Summary
우리는 마우스 Wolffian 덕트 (WD)의 분리 및 배양 방법을 제시한다. 우리는 또한 형광 태그 항체 배양 / 갓 격리 WDS의 전체 마운트 면역 염색에 대한 자세한 절차를 보여줍니다. 함께, 이러한 기술은 WD의 개발, 코일 링, 및 분화에 대한 연구를 할 수 있습니다.
Abstract
두발 형태 형성은 남성 생식 기관을 포함한 대부분의 포유 동물의 개발을위한 기본 요건이다. 부고환, 남성 생식 기관의 중요한 부분은 기억 정자 성숙 및 전송에 대한 책임이있다. 성인 부고환은 Wolffian 덕트 (WD)로 알려진 단순하고 직선 배아 전구체로부터 개발하는 높은 코일 튜브입니다. 고환에서 정자가 난자와 수정 할 수 없습니다로 부고환의 적절한 코일 링은 남성 불임 필수적이다. 그러나, 부고환 개발 및 권취를 담당하는 메카니즘은 부분적으로 전체 기관 배양 및 촬상 방법의 부족으로 불분명. 본 연구에서, 우리는 더 나은 다른 관형 기관을 연구하기 위해 적용될 수있다 WD의 권취 및 발전 과정을 시각화 관내 배양 시스템 및 전체 마운트 면역 형광 프로토콜을 설명한다.
Introduction
남성 생식은 주로 고환 이루어져 생식 세포의 발생과 분화 및 정자의 성숙, 전송 및 저장을 위해 요구되는 복잡한 도관 시스템 사이트. 부고환은 정관과 고환 및 생식 세포 (1)의 후 고환 발달과 성숙에 주로 관여를 연결하는 관 모양의 기관이다. 고도로 꼬인 성인 마우스 부고환 간단한 직선 전구체 튜브 Wolffian 덕트 (WD) (1)로부터 발생한다. 정자 여성 생식 세포이 기름지게하는 능력을 획득하는 부고환 복잡하고 코일 구조가 필수적이다. 남성 불임에 대한 이러한 중요한 장기가 형태로 개발하고 얻는 방법을 잘 이해되지 않는다. 다양한 신호 경로는 예 Wnt 신호 전달 경로 및 경로 3,4- 5 시그널링 안드로겐으로 WD의 발달에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 우리의 최근 작품은 벨의 요구를 설립했다고급의 Wnt는 태아 개발 4시 WD의 코일 링에 대한 시그널링. 그러나, 상기 연구는 부고환 내 상피 및 간질 세포 생후 부고환 권취, 세포 분화 및 세포 간 통신에 관련된 메커니즘을 이해하기 위해 필요하다.
유전자 변형 마우스 모델은 다양한 기관 시스템 (6)의 개발 및 질병을 기본 분자 메커니즘의 식별 / 검증을위한 강력한 도구로 입증되었습니다. 광범위한 사용에도 불구하고, 추정 유전자 기능에 관해서 타겟 마우스 돌연변이의 예상치 못한 표현형, 일부 모델에서 널 (null) 돌연변이에 더 표현형, 유전 적, 환경 적 요인의 영향, 노동 집약적 등 유전자 변형 마우스 모델의 중요한 제한이있다 시간 소모적 마우스 모델을 개발하는 과정. 따라서, 단지 MODI 유전자에서 발견의 중요성 해석들이었다 마우스 모델은 항상 6 간단하지 않다. 이러한 제한은 우리 제어 배양 조건에서 실시간으로 다수의 신호 경로를 조작 할 수있는 유연성을 제공 관내 기관 배양 물 시스템의 사용에 의해 극복 될 수있다. 기관 배양 물 시스템은 전체 기관 (7)의 생리 병리학을 이해하는 수단이있다. 이되어 장기의 형태, 구조 및 기능 (8)의 더 나은 이해를 제공하고, 생체 내에서 존재하는 또, 형광 표지 된 항체로 염색하여 전체 장기의 화상은, 입체적 환경에서 관심있는 마커를 시각화 우릴 수있다.
