Summary
Biz fare Wolf kanalı (WD) izolasyonu ve kültürü için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlarla kültürlü / taze izole Wigner tüm montaj immün için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte, bu teknikler WD geliştirme, sarma ve farklılaşma çalışma sağlar.
Abstract
Tubal morphogenesis erkek üreme sistemi dahil olmak üzere pek çok memeli organların gelişimi için temel bir gerekliliktir. epididimis, erkek üreme sisteminin ayrılmaz bir parçası, sperm depolama, olgunlaşması ve ulaşım sorumludur. yetişkin epididimis Wolf kanalı (WD) olarak bilinen basit ve düz embriyonik habercisi gelişir oldukça sarmal tüp. testiste sperm oosit döller edemiyoruz olarak epididimin uygun kıvrılma, erkek doğurganlık için esastır. Ancak, epididimal geliştirme ve sarma sorumlu mekanizma kısmen tüm organ kültürü ve görüntüleme yöntemlerinin eksikliği, belirsizliğini koruyor. Bu çalışmada, biz daha iyi diğer boru şeklindeki organları incelemek için uygulanabilir WD sarma ve geliştirme, sürecini görselleştirmek için bir in vitro kültür sistemi ve tüm montaj immünofloresan protokol açıklar.
Introduction
Erkek üreme sistemi öncelikle testis oluşur, germ hücre gelişimi ve farklılaşmasında ve sperm olgunlaşması, ulaşım ve depolama için gerekli olan karmaşık bir duktal sistemi için site. Epididimis vas deferens ile testis ve germ hücrelerinin 1 post-testiküler gelişim ve olgunlaşma ağırlıklı olarak yer bağlayan bir boru şeklinde bir organdır. Çok sarmal yetişkin fare epididimis basit ve düz habercisi tüp, Wolf kanalı (WD) 1 gelişir. Sperm dişi germ hücrelerinin 2 dölleme kapasitesini elde etmek için epididimin karmaşık ve kangal yapısı esastır. erkek doğurganlık için böyle önemli bir organı şekline geliştirir ve alır ne kadar iyi anlaşılamamıştır. Çeşitli sinyal yolları gibi Wnt 3,4 ve yol 5 sinyal androjen olarak WD gelişiminde rol gösterilmiştir. Bizim son çalışmalar bal ihtiyacını kurmuşturanced Wnt doğum öncesi gelişim 4 sırasında WD sarma için sinyalizasyon. Ancak, ileri çalışmalar epididimal epitel içinde ve interstisyel hücreler ile doğum sonrası epididimal sarma, hücresel farklılaşma ve hücre-hücre iletişimi yer alan mekanizmaları anlamak için gereklidir.
Genetiği değiştirilmiş fare modelleri, çeşitli organ sistemlerinin 6 gelişimini ve hastalığın altında yatan moleküler mekanizmaların tanımlanması / onaylama için güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. geniş kullanılmasına rağmen, tahmin gen fonksiyonu açısından hedeflenen fare mutantlar öngörülemeyen fenotip ve bazı modellerde boş mutantlar hiçbir fenotip, genetik ve çevresel faktörlerin etkisiyle, emek yoğun ve dahil olmak üzere genetiği değiştirilmiş fare modelleri önemli kısıtlamalar vardır zaman alıcı fare modellerinin geliştirilmesi süreci. Bu nedenle, sadece genetik olarak modi gelen bulguların önemi yorumlanmasığı fare modelleri, her zaman 6 kolay değildir. Bu kısıtlamalar, bize kontrol kültür koşulları gerçek zamanlı olarak birden fazla sinyalleme yolunu değiştirmek için esneklik sağlar nitro organ kültür sisteminde kullanılarak aşılabilir. Organ kültürü sistemi bütün organların 7 fizyolojisini ve patolojisi ile ilgili vesile oluyor. Böylelikle organın şekil, yapı ve işlev 8 daha iyi anlaşılmasını sağlayan in vivo koşullarında varolduğu Dahası, florofor etiketli antikor ile boyandı Bütün organların görüntüleme, üç boyutlu bir bağlamda ilgi işaretleri görsel olanak sağlamaktadır.
