Summary
我々は、マウスウォルフ管（WD）の単離および培養のための方法を提示します。また、蛍光タグ付けされた抗体を用いて培養/単離されたばかりのWDSのホールマウント免疫染色のための詳細な手順を示しています。一緒に、これらの技術は、WDの開発、コイリング、および分化の研究を可能にします。
Abstract
卵管の形態形成は、男性生殖器系を含むほとんどの哺乳動物の臓器の開発のための基本的な要件です。精巣上体、男性の生殖器官の不可欠な部分は、精子貯蔵、熟成、および輸送を担当しています。大人の精巣上体ウォルフ管（WD）として知られているシンプルかつストレート胚性前駆体から発生する非常にコイル状の管です。精巣内の精子が卵母細胞を受精することができないとして、精巣上体の適切な巻取りは、男性の生殖能力に不可欠です。しかし、精巣上体の開発とコイリングの責任のメカニズムは、部分的に起因し、全器官培養およびイメージング方法の不足のため、不明なままです。本研究では、より良い他の管状器官を研究するために適用することができるWDの巻き取り及び発達のプロセスを可視化するために、インビトロ培養系全体マウント免疫プロトコルを記述する。
Introduction
男性生殖器系は、主に精巣から成る、生殖細胞の発達および分化、および精子の成熟、輸送、および保管のために必要とされる複雑な管システムのためのサイト。精巣上体は、輸精管と精巣および生殖細胞1の後の精巣発達と成熟に主に関与を接続する管状の器官です。高度にコイル状の成体マウスの精巣上体は、シンプルでストレート前駆体管、ウォルフ管（WD）1から開発しています。精子が雌性の生殖細胞2を受精する能力を獲得するための精巣上体の複雑かつコイル構造が必須です。男性の生殖能力のために、このような本質的な臓器の形状に発展し、取得する方法を十分に理解されていません。様々なシグナル伝達経路は、Wntシグナル伝達経路3,4及び経路5シグナリングアンドロゲンとしてWDの発症に関与することが示されています。我々の最近の仕事は、BALの要件を確立しています出生前の開発4時のWDの巻き取り用のとれたWntシグナル伝達。しかし、さらなる研究が出生後の精巣上体のコイリング、細胞分化、および精巣上体上皮内および間質細胞と細胞間コミュニケーションに関与するメカニズムを理解するために必要とされています。
遺伝的に改変されたマウスモデルは、種々の器官系6の開発および疾患の根底にある分子機構の同定/検証のための強力なツールであることが証明されています。その広範な使用にもかかわらず、推定される遺伝子機能にに関して目標とマウス変異体の予測できない表現型、および一部のモデルでヌル変異体で無表現型、遺伝的要因と環境要因の影響を受け、労働集約を含む遺伝子改変されたマウスモデルの重大な限界があり、マウスモデルを開発する時間のかかるプロセス。したがって、唯一の遺伝的改良剤からの所見の意義の解釈fiedがマウスモデルは、常に6簡単ではありません。これらの制限は、我々に制御培養条件下で、リアルタイムで複数のシグナル伝達経路を操作するための柔軟性を提供し、インビトロ器官培養系で使用することによって克服することができます。器官培養系は、全体の臓器7の生理学および病理学を理解することに尽力しています。また、フルオロフォア標識抗体で染色した全器官の画像化は、それによって、臓器の形状、構造、および機能8のより良い理解を提供し、それはインビボで存在するように、三次元の文脈において関心のマーカーを可視化することを可能。
ここでは、そのようなWDSとして管状の器官の形態形成に関するさまざまな質問に答えるためにも適用することができるマウス胚性生殖隆起の単離、 インビトロ培養し、WDSの全体マウント免疫蛍光イメージングのための方法を、記載しています。このプロトコルでは、我々単離したマウス15.5日から胚性泌尿生殖器の尾根ポスト交尾（DPC）妊娠中のダムや上皮細胞マーカーの免疫染色に続いて3日間（サイトケラチン8、CK8）のためにそれらを培養し、細胞増殖マーカー（ホスホ - ヒストン3、PH 3）とアクティブβcatenin。
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Protocol
動物のケアおよび実験手順は、ニューサウスウェールズ州の動物研究法、ニューサウスウェールズ州動物実験規制、およびケアのためのオーストラリアのコードとにニューカッスル大学の動物実験倫理委員会のガイドラインに従って行われ、確認されました科学的な目的のための動物の使用。マウスに着手すべての手順は、ニューカッスル大学の動物実験倫理委員会によって承認されました。
1.タイム交尾
- ペア6から8週齢の雄と昼光サイクルの終了直前に雌マウス。
- 毎日、（8.00 AM日以前に）早朝膣栓の存在のために、女性を確認してください。プラグの日は0.5 DPCとして考えられています。