여기, 우리는 WDS와 같은 관상 기관의 형태 형성에 대한 질문의 다양한 대답을 적용 할 수 있습니다 마우스 배아 생식 능선의 분리, 체외 문화와 WDS의 전체 마운트 면역 형광 이미징을위한 방법을 설명했다. 이 프로토콜에서, 우리15.5 일에서 격리 된 마우스 배아 비뇨 생식기 능선은 교미 (DPC) 임신 댐을 게시하고 상피 세포 마커 (사이토 케라틴 8, CK8), 세포 증식 마커 (포스 포 히스톤 3, PH3) 및 활성에 대한 면역 염색 한 다음 3 일 동안을 배양 βcatenin.
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Protocol
동물 관리 및 실험 절차는 뉴 사우스 웨일즈 동물 연구 법, 뉴 사우스 웨일즈 동물 연구 규제 및 관리를위한 호주 코드와 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회의 지침에 따라 수행하고 확인 하였다 과학적 목적을 위해 동물의 사용합니다. 마우스에 착수 모든 절차는 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회에 의해 승인되었다.
1 시간 짝짓기
- 쌍 6~8주 세 남성 및 일광 사이클이 종료 직전 암컷 마우스.
- 질 플러그의 존재 이른 아침 (또는 8.00 이전 AM), 매일 매일 암컷을 확인합니다. 플러그의 날 0.5 DPC로 간주됩니다.
- (남성)없이 새로운 케이지에 질 플러그 여성을 전송하고 플러그의 날짜를 레이블을 붙입니다.
마우스 배아 생식소 능선 2. 분리
- 마우스 embryon을 분리후술하는 바와 같이 15.5 DPC 임신 여성에서 생식기 IC 리지는 약간의 수정 9에 기재된 바와 같이.
- 임신 한 여성이 오후에 의한 임신의 다음날에 들어갈 것으로 간주하는 시간으로 정오 전에 절개를 수행합니다.
- 자궁 경부 전위를 사용하여 15.5 DPC 임신 여성을 희생 (또는 기관의 동물 윤리위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라).
- 흡수성 티슈 페이퍼에 그 뒷면에 마우스를 유지하고 70 % 에탄올로 복부의 복부 측면을 스프레이.
- 흉곽에 끝까지 비뇨 생식기 개구부로부터 연장, 집게와 하복부 피부 (복부 쪽)을 들어 올려 수술 가위를 사용하여 횡 절개를합니다. 복부를 노출 동물의 머리를 향해 피부를 당겨.
- 복강을 노출 수술 가위로 복부 근육을 잘라. 바로 자궁 경부 위의 집게로 임신하는 자궁을 잡고 상처를합니다. 이제 t에 개최하여 자궁을 들어 올려오 방광 및 복막 첨부 파일에서 자궁를 분리하기 - 자궁 접합에서 삭감 다음에 자궁 넓은 인대를 잘라.
- 빙냉 HBSS (행크 균형 염 용액)을 함유하는 50 ㎖ 튜브에 자궁 옮긴다. 여분의 혈액을 제거하는 얼음처럼 차가운 HBSS로 부드럽게 임신하는 자궁을 씻으십시오.
- 빙냉 HBSS를 함유하는 페트리 접시에 자궁 유지하고 얼음에 유지한다. 자궁 벽을 잘라 배아를 꺼내. 얼음에 HBSS와 신선한 페트리 접시에 배아를 유지합니다.
- 깨끗한 살균 티슈 페이퍼를 가지고 새로운 배양 접시에 넣어. 티슈 페이퍼에 70 % 에탄올을 분무. 측면에서이 조직 종이에 배아를 유지하고 그림 1에서 점선으로 나타낸 바와 같이 방향 멸균 블레이드를 사용하여 하복부에서 잘라.
