3,4 e o androgénio via da 5 sinalização. Nosso trabalho recente estabeleceu a exigência de balANCED Wnt sinalização para WD enrolamento durante o desenvolvimento pré-natal 4. No entanto, mais estudos são necessários para entender os mecanismos envolvidos no enrolamento pós-natal do epidídimo, diferenciação celular, e comunicação célula-célula dentro do epitélio do epidídimo e com células intersticiais.
Modelos de ratos geneticamente modificados têm sido provado ser uma poderosa ferramenta para a identificação / validação dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e doenças de diversos sistemas de órgãos 6. Apesar de sua ampla utilização, existem limitações significativas de modelos de ratos geneticamente modificados, incluindo o fenótipo imprevisíveis de ratos mutantes alvo com relação à função do gene presumido, e nenhum fenótipo em mutantes nulos em alguns modelos, a influência de fatores genéticos e ambientais, trabalho intensivo e demorado processo de desenvolvimento de modelos de ratinho. Portanto, a interpretação do significado dos resultados apenas dos geneticamente modimodelos ficados rato nem sempre é simples 6. Estas limitações podem ser superadas utilizando em sistema de cultura de órgãos in vitro que nos dá a flexibilidade de manipular múltiplas vias de sinalização em tempo real, em condições de cultura controladas. Sistema de cultura de órgãos é fundamental para a compreensão da fisiologia e patologia dos órgãos inteiros 7. Além disso, a imagiologia de órgãos inteiros coradas com anticorpos etiquetados fluoróforo nos permite visualizar os marcadores de interesse num contexto tridimensional, tal como existe in vivo, proporcionando assim uma melhor compreensão da forma do órgão, estrutura, função e 8.
Aqui, descrevemos os métodos para isolamento de rato cumes gonadal embrionárias, a cultura in vitro e toda imagem imunofluorescência monte da WDS, que podem ser aplicados para responder a uma variedade de questões relativas à morfogênese de órgãos tubulares, tais como WDS. Neste protocolo,isolado de rato embrionário pregas genitais de 15,5 dias post coitum (DPC) vacas prenhes e cultivaram-durante 3 d seguido de imunocoloração para um marcador das células epiteliais (citoqueratina 8, CK8), um marcador de proliferação celular (fosfo-Histona 3, PH3) e activa βcatenin.
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Protocol
cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as orientações do Comitê de Cuidados e Ética Animal da Universidade de Newcastle e confirmou à Lei New South Wales animal Research, Nova Gales do Sul Regulamento Research Animal, eo código da Austrália para o cuidado e utilização de animais para fins científicos. Todos os procedimentos realizados em ratos foram aprovados pelo Comitê Cuidados e Ética Animal da Universidade de Newcastle.
1. Tempo Acasalamento
- Par 6 - 8 semanas de idade do sexo masculino e do sexo feminino ratos um pouco antes do final do ciclo de luz do dia.
- Verificar as fêmeas para a presença de tampões vaginais de manhã cedo (em ou antes de 08:00), todos os dias. Dia do plugue é considerado como 0,5 dpc.
- Transferir a fêmea com plug vaginal em uma nova gaiola (sem masculino) e rotular a data da tomada.
2. Isolamento de rato embrionárias Gonadais Ridges
- Isolar embryon ratoic cristas gonadais de 15,5 dpc fêmeas grávidas como descrito em 9, com algumas modificações como descrito em baixo.
- Realizar dissecção antes do meio-dia como o tempo de fêmeas grávidas são consideradas para entrar no dia seguinte da gravidez pela tarde.
- Sacrifício 15,5 DPC fêmeas grávidas que usam deslocamento cervical (ou de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da institucional).
- Mantenha o mouse sobre as suas costas em um papel absorvente absorvente e pulverizar o lado ventral do abdômen com etanol 70%.
- Levante a pele abdominal inferior (lado ventral) com uma pinça e fazer uma incisão lateral usando uma tesoura cirúrgica, que se estende desde a abertura urogenital até o fim para caixa torácica. Puxar a pele para a cabeça do animal para expor o abdômen.