- （オスなし）新しいケージに膣栓の女性を移し、プラグの日付にラベルを付けます。
マウス胚性生殖隆起の2の単離
- マウスembryonを分離以下に説明するように、いくつかの修正を加えて、9で説明したように15.5 DPC妊娠女性からIC生殖隆起。
- 妊婦が午後による妊娠の次の日に入ると考えられている時のように正午前に解剖を行っています。
- 頸椎脱臼（または施設の動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って）を使用して15.5 DPC妊婦を生け贄に捧げます。
- 吸収性のティッシュペーパーにその背中の上でマウスを維持し、70％エタノールで腹部の腹側をスプレー。
- 鉗子で下腹部の皮膚（腹側）を持ち上げ、手術用はさみを使用して横方向の切開を行い、胸郭の端に泌尿生殖器の開口部から延びます。腹部を露出するように、動物の頭部に向けて肌を引き出します。
- 腹膜腔を公開するために手術用ハサミで腹部の筋肉をカットします。ちょうど子宮頸部上記鉗子で妊娠子宮を取得し、カットをします。今トンに保持することによって子宮を持ち上げます膀胱o及び腹膜アタッチメントから子宮を分離するために子宮卵管接合部でのカットに続いて子宮広間膜をカット。
- 氷冷HBSS（ハンクス液）を含む50 mLのチューブに子宮を転送します。過剰な血液を除去するために、氷冷HBSSで優しく妊娠子宮を洗ってください。
- 氷冷HBSSを含むペトリ皿に子宮を維持し、氷上に置きます。子宮壁を切り取り、胚を取り出します。氷上でHBSS新鮮なペトリ皿に胚を保管してください。
- きれいな滅菌ティッシュペーパーを取り、新しいペトリ皿の上に置きます。ティッシュペーパーで70％エタノールをスプレー。側面でこのティッシュペーパーで胚を維持し、 図1に点線で示すように方向に滅菌ブレードを使用して、下腹部からそれをカット。
- 脊柱を固定することによって、滅菌スポンジベースで胚を修正しました。
- 解剖実体顕微鏡下でそれを置き、慎重に腹側正中線に沿って切断。肝臓と腸を削除します。マウス泌尿生殖器系（腎臓、尿管、精巣、WD、および輸精管）が表示されるようになるはずです。
- 精巣およびWDを切り取り、そして氷上で、HBSSで新鮮なペトリ皿に保管。 WDおよび精巣を取り出し、尿道への取り付けに近い輸精管を切断し、導帯からWDの下部の添付ファイルをカット。
- （これは実験計画に従って変更される場合があります）同じグループの胚からの精巣およびWDSをプール。
胚性生殖隆起の3.文化（図2）
- 10％FBS（ウシ胎児血清）、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％L-グルタミンを含むDMEM / F12を補うことにより、胚生殖隆起を培養するための培地を調製します。水浴中で37°Cにメディアを温めます。
- 24ウェル細胞培養プレートのウェルあたり培地300μLを加えます。
- 新鮮なペトリ皿を取り、その上に無菌HBSSの小滴を置きます。ポリカーボネートトラックエッチメンブレン（0.8を入れて81;メートル）HBSSに面した輝く表面とのHBSSこのドロップに。
- きれいな鉗子を使用すると、（上向きにし、その粗面に）膜上の2つのWDSおよび生殖腺を入れて、滅菌ワイプ/吸収紙を使用して、HBSSの最大量を削除します。吸収紙で組織に触れないでください。そうでなければ、それは、組織を損傷します。
- WDSも生殖腺いずれも互いに接触していることを確認してください。そうでなければ、彼らはその後のインキュベーション中に一緒に固執します。
- 空気 - 媒体インターフェースで300μLの培地と文化それらを含む24ウェルプレートのウェルに組織を有する膜を転送します。 WDSの嚢胞成長の膜の結果にあまりにも多くの培地。
- 5％CO 2の存在下で、37℃のインキュベーター中でプレートをインキュベートします。
- 毎日培地を変更します。ピペットで培地を変更するには、第1ウェルから培地を除去した後、予め温め新鮮な培地300μLを追加します。
注意：WDの形態形成の異なるシグナル伝達経路の効果を研究するために、必要な濃度での化学的活性化および/または阻害剤を培地に添加することができます。 - 3日間培養組織。 3日以内に、15.5 DPCの胚から収集巻かWDSは非常に入り組んチューブ（ 図3B）に変身します。 Wntシグナル阻害剤、IWR1の添加は、巻きWD（ 図3C）の阻害をもたらします。
- これらの組織を採取するために、氷冷PBSでペトリ皿を取ります。ペトリプレートに培養生殖腺およびWDを有する膜を転送します。膜をPBSに浮遊します。 PBSでそれをシンクし、生殖腺およびWDを取り出すために、膜を押します。