- 척추를 고정하여 멸균 스폰지베이스의 배아를 수정합니다.
- 해부 실체 현미경 아래로 놓고 조심스럽게 복부 정중선을 따라 절단. 간과 창자를 제거합니다. 마우스 비뇨 생식기 시스템 (신장, 요관, 고환, WD 및 정관)는 이제 볼 수 있어야합니다.
- 고환 및 WD를 잘라, 얼음에, HBSS와 신선한 페트리 접시에 보관하십시오. 하여 WD와 고환을 사용하려면, 요도에 첨부 파일에 가까운 정관을 잘라 gubernaculum에서 WD의 하부의 첨부 파일을 잘라.
- 같은 그룹의 배아 (이 실험 계획에 따라 다를 수 있음)에서 고환 및 WDS 수영장.
배아 생식소 능선 3. 문화 (그림 2)
- 10 % FBS (소 태아 혈청), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 1 % L- 글루타민으로 DMEM / F12를 보충하여 배아 생식 융기 배양 배지를 준비한다. 수조에서 37 ° C로 미디어를 따뜻하게.
- 24 웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 300 μL 미디어를 추가한다.
- 신선한 페트리 접시를 가지고 그것에 무균 HBSS의 작은 방울을 넣어. (0.8 폴리 카르 보 네이트 트랙 에치 막 넣어81, 그 빛나는 표면이 HBSS를 향 HBSS이 드롭 m).
- 사용 청소 집게는 (위를 향하고, 그 거친 표면에) 막에 두 WDS와 생식선을 넣어 살균 물티슈 / 흡수 종이를 사용하여 HBSS의 최대 크기를 제거합니다. 흡수 종이로 조직을 만지지 마십시오; 그렇지 않으면, 조직이 손상된다.
- WDS이나 생식선도이 서로 닿지되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않으면 이후의 배양 기간 동안 함께 스틱 것입니다.
- 공기 매체 인터페이스 300 μL 배지 및 배양을 함유하는 24- 웰 플레이트의 웰에서 조직과 멤브레인을 전송. WDS의 낭성 성장에 막 결과에 너무 많은 배지.
- 5 % CO 2의 존재하에, 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 인큐베이션.
- 매일 배양 배지를 변경합니다. 피펫으로 매체를 변경하려면, 잘 처음부터 매체를 제거하고 데워진 신선한 매체의 300 μL를 추가합니다.
노트:WD의 형태 형성에 다른 신호 경로의 영향을 연구하는데 필요한 농도에서 화학 활성제 및 / 또는 억제제가 배지에 첨가 할 수있다. - 문화 3 일의 조직. 3 일 내에서, 15.5 DPC 배아에서 수집 uncoiled WDS는 매우 선상 튜브 (그림 3B)로 변환. 의 Wnt 억제제 IWR1의 첨가는 코일 WD (도 3c)의 억제를 초래한다.
- 수확 이러한 조직은 얼음처럼 차가운 PBS와 페트리 접시를 취할. 페트리 접시에 배양 생식선 및 WD와 멤브레인을 전송합니다. 멤브레인은 PBS에 떠 있습니다. PBS에서 싱크와 생식선 및 WD 꺼내 멤브레인을 누릅니다.
- 4 ℃ 또는 실온에서 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) O / N와 조직을 고정한다. 필요한 경우, 고정하기 전에 WDS의 명 시야 이미지를 가져 가라.
4. 전체 마운트의 면역 형광
- 세척 고정 된 조직은 PBS-T (PBS + 1 %로 3 배실온에서 천천히 흔들, 10 분 각각에 트리톤 X-100).
- 천천히 흔들 (~ 30 RPM)와, 4 ° C에서 에탄올 (25 %, 50 %, 75 % 및 100 %), 10 분, 각각의 등급에 직렬로 조직 탈수. 이 단계에서, 조직을 75 % 에탄올을 4 ℃에서 저장 될 수있다.