Burada, örneğin WDS ile boru şekilli organ morfojenezi ilgili çeşitli sorulara cevap uygulanabilir fare embriyonik gonadal sırtlar izolasyonu, in vitro kültürü ve WDS'nin bütün montaj immünofloresan görüntüleme yöntemleri tarif etmişlerdir. Bu protokol, biz15.5 gün izole fare embriyonik ürogenital sırtlar coitum (DPC) hamile baraj sonrası ve bir epitel hücre markeri (sitokeratin 8, CK8), bir hücre çoğalması markeri (fosfo-Histon 3, PH3) ve aktif için immün ardından 3 gün boyunca onları kültüre βcatenin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan bakım ve deneysel prosedürler Yeni Güney Galler Hayvan Araştırmaları Yasası, Yeni Güney Galler Hayvan Araştırmaları Yönetmeliği ve bakımı için Avustralya kodu ve Newcastle Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik Kurul kurallarına uygun olarak yapılmış ve teyit edilmiştir bilimsel amaçlarla hayvanların kullanımı. Fareler üzerinde yapılan tüm işlemler Newcastle Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. Zaman Çiftleşme
- Çifti 6-8 haftalık erkek ve gündüz döngüsünün sonuna hemen önce dişi fareler.
- Vajinal fişler varlığı sabah erken (veya 8.00 önceki AM), her gün için dişileri kontrol edin. fişin Gün 0.5 DPC olarak kabul edilir.
- (Erkek olmadan) yeni bir kafes içine vajinal fişi ile kadın aktarın ve fiş tarihini etiket.
Fare Embriyonik Gonadal Ridges 2. izolasyonu
- Fare embryo yalıtmakAşağıda tarif edildiği gibi 15.5 DPC hamile kadınlarda IC gonadal sırtlar bir kaç değişiklik ile, 9'da tarif edildiği gibi.
- Hamile kadın öğleden sonra gebeliğin ertesi gün içine girmek için kabul edilir zaman olarak öğleden önce diseksiyonu yürütmek.
- servikal dislokasyon kullanarak 15.5 DPC hamile kadın Kurban (ya da kurumsal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış protokole göre).
- Emici kağıt mendil sırtını fare tutmak ve% 70 etanol ile karın ventral tarafında püskürtün.
- göğüs kafesi sonuna kadar ürogenital açıklık uzanan, forseps ile alt karın cildi (ventral tarafı) kaldırın ve cerrahi makas kullanarak lateral kesi yapmak. karın ortaya çıkarmak için hayvan başına doğru cilt çekin.
- periton boşluğuna maruz cerrahi makas ile karın kaslarını kesin. sadece rahim ağzı üzerinde forseps ile gebe rahim tut ve bir kesim yapmak. Şimdi t tutarak rahim kaldırıno mesane ve periton ekten rahim ayırmak için uterotubal kavşaklarda kesim tarafından takip rahim geniş ligament kesti.
- buz soğukluğunda HBSS (Hank dengeli tuz çözeltisi) ihtiva eden bir 50 ml tüp içine rahim aktarın. Aşırı kan çıkarmak için buz gibi soğuk HBSS ile nazikçe gebe uterusu yıkayın.
- buz HBSS içeren bir Petri kabındaki rahim tutmak ve buz üzerinde tutmak. rahim duvarına kesin ve embriyoların çıkar. buz üzerinde HBSS ile yeni bir Petri kabındaki embriyoların tutun.
- Temiz, steril kağıt mendil alın ve yeni bir Petri kabı üzerine koydu. Kağıt mendil% 70 etanol püskürtün. Yan tarafında, bu kağıt mendil embriyo edin ve Şekil 1 'de noktalı çizgi ile gösterilen bir yönde, steril bir bıçak kullanarak alt karın kesti.
- vertebra sütun iğneleyerek steril sünger kaide üzerinde embriyo sabitleyin.