- 4℃または室温で1時間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）、O / Nで組織を固定してください。必要に応じて、固定する前に、WDSの明視野像を取ります。
4.ホールマウント免疫蛍光
- 洗浄固定組織をPBS-T（PBS + 1％で3回RTでゆっくりと揺らし、10分ごと、とのトリトンX-100）。
- ゆっくり揺り動かし（〜30回転）で、4℃で、段階的エタノールシリーズ（25％、50％、75％及び100％）、10分毎に組織を脱水。このステップでは、組織を75％エタノール中で4℃で保存することができます。
- エタノールを変更するには、2分間邪魔されずに組織を維持し、組織が落ち着くしましょう。できるだけ多くの上清を取り出した後、エタノールの次に高い濃度を追加します。組織への損傷を避けるために、ピペットチップは、いずれかの段階で組織に触れないようにしてください。
- 脱水後、ゆっくり揺り動かしながら4℃で、エタノール（100％、75％、50％及び25％）、10分毎に段階的に直列に組織を再水和します。
- PBS-T（PBS + 0.1％トリトンX-100）を用いて組織を洗浄し、4倍、20分毎に、室温で、穏やかで（約30 rpm）をロッキング。
- ブロッキング緩衝液を用いて室温で1時間、組織ブロック（PBS + 1％BSA + 0.2％脱脂粉乳粉末+ 0.3％トリトンX-100）。
- AFTERブロッキング、（ブロッキング緩衝液中に希釈した）一次抗体溶液に組織を転送し、穏やかなロッキング（〜30 rpm）で4℃でO / Nインキュベートします。用いた一次抗体の希釈液は、 材料表に記載されています。
- 次の日は、穏やかなロッキング（〜30回転）で、室温でPBS-MT（PBS + 2％脱脂粉乳+ 0.5％のTween-20）、4倍、30分ごと、で組織を洗います。
- ブロッキング緩衝液中で（このステップは個々の抗体の最適化を必要とする）250と緩やかに揺り動かしながら、室温で1時間インキュベート：この洗浄工程に続いて、1の希釈で二次抗体を追加します。
- 今年以降、二次抗体は、感光性蛍光体で標識されているように、光への暴露を防止するために、アルミホイルで覆われた組織を維持します。
- 組織は緩やかに揺り動かしながら、PBS-T（PBS + 0.1％のTween-20）、30分ごとに3倍洗います。
- 染色された組織を取り付けるためのスライドを準備します。
- このために、ガラスカバースリップをカットダイヤモンドペンを用いて、薄いストリップに2つのストリップネイルエナメルを使用して、スライドガラス上の他の上の1つを貼り付けます。 2つの境界を作成し、これら2つの境界の間に組織を配置します。
- DAPIを含む封入剤を追加し、カバースリップ上に置きます。スライドにそれを修正するためにカバースリップの隅にネイルエナメルを適用します。
注：組織は現在、イメージングのための準備が整いました。 -20℃でこれらのスライドを保管してください。
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Representative Results
開発中に、WDはシンプルで直管は非常に複雑で、コイル状のダクトに変換された重大な変化を受けます。上記の方法を使用して、WDSは、培養条件に類似の変換を受けます。ここでは、3 D（ 図3）培養WDSからの結果を示しています。 WDの形態形成に関与する分子メカニズムを分析するために、培養培地は、異なるシグナル伝達経路を標的とする阻害剤および活性化剤を補充することができます。 図3Cは IWR1 10、Wntシグナル特異的阻害剤の存在下での培養3日後に巻かWDを示しています。矢印は、（ 図3B）コイル状とコイリングWD（ 図3C）の阻害におけるWntシグナル伝達の結果の抑制を示すWDS（ 図3AおよびC）を解かマークします。従って、この培養系はdevelの間に関与する分子メカニズムを分析するために使用することができWDS（または他の器官）の発。
異なる種類の細胞を標識するために、我々は、WDS（ 図4）で免疫染色全体マウント行います。ここでは、標識細胞骨格、細胞質、および核タンパク質のためにこのプロトコルの使用を検証するデータを提示します。 図4Aは、3日間のサイトケラチン8（CK8、上皮細胞のマーカー）WDSの免疫染色（矢印でマークされている）で培養を表します。我々はまた、PH3（ホスホ - ヒストン3、細胞増殖マーカー）の免疫染色によって細胞増殖を評価するために同じプロトコルを適用しました。 図 4Bは 、PH3全体マウント免疫染色の代表画像を示しています。矢印でマークされたグリーンドットはPH3正したがって、増殖細胞を表します。 図4Cは、たて18.5 DPCのマウス胚から単離されたWDS上のアクティブβカテニンのための免疫染色を示しています。 図4Dに陰性対照（IgG対照）は、全く染色を示しません。これらの結果のハイライトこの全体のロバスト性は、多くの異なった抗体のために使用することができる免疫染色プロトコルを実装します。