- Corte os músculos abdominais com uma tesoura cirúrgica para expor a cavidade peritoneal. Pegue o útero grávido com uma pinça pouco acima do colo do útero e fazer um corte. Agora, levante o útero, segurando em to da bexiga urinária e cortar o ligamento largo do útero seguido por cortes nas junções uterotubal destacar útero do anexo peritoneal.
- Transferir o útero para um tubo de 50 mL contendo HBSS gelada (Solução Salina Equilibrada de Hank). Lavar o útero grávido suavemente com HBSS arrefecido em gelo para remover o excesso de sangue.
- Manter o útero de uma placa de Petri contendo HBSS arrefecido com gelo e manter em gelo. Corte a parede uterina e tirar os embriões. Manter os embriões numa placa de Petri fresca com HBSS em gelo.
- Pegue um papel de seda estéril limpo e colocá-lo em uma nova placa de Petri. Spray de etanol a 70% sobre o papel de tecido. Mantenha embrião sobre este papel de tecido na face lateral e cortá-la de abdômen inferior utilizando uma lâmina estéril na direção mostrada pela linha pontilhada na Figura 1.
- Corrigir o embrião em uma base de esponja esterilizada fixando a coluna vertebral.
- Colocá-lo sob o microscópio estereoscópico de dissecação e cuidadosamente cortada ao longo da linha média ventral. Remover o fígado e intestinos. O sistema do mouse urogenital (rim, ureter, testículos, WD e canal deferente) deverão ser agora visíveis.
- Recorte o testículo e WD, mantendo-os num prato fresco Petri com HBSS, em gelo. Para tirar o WD e testículos, cortar os canais deferentes perto de seu apego à uretra e cortar a ligação da porção inferior do WD de gubernaculum.
- Reúnem-se os testículos e WDs a partir dos embriões do mesmo grupo (pode variar de acordo com o plano experimental).
3. Cultura de Embryonic gonadal Ridges (Figura 2)
- Preparar o meio para a cultura das cristas gonadais embrionárias, completando DMEM / F12 com 10% de FBS (Soro Fetal Bovino), 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de L-glutamina. Aquece-se a meios para 37 ° C num banho de água.
- Adicionar 300 uL de meios de comunicação por poço de uma placa de cultura celular de 24 poços.
- Pegue um prato Petri fresco e colocar uma pequena gota de HBSS estéril nele. Coloque uma membrana de policarbonato trilha etch (0,881; m) nesta gota de HBSS com a sua superfície brilhante virada para o HBSS.
- Utilizando uma pinça limpa colocar dois WDs e gônadas na membrana (em sua superfície áspera, voltada para cima) e remova a quantidade máxima de HBSS usando lenços estéreis / papel absorvente. Não toque o tecido com papel absorvente; caso contrário, irá danificar o tecido.
- Certifique-se de que nem os WDs nem as gónadas estão tocando um ao outro. Caso contrário, eles vão ficar juntos durante a incubação subsequente.
- Transferir a membrana com os tecidos do poço de uma placa de 24 poços contendo meio de cultura de 300 mL e a cultura los na interface ar-meio. meio de cultura muito em membranas resulta em um crescimento cística do WDS.
- Incubar a placa a 37 ° C incubadora, na presença de 5% de CO 2.
- Alterar o meio de cultura todos os dias. Para alterar a forma, com a pipeta, retire a forma do poço primeiro e, em seguida, adicionam-se 300 uL do meio fresco pré-aquecido.
Nota:Para estudar o efeito de diferentes vias de sinalização na morfogénese WD, activadores e / ou inibidores químicos às concentrações requeridas podem ser adicionados ao meio de cultura. - Cultura tecidos para 3 d. Dentro de 3 d, WDs desenroladas recolhidos a partir de um embrião dpc 15,5 transformar em tubos altamente complicadas (Figura 3B). A adição do inibidor de Wnt, IWR1, resulta em inibição da WD bobinamento (Figura 3C).