- Diseksiyon stereomicroscope altında yerleştirin ve dikkatlice ventral orta hat boyunca kesilir. karaciğer ve bağırsakları çıkarın. Fare ürogenital sistem (böbrek, üreter, testis, WD ve vas deferens) artık görünür olmalıdır.
- testis ve WD kesip, ve buz üzerinde, HBSS ile yeni bir Petri kabı tutun. WD ve testis çıkarmak, üretra onun eki yakın vas deferens kesip gubernakulum gelen WD alt kısmının eki kesti.
- Aynı grubun embriyolar (Bu deneysel plan uyarınca değişebilir) dan testisler ve WDS Havuz.
Embriyonik Gonadal Ridges 3. Kültür (Şekil 2)
- % 10 FBS (Fetal Sığır Serumu),% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin ile DMEM / F12 ilave embriyonik gonadal sırtlar kültürlenmesi için hazırlarlar. Bir su banyosu içinde 37 ° C'ye kadar ortam ısıtın.
- 24-iyi hücre kültür plakası kaynağı başına ortam 300 uL ekleyin.
- taze Petri plaka almak ve üzerinde steril HBSS küçük bir damla koyun. (0,8 bir polikarbonat parça rölyef membran koymak81; onun parlayan yüzeyi HBSS bakan ile HBSS bu damla m).
- Kullanarak temiz forseps (yukarı bakacak şekilde, kendi pürüzlü yüzey üzerine) membran üzerinde iki WDS ve gonadlar koymak ve steril mendil / emici kağıt kullanarak HBSS maksimum miktarını çıkarın. Emici kağıt ile doku dokunmayın; Aksi takdirde, bu dokuya zarar verecektir.
- WDS ne gonadlar ne birbirlerine dokunmadan emin olun. Aksi takdirde, bunlar sonraki kuluçka sırasında birlikte sopa olacak.
- Hava orta arayüzü 300 uL kültür ortamı ve kültürü bunları ihtiva eden 24 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğu içinde doku ile membran aktarın. Wigner bir kistik büyüme membranlar sonuçları üzerinde çok fazla kültür ortamı.
- % 5 CO2 varlığında 37 ° C inkübatör inkübe plakası.
- Her gün kültür ortamı değiştirin. pipet ile orta değiştirmek için, iyi ilk gelen orta kaldırmak ve daha sonra önceden ısıtılmış taze ortam 300 mcL ekleyin.
Not:WD morfojenezi farklı sinyal yollarının etkisinin araştırılması için, gerekli konsantrasyonlarda kimyasal aktivatörler ve / veya inhibitörler, kültür ortamına ilave edilebilir. - Kültür 3 gün boyunca dokular. 3 gün içinde, 15.5 DPC embriyo toplanan kıvrıldığı WDS çok dolambaçlı tüpleri (Şekil 3B) dönüşüyor. Wnt inhibitörü IWR1 eklenmesi kıvrılma WD (Şekil 3C) inhibisyonu ile sonuçlanır.
- hasat için bu dokular buz gibi soğuk PBS ile bir Petri kabı alır. Petri plaka içine kültürlü gonad ve WD membran aktarın. Membran PBS üstünde yüzer. PBS içinde lavabo ve gonad ve WD çıkarmak membran basın.
- 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4'lük paraformaldehit (PFA) O / N ile dokuları düzeltildi. Gerekirse, tespitten önce Wigner aydınlık alan görüntüleri çekmek.
4. Tüm Dağı İmmünofloresan
- Yıkama sabit dokular PBS-T (PBS +% 1 ile 3 kezOda sıcaklığında, yavaş sallama, 10 dakika her biri, Triton X-100).
- Yavaş sallanan (~ 30 rpm) ile, 4 ° C'de, etanol (% 25,% 50,% 75 ve% 100), 10 dakika her biri bir kademeli dizi doku kurutmak. Bu adımda, dokular% 75 etanol içinde 4 ° C'de saklanabilir.
- , Etanol değiştirmek 2 dakika süreyle rahatsız dokuları tutmak ve izin vermek için dokular yerleşmek. Mümkün olduğu kadar supernatant çıkar ve daha sonra etanol bir üst konsantrasyonu ekleyin. dokulara zarar görmemesi için, pipet ucu herhangi bir aşamada dokuları temas etmemelidir.