15.5 DPCの胚から胚性生殖腺の単離のための切開部位の1イラスト図。白い点線は尿生殖隆起部を分離するために15.5 DPCの胚に切開を作るためのサイトをマークします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
器官培養のための段階的な手順を説明する図2.フロー図 。 viにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版をEW。
培養条件で3ノーマルWDの形態形成を図。 （A）精巣およびWDは15.5 dpcの胚から単離されました。 DMSO（対照）の存在下で3日間の培養後（B）コイル状WD。 （C）なしWD巻きはIWR1処理（のWnt阻害剤）を用いて観察されました。矢印WDをマーク。 tは、精巣をマークします。バーは100ミクロンに等しいです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.全体は、WDSの免疫標識をマウントします。 （A - B）のWDSイゾラのホールマウント免疫染色15.5 DPCの胚からのテッドとCK8（A）とPH3（B）のために3日間培養しました。 WD上の全体のマウント免疫蛍光βcateninアクティブ（C）は 18.5 DPCの胚から単離されました。 （D）18.5 DPC WDは全く染色を示さない上に活性βcateninの陰性対照（IgG対照）。 WDコイル状のマークを矢印。 tは、精巣をマークします。バーは100ミクロンに等しいです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
器官培養系は、伝統的な細胞培養系に比べて多くの利点を有します。このシステムは、異なる細胞型の間の元の構造関係と相互作用を保持します。これは、 インビボ系で模倣し、ニッチな要因が存在しない細胞培養研究よりも正確な情報を提供します。器官培養系の使用は、さらに、動物全体を用いて上の利点を有します。これらは、全身がすることができない動物全体を使用してのコストが高く、お手入れが簡単な器官培養系の維持、 など 。また、様々な薬理学的薬剤または薬物は、単離された/培養器官でテストすることができ、臓器の直接の応答を含んでおり、研究しました。
胚WDSの成功の培養のために考慮する必要があるいくつかの重要なステップがあります。損傷を受けた組織が十分に成長し、嚢胞にならないような組織は、それらの完全性を損傷することなく、慎重に収集しなければなりません。の上にメディアの過剰フィルタは、WDSの嚢胞の成長をもたらします。私たちはどんな汚染なしの組織培養フードの外組織の分離と文化を行いました。培地を調製し、組織培養フード内部の24ウェルプレートに添加しました。したがって、迅速に作業し、必要な対策を講じ、適切な技術を用いて、組織培養フード以外で収集WDSは汚染なしに培養することができます。培養組織を収穫しながら、ケアは、彼らは非常に壊れやすく、鉗子で直接つかんすべきではないと解釈されるべきです。組織は、代わりに鉗子の2つのアームの間に形成PBSの薄膜でピックアップされるべきです。
また、この原稿に詳細な全体マウント免疫蛍光手順を記載しています。共焦点顕微鏡や立体視を用いたホールマウント染色後の組織のZスタック画像は、シリアルセクショニングと複数のスライドを染色することなく、組織全体を通じてセクションの利点を提供します。したがって、それは、より良いアイデアを提供します標的タンパク質の発現の場所。抗体の浸透が低い信号で得られる高繊維/細胞外マトリックスの含有量を有する組織では困難です。より長い透過と一次抗体とのインキュベーションの増加持続時間は、このような場合に有用であり得ます。全マウント染色の他の欠点は、単一細胞レベルでの解像度が達成することが困難である、特別な目的/顕微鏡を必要とするかもしれないということです。私たちは4％PFA中で1時間およびO / N固定の両方を行い、これらの方法はCK8、PH 3、およびアクティブβcatenin抗体を含む我々の研究室で試験した抗体の大多数のためによく働いたことがわかりました。我々はまた、成功しPH3またはアクティブβcateninでCK8を共局在しています。共局在化のために、両方のマーカーのための一次抗体を同時に添加しました。これらの抗体は、異なる種に上昇させなければなりません。