Organ kultur och Hela Mount immunofluorescensfärgning av Mus Wolffian kanaler

Summary

Vi presenterar en metod för isolering och odling av mus Wolffian kanalen (WD). Vi visar också en detaljerad beskrivning av hela berget immunfärgning av odlade / nyligen isolerade WDS med fluorescerande taggade antikroppar. Tillsammans utgör dessa tekniker möjliggör studier av WD utveckling, ringlande och differentiering.

Abstract

Äggledarna morfogenes är en grundläggande förutsättning för utvecklingen av de flesta däggdjurs organ, inklusive det manliga reproduktiva systemet. Bitestiklarna, en integrerad del av den manliga genitalia, är ansvarig för spermie lagring, mognad och transport. Den vuxna bitestikeln är en mycket spiralformat rör som utvecklas från en enkel och rak embryonala prekursor kallas Wolffian kanal (WD). Rätt ringlande i bitestiklarna är viktigt för manlig fertilitet, som spermier i testiklarna inte kan befrukta en äggcell. Dock kvarstår den mekanism som ansvarar för epididymal utveckling och lindning oklart, delvis på grund av bristen av hela organkultur och avbildningsmetoder. I denna studie beskriver vi en in vitro-odlingssystemet och hela montera immunofluorescens-protokoll för att bättre visualisera processen för WD lindning och utveckling, vilket också kan tillämpas för att studera andra rörformiga organ.

Introduction

Det manliga reproduktiva systemet består huvudsakligen av testikel, platsen för bakterieceller utveckling och differentiering, och ett komplex gångsystemet som krävs för mognaden, transport, och lagring av sperma. Bitestikeln är ett rörformat organ som förbinder testikeln med sädesledaren och huvudsakligen är verksamma inom posttestikel utveckling och mognad av könsceller ^1. De mycket lindade vuxen mus epididymis utvecklas från en enkel och rak föregångare rör Wolffian kanal (WD) ^1. Komplexet och lindade struktur bitestiklarna är viktigt för spermier att förvärva förmågan att befrukta kvinnliga könsceller ^2. Hur en sådan viktig organ för manlig fertilitet utvecklar och får i form är inte väl förstådd. Olika signalvägar har visat sig vara involverad i utvecklingen av WD såsom Wnt-signalväg ^3,4 och androgen signalväg ^5. Vårt senaste arbete har etablerat kravet på balserad Wnt signalering för WD lindning under fosterutvecklingen ^4. Dock ytterligare studier krävs för att förstå de mekanismer som är involverade i postnatal epididymalt ringlande, celldifferentiering, och cell-till-cellkommunikation i epididymal epitel och interstitiella celler.

Genetiskt modifierade musmodeller har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att identifiera / validering av molekylära mekanismer som ligger bakom utveckling och sjukdom i olika organsystem ^6. Trots sin omfattande användning, finns det betydande begränsningar av genetiskt modifierade musmodeller, inklusive oförutsedda fenotypen riktade mutanter mus med avseende på förmodad genfunktion, och ingen fenotyp i null mutanter i vissa modeller, påverkan av genetiska faktorer och miljöfaktorer, arbetsintensiv och tidskrävande process att utveckla musmodeller. Därför tolkningen av betydelsen av resultaten endast från genetiskt modifieraderade musmodeller är inte alltid okomplicerat ^6. Dessa begränsningar kan övervinnas genom användning av in vitro organkultursystem som ger oss flexibilitet att manipulera flera signalvägar i realtid i kontrollerade odlingsbetingelser. Organkultursystem är avgörande för att förstå fysiologi och patologi hela organ ^7. Dessutom avbildning av hela organ färgade med fluoroformärkt antikroppar ger oss möjlighet att visualisera de markörer av intresse i en tredimensionell sammanhang som den existerar in vivo, varigenom en bättre förståelse av organet form, struktur och funktion ^8.

Här har vi beskrivit metoder för isolering av mus embryonala gonadala åsar, in vitro-kultur och hela montera immunofluorescens avbildning av WDS, som kan användas för att besvara en mängd frågor som rör morfogenes av rörformiga organ såsom WDS. I detta protokoll, viisolerade mus embryonala urogenitala åsar från 15,5 dagar efter coitum (DPC) gravida dammar och odlade dem för 3 d följt av immunfärgning för en epitelcell markör (cytokeratin 8, CK8), en cell proliferation markör (fosfo-Histon 3, PH3) och aktiv βcatenin.

Protocol

Djuromsorg och experimentella procedurer genomfördes i enlighet med riktlinjerna för Animal Care och etikkommittén vid University of Newcastle och bekräftat för New South Wales Animal Research lagen, New South Wales Animal Research förordningen, och den australiensiska koden för vård och användning av djur för vetenskapliga ändamål. Alla förfaranden genomförs på möss har godkänts av Animal Care och etikkommittén vid University of Newcastle.