- Para a colheita destes tecidos tomar uma placa de Petri com PBS gelado. Transferir a membrana com gônadas culta e WD na placa de Petri. A membrana irá flutuar no PBS. Pressione a membrana para afundá-lo em PBS e tirar a gônada e WD.
- Fixar os tecidos com 4% de paraformaldeído (PFA) O / N a 4 ° C ou durante 1 h à TA. Se necessário, tomar as imagens de campo claro de WDS antes da fixação.
4. Imunofluorescência Monte Whole
- Lava-se a tecidos fixados 3x com PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) com agitação lenta, de 10 minutos cada, à temperatura ambiente.
- Desidratar os tecidos numa série graduada de etanol (25%, 50%, 75% e 100%), 10 min cada, a 4 ° C, com balanço lento (~ 30 rpm). Neste passo, os tecidos podem ser armazenadas a 4 ° C em 75% de etanol.
- Para alterar o etanol, manter os tecidos não perturbadas por 2 min e deixe os tecidos se acalmar. Tome-se como muito sobrenadante quanto possível e, em seguida, adicione a maior concentração próxima de etanol. Para evitar qualquer dano aos tecidos, a ponteira não deve tocar os tecidos em qualquer fase.
- Após desidratação, a re-hidratar os tecidos numa série graduada de etanol (100%, 75%, 50% e 25%), 10 min cada, a 4 ° C, com agitação lenta.
- Lavar os tecidos com PBS-T (PBS + 0,1% de Triton X-100), 4x, 20 minutos cada, à RT, com agitação suave (~ 30 rpm).
- Bloquear os tecidos durante 1 h à temperatura ambiente com tampão de bloqueio (PBS + BSA a 1% + 0,2% de leite seco sem gordura em pó + 0,3% de Triton X-100).
- afteR bloqueio, transferir os tecidos a solução de anticorpo primário (diluído em tampão de bloqueio) e incubar O / N a 4 ° C com agitação suave (~ 30 rpm). As diluições dos anticorpos primários utilizados são descritos na Tabela Materiais.
- No dia seguinte, lavar tecidos com PBS-MT (PBS + 2% de leite magro em pó seco + 0,5% de Tween-20), 4x, 30 minutos cada, à RT, com agitação suave (~ 30 rpm).
- Após este passo de lavagem, adicionar o anticorpo secundário, a uma diluição de 1: 250 (Este passo necessita de optimização para anticorpos individuais) em tampão de bloqueio e incubar durante 1 h, à RT, com agitação suave.
- De agora em diante, manter os tecidos cobertos com folha de alumínio para evitar a exposição à luz como anticorpos secundários são rotuladas com fluoróforos sensíveis à luz.
- Lavar os tecidos 3x com PBS-T (PBS + 0,1% de Tween-20), 30 min cada, com agitação suave.
- Preparar lâminas para a montagem dos tecidos manchados.
- Para isso, cortar as lamelas de vidroem tiras finas usando uma caneta de diamante e ficar duas tiras de um sobre o outro na lâmina de vidro usando esmalte de unhas. Adicione dois limites e tecidos lugar entre estes dois limites.
- Adicionar DAPI contendo meio de montagem e colocar uma lamela. Aplicar esmalte nos cantos da lâmina de cobertura para corrigi-lo ao slide.
Nota: Os tecidos estão agora prontos para a imagem latente. Armazenar esses slides a -20 ° C.