- dehidratasyon sonra yavaş çalkalanarak, 4 ° C'de, etanol (100,% 75,% 50 ve% 25%), 10 dakika, her bir kademeli dizi doku rehidrate.
- yumuşak sallanan (~ 30 rpm) ile, oda sıcaklığında PBS-T (PBS +% 0.1 Triton X-100), 4 kere, 20 dakika her biri ile dokuların yıkayın.
- Blokaj tamponu ile oda sıcaklığında 1 saat için dokular bloğun (PBS +% 1 BSA +% 0.2 yağsız kuru süt tozu +% 0.3 Triton X-100).
- afteR bloke edici (blokaj tamponu içinde seyreltilmiş) birincil antikor çözeltisine dokuları transferi ve yumuşak sallanan (~ 30 rpm) ile 4 ° C 'de O / N inkübe edin. Kullanılan birincil antikorlar seyreltileri malzemeler Tablo l'de tarif edilmektedir.
- Sonraki gün, bir hafif sallanan (~ 30 rpm) ile, oda sıcaklığında PBS-MT (PBS +% 2 yağsız kuru süt tozu +% 0.5 Tween-20), 4x, 30 dakika her biri ile dokuların yıkayın.
- hafifçe çalkalanarak, bloke edici tampon içinde 250 (Bu adım, bireysel antikorlar için optimizasyon ihtiyacı) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe Bu yıkama aşamasından sonra, 1 'deki bir seyreltmede ikincil antikor ilave edin.
- Şimdi itibaren ikincil antikorlar ışığa duyarlı fluorophores etiketli olarak ışığa maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile kaplı dokuların tutmak.
- dokular hafifçe çalkalanarak, PBS-T (PBS +% 0.1 Tween-20), 30 dakika her biri ile 3 kez yıkanır.
- lekeli dokuları montajı için slaytlar hazırlayın.
- Bunun için, cam kapak fişleri kestive bir elmas kalem kullanarak ince şeritler halinde iki şerit çivi emaye kullanarak cam slayt diğeri üzerinde bir sopa. Bu iki sınırları arasında iki sınırları ve yeri dokuları yapın.
- DAPI içeren montaj orta ekleyin ve bir kapak kayma koymak. slayt bunu düzeltmek için kapak kayma köşelerinde tırnak emaye uygulayın.
Not: Dokular artık görüntüleme için hazır. -20 ° C'de bu slaytları saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
gelişimi sırasında, WD basit ve düz tüp son derece karmaşık ve sarmal kanal dönüşür, burada önemli değişikliklere uğrar. Yukarıda tarif edilen yöntemler kullanılarak, WDS kültür koşulları benzer bir dönüşüm geçirmektedir. Burada 3 gün (Şekil 3) kültürlendi Wigner sonuçları göstermiştir. WD morfolojilerinden rol oynayan moleküler mekanizmaları incelemek için, kültür ortamı farklı sinyal yollarını hedef alan inhibitörleri ve aktivatörleri ile takviye edilebilir. Şekil 3C, belli inhibitörü IWR1 10 sinyal Wnt mevcudiyetinde kültür 3 gün sonra, WD çekilerek gösterir. Oklar (Şekil 3B) sarılması ve sarma WD (Şekil 3C) inhibisyonu Wnt sinyal sonuçlarının bu bastırma gösteren WDS (Şekil 3A ve C) çekilerek işaretleyin. Bu durumda, bu kültür sistemi devel sırasında yer moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilirWigner ve opment (ya da diğer organlar).