- , 에탄올을 변경 2 분 동안 방해받지 않고 조직을 유지하고 수 있도록 조직이 정착. 가능한 상층 액을 가지고 에탄올의 다음으로 높은 농도를 추가합니다. 조직의 손상을 방지하기 위해, 피펫 팁은 모든 단계에서 조직을 만지지해야합니다.
- 탈수 후, 천천히 흔들 함께 4 ℃에서 에탄올 (100 %, 75 %, 50 % 및 25 %), 10 분, 각각의 등급에 직렬로 조직을 재수.
- 부드러운 락 (~ 30 RPM)로, RT에서 PBS-T (PBS + 0.1 % 트리톤 X-100), 4 배속, 20 분 각각으로 조직을 씻으십시오.
- 블로킹 완충액으로 RT에서 1 시간 동안 조직을 차단 (PBS + 1 % BSA + 0.2 % 무 지방 건조 우유 분말 + 0.3 % 트리톤 X-100).
- AfteR 차단 (버퍼를 차단에 희석) 차 항체 용액에 조직을 전송하고 부드러운 락 (~ 30 RPM)와 4 ° C에서 O / N을 품어. 사용 된 일차 항체의 희석은 자료 표에 설명되어 있습니다.
- 다음 날, 부드러운 락 (~ 30 RPM)로, RT에서 PBS-MT (PBS + 2 % 무 지방 분유 분말 + 0.5 % 트윈 20), 4 배속, 30 분 각각으로 조직을 씻는다.
- 부드러운 락으로 차단 버퍼에 250 (이 단계는 개별 항체에 대한 최적화를 필요로) 및 실온에서 1 시간 동안 배양이 세척 단계 후, 1의 희석에 차 항체를 추가합니다.
- 지금부터 이후 이차 항체가 빛에 민감 형광으로 표시 될 때 빛에 노출되지 않도록 알루미늄 호일로 덮여 조직을 유지.
- 조직이 부드러운 락으로, PBS-T (PBS + 0.1 % 트윈 20), 30 분 각각 3 배 씻으십시오.
- 스테인드 조직을 장착 슬라이드를 준비합니다.
- 이를 위해, 유리 커버 슬립 컷및 다이아몬드 펜을 사용하여 얇은 스트립으로 두 스트립 네일 에나멜을 사용하여 유리 슬라이드 위에 다른 하나를 스틱. 이 두 경계 사이에 두 경계와 장소 조직을 만듭니다.
- DAPI 포함하는 설치 매체를 추가하고 커버 슬립에 넣어. 슬라이드에 그것을 해결하기 위해 커버 슬립의 모서리에 네일 에나멜을 적용합니다.
참고 : 조직은 이제 이미징을위한 준비가되어 있습니다. -20 ° C에서 다음 슬라이드를 저장합니다.
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Representative Results
개발하는 동안, WD는 단순한 직선 튜브는 매우 복잡하고 코일 덕트로 변환되는 것을 특징으로 상당한 변화를 겪는다. 전술 한 방법을 사용하여, WDS는 배양 조건에서 유사한 변화를 겪는다. 여기에서 우리는 3 일 (그림 3) 배양 WDS의 결과를 보여 주었다. WD의 형태 형성에 관여하는 분자 메커니즘을 해부 배양액 다른 신호 경로를 표적 억제제 및 활성제로 보충 될 수있다. 그림 3C 특정 억제제, IWR1 (10) 시그널링의 Wnt의 존재 문화의 3 일 후 WD를 uncoiled 보여줍니다. 화살표 (그림 3B) 코일과 코일 WD (그림 3C)의 억제에 Wnt 신호 결과의 억제를 나타내는 WDS (도 3a 및 C)를 uncoiled로 표시 한. 따라서,이 배양 시스템 (STABLE) 중 관련된 분자 메커니즘을 절개하는데 사용될 수있다WDS의 opment (또는 다른 기관).