組織はeasilすることができますようにソリューションを追加または削除したときに全体のマウント免疫蛍光手順の間に、細心の注意が必要ですyはピペットチップ/トランスファーピペットに吸い上げ、プラスチックにはまり込みます。これを回避するには、ステレオスコープまたは解剖顕微鏡下で200μLのピペットチップでソリューションを変更し、チューブの底に溶液を少し残します。私たちは、きれいな透明なガラスビーカーに廃液を収集お勧めします。各溶液交換した後、ステレオスコープの下でチューブ内の組織の数を数えます。組織の不慮の損失の場合には、それらは、ガラスビーカーから回収することができます。これは組織を損傷し、撮影に適していない、それらを残すようなソリューションを転送するために使用されるピペットチップは、組織に触れてはいけません。
染色されたWDSを搭載するため、我々はそれらを圧縮し、その形態を歪めることができ、WDSの上に直接カバースリップを置くように空洞スライドを使用しました。組織の厚さに応じて、空洞の深さは、容易に使用されるカバーガラス片の数を変えることによって操作することができます。このスライドpreparatioの方法は、それだけでカバースリップとダイヤモンドペンを必要とするように、nは、経済的です。イメージングはまた、配向が容易であり、彼らがカバースリップの下に固定される前に染色されたWDSを移動すると、封入する前に行うことができます。全体のマウント免疫染色では、Zスタック画像は、良好な画像を提供し、より多くの情報を提供しています。異なる処置群からの画像を撮影するために、露出が同じに保つ必要があります。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は、この原稿の重要な読書のための婦人科腫瘍学グループのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、部分的には国立保健医療研究評議会、オーストラリア研究評議会、および癌研究所NSW（PST）からの資金提供によってサポートされています。 MKは、ニューカッスル大学院研究員の大学の受取人です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 µm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| phospho-Histone 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | - |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
References
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice. Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).
- Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 9, 283-292 (2005).
- Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling. Dev Biol. 412, 234-249 (2016).
- Murashima, A., et al. Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation. Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development? Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).
- Hirashima, T., Adachi, T. Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development. PLoS One. 10, 0135343 (2015).
- Chan, W. Y., Blomberg, L. A. Germline Development: Methods and Protocols. Methods Mol Biol. 825, (2012).
- Karner, C. M., et al. Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development. Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).
- Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nat Med. 14, 979-984 (2008).