Farklı hücre tiplerini etiketlemek için, biz Wigner üzerinde tüm montaj immün (Şekil 4) uygulandı. Burada etiketleme sitoskeletal, sitoplazmik ve nükleer proteinler için bu protokolün kullanımını doğrularken verileri sunmak. Şekil 4A sitokeratin, üç gün süre ile kültüre (bir ok ile işaretlenmiştir) 8 (CK8, epitel hücrelerinin bir işareti) WDS'nin immün temsil eder. Biz de PH3 (fosfo-Histon 3, bir hücre çoğalması belirteci) için immün hücre çoğalmasını değerlendirmek için aynı protokolü uyguladık. Şekil 4B PH3 tüm montaj immün temsili bir görüntüsünü gösterir. bir okla yeşil noktalar PH3 pozitif dolayısıyla çoğalan hücreleri temsil etmektedir. Şekil 4C taze 18.5 DPC fare embriyoları izole Wigner aktif β-katenin için immün gösterir. Şekil 4D'de negatif kontrol (IgG kontrolü) hiç bir lekelenme gösterir. Bu sonuçlar vurgulamakAyrıca, bir çok farklı antikorlar için kullanılabilir, bu bütün montaj immün protokolü sağlamlığı.
15.5 DPC embriyo embriyonik gonad izolasyonu için kesi sitenin 1. İllüstrasyon Şekil. beyaz noktalı çizgi ürogenital sırtlar izole etmek için bir 15.5 DPC embriyo bir kesi yapmak için siteyi işaretler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Organ kültürü için adım adım prosedürü açıklayan Şekil 2. akış diyagramı. Vi için lütfen buraya tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu Ew.
Kültür koşullarında 3. Normal WD morfolojilerinden rakam. (A) Testis ve WD 15.5 DPC embriyo izole. (B) Sarımlı WD DMSO (kontrol) varlığında 3 gün kültürden sonra. (C) En WD sarma IWR1 tedavisi (Wnt inhibitörü) ile gözlemlendi. Ok WD işaretler; t, testis işaretler. Barlar 100 mikron eşittir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Tüm Wigner ve immün monte edin. (A - B) WDS isola Whole montaj immün15.5 DPC embriyolar Ted ve CK8 (A) ve PH3 (B) 3 gün boyunca kültüre konuldu. WD tüm montaj Immünofloresan βcatenin Aktif (C) 18.5 DPC embriyo izole. Resim lekelenme yok 18.5 DPC WD etkin βcatenin için (D) Negatif kontrol (IgG kontrolü). WD sarmal işaretleri Ok; t, testis işaretler. Barlar 100 mikron eşittir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organ kültürü sistemi, geleneksel hücre kültürü sistemi üzerinde birçok avantajı vardır. Bu sistem, farklı hücre tipleri arasında, orijinal yapısal ilişkiler ve etkileşimler korur. Bu in vivo sistemlerde taklit ve niş faktörü yoktur hücre kültürü çalışmalarında daha doğru bilgi verir. organ kültürü sistemlerinin kullanılması da bütün hayvan kullanımına kıyasla avantajlara sahiptir. Bunlar bütün hayvan, kolay bakım ve organ kültürü sisteminin bakım, vs Ayrıca kullanarak yüksek maliyeti, çeşitli farmakolojik ajanlar veya ilaçlar izole / kültürlü organ ve organ doğrudan yanıt değil tüm vücut olabilir test edilebilir okudu.
embriyonik Wigner başarılı kültürü için dikkat edilmesi gereken birkaç kritik adımlar vardır. hasarlı dokular de büyür ve kistik olmazlar olarak Dokular, kendi bütünlüğünü bozmadan özenle toplanan gerekir. üstünde medyanın aşırıFiltre ayrıca Wigner bir kistik büyümesine yol açar. Biz herhangi bir kirlenme olmadan doku kültürü kaputu dışında doku izolasyonu ve kültürü yapıldı. Kültür ortamı hazırlanır ve doku kültürü kaput içinde 24 oyuklu plakalara ilave edildi. Bu nedenle, uygun tekniği kullanarak hızlı çalışan ve gerekli önlemlerin alınması, doku kültürü kaputu dışında toplanan WDS herhangi bir bulaşma olmadan kültür olabilir. Kültür dokuları hasat birlikte, bakımı çok kırılgandır ve forseps ile doğrudan kaptı olmamalıdır olarak alınmalıdır. Dokular yerine forseps iki kolu arasında oluşan PBS ince bir film aldı edilmelidir.