다른 세포 유형 레이블을 지정하려면, 우리는 WDS에 전체 마운트 면역 염색을 (그림 4) 수행. 여기에서 우리는 라벨 세포 골격, 세포질, 핵 단백질이 프로토콜의 사용을 검증하는 데이터를 제시한다. 도 4a는 사이토 케라틴에게 3 일 동안 배양 (화살표로 표시) 8 (CK8, 상피 세포의 마커) WDS의 면역 염색을 나타냅니다. 또한 PH3 (포스 포 히스톤 (3), 세포 증식 마커)에 대한 면역 염색하여 세포 증식을 평가하기 위해 동일한 프로토콜을 적용했다. 도 4b는 PH3 전체 마운트 면역 염색의 대표 이미지를 보여줍니다. 화살표로 표시된 녹색 점은 PH3 긍정적 따라서 증식 세포를 나타냅니다. 도 4c 갓 18.5 DPC 마우스 배아에서 분리 된 WDS에 활성 β-catenin이에 대한 면역 염색을 보여줍니다. 그림 4D의 음성 대조군 (IgG를 제어)에는 염색을 보여줍니다. 이러한 결과 하이라이트많은 다른 항체에 사용될 수있는이 전체 마운트 면역 프로토콜의 견고성.
15.5 DPC 배아에서 배아 생식선의 분리를위한 절개 부위 1. 그림을 그림. 흰 점선 비뇨 리지를 분리 15.5 DPC 배아에서 절개하기위한 사이트를 표시한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
기관 배양을위한 단계적 절차를 설명하는 그림 2. 흐름도. VI에 대한 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전 EW.
배양 조건 3. 일반 WD의 형태 형성 그림. (A) WD 고환 및 15.5 DPC 배아로부터 단리. (B) 코일 WD DMSO (대조군)의 존재하에 3 일 배양 한 후. (C)이 아니 WD 권취 IWR1 처리 (a의 Wnt 억제제)으로 관찰 하였다. 화살표 WD을 표시; t는 고환을 표시합니다. 바는 100 μm의 동일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 항목은 WDS의 immunolabeling를 탑재합니다. (A - B) WDS의 솔의 전체 마운트 면역 염색15.5 DPC 배아에서 테드와 CK8 (A) 및 PH3 (B)에 대한 3 일 동안 배양. WD에 전체 마운트 면역 βcatenin 활성 (C)은 18.5 DPC 배아에서 분리. 더 염색을 보여주는 18.5 DPC WD의 활성 βcatenin에 대한 (D) 음성 대조군 (IgG의 제어). WD 코일 표시 화살표; t는 고환을 표시합니다. 바는 100 μm의 동일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
장기 배양 시스템은 기존의 세포 배양 시스템에 비해 많은 장점을 갖는다. 이 시스템은 서로 다른 세포 유형 사이의 원래 구조 관계와 상호 작용을 유지합니다. 이는 생체 내 시스템에서 모방하고 틈새 계수가없는 세포 배양 과정보다 더 정확한 정보를 제공한다. 기관 배양 물 시스템의 사용은 심지어 전체 동물을 사용하여보다 이점이있다. 이 전체 동물, 쉽게 관리 및 기관 배양 물 시스템의 유지 보수 등을 또한 사용의 높은 비용을 포함하는 다양한 약학 제 또는 약물 절연 / 배양 기관 및 기관의 직접 반응하지 전신 일 수를 테스트 할 수있다 공부했다.
배아 WDS의 성공적인 문화를 위해 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 손상된 조직이 잘 성장하고 낭포 성이되지 않는 조직은 자신의 무결성을 손상시키지 않고 신중하게 수집해야합니다. 의 상단에 미디어의 초과필터는 WDS의 낭포 성 성장으로 이어집니다. 우리는 어떤 오염없이 조직 문화 후드 외부 조직의 분리 및 배양을 수행 하였다. 배양액을 제조하고, 조직 배양 후드 안쪽 24 웰 플레이트에 첨가 하였다. 따라서, 적절한 기술을 사용하여 신속하게 작업하고 필요한 예방 조치, 조직 문화 후드 외부에 수집 된 WDS는 오염없이 배양 할 수있다. 배양 된 조직을 수확하는 동안, 치료는 매우 연약하고 집게와 직접 잡고 수 없습니다로주의해야한다. 조직 대신 집게의 두 팔 사이에 형성 PBS의 얇은 필름에 포착해야한다.