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Representative Results
Durante o desenvolvimento, o WD sofre alterações significativas no qual um tubo simples e direto é transformado em um duto altamente complexo e enrolada. Utilizando os métodos descritos acima, o WDS sofrer uma transformação similar em condições de cultura. Aqui temos mostrado os resultados de WDs cultivadas durante 3 d (Figura 3). Para dissecar os mecanismos moleculares envolvidos na morfogénese WD, o meio de cultura pode ser suplementado com inibidores e activadores, dirigidos a diferentes vias de sinalização. A Figura 3C mostra desenrolado WD após 3 d de cultura na presença do inibidor específico de sinalização Wnt, IWR1 10. Setas marcam enrolada (Figura 3B) e desenrolado WDs (Figuras 3A e C) indica que a supressão da via de sinalização Wnt resultados na inibição da WD bobinamento (Figura 3C). Assim, este sistema de cultura pode ser usado para dissecar os mecanismos moleculares envolvidos durante o desenvolvimento do WDS (ou outros órgãos).
Para rotular diferentes tipos de células, foi realizada toda a imunocoloração de montagem em WDs (Figura 4). Aqui nós apresentamos os dados de validação do uso deste protocolo para citoesqueleto rotulagem, citoplasmática, e as proteínas nucleares. A Figura 4A representa a citoqueratina 8 imunocoloração do WDS (CK8, um marcador de células epiteliais) (marcado por uma seta) em cultura durante três dias. Temos também aplicado o mesmo protocolo para avaliar a proliferação celular por imunocoloração para PH3 (fosfo-Histona 3, um marcador de proliferação de célula). Figura 4B mostra uma imagem representativa de toda PH3 imunocoloração montagem. pontos verdes marcados por uma seta representam PH3 células daí proliferam positivos. A Figura 4C mostra imunocoloração para β-catenina ativa em WDs recém-isoladas de 18,5 embriões de camundongos dpc. O controlo negativo (controlo de IgG) na Figura 4D mostra nenhuma coloração. Esses resultados evidenciama robustez de todo este protocolo de montagem imunocoloração, que também pode ser usado para muitos anticorpos diferentes.
Figura 1. Ilustração do local da incisão para o isolamento das gônadas embrionárias de 15,5 dpc embrião. A linha pontilhada branca marca o local para fazer uma incisão em um embrião de 15,5 dpc para isolar pregas genitais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Diagrama de fluxo descrevendo procedimento passo a passo para a cultura de órgãos. Por favor clique aqui para view uma versão maior desta figura.
Figura 3. normal WD morfogênese em condições de cultura. (A) testículo e WD isolado a partir de 15,5 dpc embrião. (B) Coiled WD após 3 d a cultura na presença de DMSO (controlo). (C) no WD enrolamento foi observada com o tratamento IWR1 (um inibidor de Wnt). Seta marca WD; t, marca testículo. Barras igual a 100 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Total montagem imunomarcação do WDS. (A - B) imunocoloração montagem inteira de WDs isolaTed de embriões 15,5 dpc e cultivadas durante 3 d para CK8 (A) e PH3 (B). (C) Ativo βcatenin toda imunofluorescência montagem no WD isolado de 18,5 dpc embrião. (D) Controle negativo (controle de IgG) para βcatenin ativa em 18,5 dpc WD mostrando nenhuma coloração. Arrow marcas enroladas WD; t, marca testículo. Barras igual a 100 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O sistema de cultura de órgãos tem muitas vantagens sobre o sistema de cultura celular tradicional. Este sistema retém as relações estruturais originais e as interacções entre diferentes tipos de células. Ele imita em sistemas in vivo e dá informações mais precisas do que os estudos de cultura de células, onde o fator de nicho está ausente. A utilização de sistemas de cultura de órgãos mesmo tem vantagens sobre o uso de todo o animal. Estes incluem o custo mais elevado de utilização de todo o animal, fácil cuidado e manutenção do sistema de cultura de órgãos, etc. Além disso, vários agentes farmacológicos ou drogas podem ser testados em órgãos isolados / cultivadas e resposta direta do órgão e não a todo o corpo pode ser estudou.