Biz de bu yazıda detaylı bir bütün montaj immünofloresan prosedürü tarif var. konfokal mikroskopi veya stereoskopi kullanarak tüm montaj boyandıktan sonra dokuların Z-yığını görüntüleme seri kesit ve birden çok slayt boyama olmadan tüm doku yoluyla bölümüne bir avantaj sağlar. Böylece, daha iyi bir fikir verirHedef proteinlerin ekspresyonu konumu. Antikor penetrasyon daha düşük bir sinyal ile sonuçlanan yüksek lif / hücre dışı matris içerikli dokularda zordur. Daha uzun permeabilizasyon ve primer antikorlar ile inkübasyondan artan süresi gibi durumlarda faydalı olabilir. tüm montaj boyama diğer dezavantajı tek hücre düzeyinde çözünürlük elde etmek zordur ve özel hedefler / mikroskoplar gerekebilir olmasıdır. Biz% 4 PFA 1 saat ve O / N fiksasyonu hem gerçekleştirilen ve bu yöntemlerin CK8, PH3 ve aktif βcatenin antikorlar da dahil olmak üzere laboratuvarda test antikorların çoğunluğu için iyi çalıştı bulundu. Biz de başarıyla PH3 veya aktif βcatenin ile CK8 kolokalize var. yardımcı sınırlama için, her iki marker için primer antikorlar, aynı anda eklenmiştir. Bu antikorlar, farklı türlerde yükseltilmelidir. dokular easil olabilir gibi çözümler ekleyerek veya kaldırarak zaman tüm montaj immünofloresan prosedürü sırasında, son derece dikkatli alınmalıdıry Pipet / transfer pipeti içine çekilir ve plastik takılıyorum. Bunu önlemek için, bir stereoskop veya diseksiyon mikroskobu altında bir 200 uL pipet ile çözüm değiştirebilir ve tüplerin alt kısmında çözümün biraz bırakın. Biz temiz, şeffaf cam beher içinde atık çözümleri toplamak öneririz. Her çözüm değişiminden sonra, bir Stereoskop altında tüplerde dokuların sayısını. dokuların yanlışlıkla kaybı durumunda, bunlar bir cam beher elde edilebilir. Bu dokulara zarar ve görüntüleme için uygun onları terk gibi dokuları dokunmak asla çözümleri aktarmak için kullanılan pipet uçları.
lekeli WDS montaj için, onları sıkıştırmak ve morfoloji bozabilmektedir Wigner üstünde doğrudan lamelleri koyarak olarak kavite slaytlar kullanılır. doku kalınlığına bağlı olarak, oyuğun derinliği kolay kullanılan lamel şeritlerin sayısı değiştirilerek kontrol edilebilir. Slayt haz yöntemisadece kapak fişleri ve bir elmas kalem gerektirir n ekonomiktir. Görüntüleme ayrıca yönlendirmek kolaydır ve lamelleri altında sabit önce lekeli WDS hareket olarak coverslipping önce yapılabilir. tüm montaj immün ile Z-yığın görüntüleme daha iyi görüntü verir ve daha fazla bilgi sağlar. Farklı tedavi gruplarından görüntü çekmek için, maruz kalma aynı tutulmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz bu yazının eleştirel okuma için jinekoloji onkoloji grubu üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya Araştırma Konseyi ve Kanser Enstitüsü NSW (PST) fon tarafından desteklenmektedir. MK Newcastle Lisansüstü Araştırma Bursu Üniversitesi bir alıcı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 µm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| phospho-Histone 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | - |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
References
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice. Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).
- Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 9, 283-292 (2005).
- Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling. Dev Biol. 412, 234-249 (2016).
- Murashima, A., et al. Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation. Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development? Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).
- Hirashima, T., Adachi, T. Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development. PLoS One. 10, 0135343 (2015).
- Chan, W. Y., Blomberg, L. A. Germline Development: Methods and Protocols. Methods Mol Biol. 825, (2012).
- Karner, C. M., et al. Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development. Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).
- Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nat Med. 14, 979-984 (2008).