우리는 또한이 원고에 대한 자세한 전체 마운트 면역 과정을 설명했다. 공 초점 현미경 또는 입체를 사용하여 전체 마운트 염색 후 조직의 Z-스택 영상은 직렬 절편과 여러 슬라이드를 염색하지 않고 전체 조직을 통해 섹션에 이점을 제공합니다. 따라서, 더 나은 아이디어를 제공합니다표적 단백질의 발현 위치. 항체 침투 낮은 신호 발생 높은 섬유 / 외 기질 함량 조직에서 곤란하다. 긴 permeabilization 및 기본 항체와 배양 증가 지속 시간은 경우에 유용 할 수 있습니다. 전체 마운트 염색의 다른 단점은 단일 세포 수준에서의 해상도를 달성하기 어렵고, 특수 목적 / 현미경 필요할 수 있다는 것이다. 우리는 4 % PFA에서 1 시간 및 O / N 고정을 모두 수행이 방법은 CK8, PH3, 활성 βcatenin 항체는 우리 실험실에서 테스트 항체의 대부분 잘 작동 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 성공적으로 PH3 또는 활성 βcatenin와 CK8를 colocalized했다. colocalization을 위해, 모두 마커에 대한 일차 항체를 동시에 첨가 하였다. 이 항체는 다른 종에서 제기해야합니다. 조직이 easil 할 수있는 솔루션을 추가하거나 제거 할 때 전체 마운트 면역 과정 동안 최대한의주의를 기울여야합니다y는 피펫 팁 / 전송 피펫으로 작성 및 플라스틱에 박히면서. 이를 방지하기 입체경 또는 해부 현미경 하에서 200 μL 피펫 팁 솔루션을 변경할 튜브의 하단 용액 조금 떠난다. 우리는 깨끗한 투명 유리 비커에 폐기물 솔루션을 수집하는 것이 좋습니다. 각 용액을 변경 한 후, 실체 현미경 아래 튜브 조직의 개수를 카운트. 조직 손실 사고의 경우에, 이들은 유리 비이커에서 회수 할 수있다. 이 조직에 손상을 영상에 적합을 떠나 같은 조직을 만지지 안 솔루션을 전송하는데 사용 피펫 팁.
스테인드 WDS 장착을 위해, 우리는이를 압축하고 그 형태를 왜곡시킬 WDS의 바로 위에 커버 슬립을 넣어 공동으로 슬라이드를 사용했다. 조직의 두께에 따라, 상기 공동의 깊이는 쉽게 사용될 커버 슬립 스트립의 수를 변경함으로써 조작 될 수있다. 슬라이드 혼합물 준비의이 방법그것은 단지 커버 전표와 다이아몬드 펜을 필요로, n은 경제적이다. 이미징은 또한 배향하기 쉽고들이 커버 슬립에 따라 고정되기 전에 염색 WDS를 이동 coverslipping 전에 수행 될 수있다. 전체 마운트 면역 염색을 통해, Z 스택 이미징은 더 나은 이미지를 제공하고 더 많은 정보를 제공합니다. 다른 치료 그룹에서 이미지를 복용하는 경우, 노출은 동일하게 유지되어야한다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는이 원고의 중요한 읽기 위해 부인과 종양학 그룹의 구성원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 부분적으로 국립 보건 의료 연구위원회, 호주 연구위원회, 그리고 암 연구소 NSW (PST)에서 자금을 지원합니다. MK 뉴캐슬 대학원 연구 활동의 대학을받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 µm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| phospho-Histone 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | - |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
References
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