Há vários passos críticos que precisam ser considerados para a cultura bem sucedida de WDs embrionárias. Os tecidos devem ser recolhidos cuidadosamente sem danificar a sua integridade, como tecidos danificados não crescem bem e tornar-se cística. O excesso de meios de comunicação no topo dafiltro também leva a um crescimento cística do WDS. Realizamos o isolamento e cultura de tecidos fora da capa de cultura de tecido sem qualquer contaminação. O meio de cultura foi preparada e adicionada a placas de 24 poços no interior do exaustor de cultura de tecidos. Portanto, usando a técnica adequada, trabalhando rapidamente e tomar as precauções necessárias, o WDS recolhidos fora do tecido capa de cultura pode ser cultivada sem qualquer contaminação. Enquanto a colheita dos tecidos em cultura, deve ser tomado cuidado uma vez que são muito frágeis e não deve ser agarrado com uma pinça directamente. Os tecidos devem em vez disso ser apanhada numa película fina de PBS que se forma entre os dois braços de pinça.
Temos também descrito um procedimento de imunofluorescência montagem inteira detalhada neste manuscrito. imaging Z-pilha de tecidos após toda coloração montagem usando microscopia confocal ou estereoscopia dá uma vantagem para a seção através de todo o tecido, sem cortes seriados e coloração vários slides. Assim, dá uma idéia melhor dea localização da expressão de proteínas alvo. penetração anticorpo é difícil em tecidos com elevada teor de matriz de fibra / extracelular, resultando em um sinal mais baixo. Mais permeabilização e aumento da duração da incubação com os anticorpos primários pode ser útil em tais casos. A outra desvantagem de toda a coloração de montagem é que a resolução em um nível única célula é difícil de alcançar e pode precisar de objetivos especiais / microscópios. Foi realizada uma ambos H e S / N de fixação em PFA a 4% e verificaram que esses métodos funcionou bem para a maioria dos anticorpos testados no nosso laboratório incluindo CK8, PH3, e anticorpos βcatenin activas. Temos também colocalized com sucesso CK8 com PH3 ou βcatenin ativa. Para co-localização, os anticorpos primários para ambos os marcadores foram adicionados simultaneamente. Estes anticorpos devem ser criados em diferentes espécies. Durante todo o processo de imunofluorescência montagem, maior cuidado deve ser tomado ao adicionar ou remover soluções como os tecidos pode ser easily elaborado para a pipeta ponta da pipeta / transferência e ficar preso ao plástico. Para evitar isso, alterar soluções com uma ponta de pipeta de 200 mL sob um microscópio de dissecção ou estereoscópio e deixar um pouco de solução na parte inferior de tubos. Recomendamos recolher as soluções residuais em um copo de vidro transparente limpo. Depois de cada mudança de solução, contar o número de tecidos no interior dos tubos sob um estereoscópio. Em caso de perda acidental de tecidos, que pode ser recuperada a partir do copo de vidro. Pontas de pipeta utilizados para a transferência de soluções nunca deve tocar os tecidos como isso irá danificar os tecidos e deixá-los impróprios para a imagem latente.
Para a montagem WDS manchadas, utilizou-se lâminas de cavidade como a colocação de lamelas directamente no topo do WDS pode comprimi-los e distorcer sua morfologia. Dependendo da espessura dos tecidos, a profundidade da cavidade pode ser facilmente manipulada variando o número de tiras de lamelas utilizados. Este método de Preparados de slidesn é econômico, pois requer apenas lamínulas e uma caneta de diamante. De imagem também pode ser feito antes lamínulas como é fácil de orientar e mover os WDs manchadas antes que eles são fixos sob lamelas. Com toda a imunocoloração montagem, imagem latente Z-stack dá melhores imagens e fornece mais informações. Para obter imagens de diferentes grupos de tratamento, a exposição deve ser mantido mesmo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer aos membros do grupo de oncologia ginecológica para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é em parte suportado pelo financiamento do National Health and Medical Research Council, o Conselho Australiano de Pesquisas, eo Cancer Institute NSW (PST). MK é um receptor da Universidade de Newcastle Postgraduate Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 µm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| phospho-Histone 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | - |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
References
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