1. Tids Parning

1. Paret 6 - 8 veckor gamla manliga och kvinnliga möss strax före slutet av dagsljuscykel.
2. Kontrollera honorna för förekomsten av vaginala pluggar tidigt på morgonen (på eller före 08:00), varje dag. Dag plug anses vara 0,5 DPC.
3. Överför hona med vaginal plugg i en ny bur (utan manliga) och ange datum för kontakten.

2. Isolering av mus embryonala gonadal Ridges

1. Isolera mus Embryonenic gonadala åsar från 15,5 DPC dräktiga honor som beskrivs i ^9, med några ändringar som beskrivs nedan.
2. Utför dissekering före middagstid när tiden gravida kvinnor anses ingå i nästa dag av graviditet genom eftermiddagen.
3. Offra 15,5 DPC dräktiga honor med hjälp av halsdislokation (eller enligt den godkända protokoll av Institutional Animal etikkommittén).
4. Hålla musen på rygg på absorberande mjukpapper och spraya den ventrala sidan av buken med 70% etanol.
5. Lyft nedre delen av buken huden (ventrala sida) med pincett och göra en lateral snitt med kirurgiska saxar, som sträcker sig från urogenitala öppningen till slut på bröstkorgen. Dra huden mot huvudet av djuret för att exponera buken.
6. Skär magmusklerna med kirurgisk sax för att exponera bukhålan. Ta gravid livmoder med pincett precis ovanför livmoderhalsen och göra ett snitt. Nu lyfter livmodern genom att hålla på to urinblåsan och skär livmoder breda ligament, följt av nedskärningar vid uterotubal korsningar att lösgöra livmodern från den peritoneala fastsättning.
7. Överför livmodern in i ett 50 ml rör innehållande iskall HBSS (Hanks balanserade saltlösning). Tvätta gravid livmodern försiktigt med iskall HBSS för att avlägsna överskott av blod.
8. Håll livmodern i en petriskål med iskall HBSS och hålla på is. Skär livmoderväggen och ta ut embryon. Hålla embryona i en fräsch petriskål med HBSS på is.
9. Ta en ren steril mjukpapper och lägg den på en ny petriskål. Spraya 70% etanol på tissuepapperet. Håll embryo på detta mjukpapper på den laterala sidan och skär den från nedre delen av buken med hjälp av en steril bladet i den riktning som visas med den streckade linjen i figur 1.
10. Fäst embryot på en steril svamp bas genom att fästa ryggraden.
11. Placera den under dissekera stereomikroskop och försiktigt klippa längs den ventrala mittlinjen. Ta levern och tarmarna. Musen urogenitala systemet (njure, urinledare, testis, WD och sädesledaren) bör nu vara synlig.
12. Klipp ut testiklarna och WD, och hålla en ny petriskål med HBSS, på is. Att ta ut WD och testis, skär sädesledaren nära dess fastsättning på urinröret och skär fastsättning av nedre delen av WD från gubernaculum.
13. Pool testiklarna och WDS från embryona i samma grupp (detta kan variera enligt den experimentella planen).

3. Kultur av embryonala gonadal Ridges (Figur 2)

1. Beredning av medium för odling av embryonala gonadala åsarna genom att komplettera DMEM / F12 med 10% FBS (fetalt bovint serum), 1% penicillin / streptomycin och 1% L-glutamin. Värma media till 37 ° C i ett vattenbad.
2. Tillsätt 300 mikroliter av media per brunn i en 24-brunnars cellodlingsplatta.
3. Ta en ny Petri platta och sätta en liten droppe steril HBSS på det. Sätt en polykarbonat spår etsningsmembran (0,881, m) på denna droppe HBSS med sin skinande yta som vetter mot HBSS.
4. Använda rena pincett sätta två WDS och könskörtlar på membranet (på sin grov yta, vänd uppåt) och avlägsna den maximala mängden HBSS med sterila dukar / absorberande papper. Rör inte vävnaden med absorberande papper; annars kommer det att skada vävnaden.
5. Se till att varken WDS eller könskörtlarna vidrör varandra. Annars kommer de att hålla ihop under efterföljande inkubation.
6. Över membran med vävnaderna i brunnen av en 24-brunnsplatta innehållande 300 | il odlingsmedium och kultur dem vid luft-medelgränssnitt. För mycket odlingsmedium på membran resulterar i en cystisk tillväxt WDS.
7. Inkubera plattan vid 37 ° C inkubator, i närvaro av 5% _CO2.
8. Ändra odlingsmediet varje dag. För att ändra medium med pipetten, avlägsna mediet från brunnen först och sedan lägga till 300 mikroliter av den förvärmda färskt medium.
   Notera:För att studera effekten av olika signalvägar på WD morfogenes kan kemiska aktivatorer och / eller inhibitorer vid de erforderliga koncentrationerna tillsättas till odlingsmediet.
9. Kultur vävnader för 3 d. Inom tre d, utrullade WDS som samlats in från en 15,5 DPC embryo förvandlas till mycket invecklade rör (Figur 3B). Tillsatsen av den Wnt-inhibitor, IWR1, resulterar i hämning av WD haspling (figur 3C).
10. För skörd dessa vävnader ta en petriskål med iskall PBS. Överför membran med odlade gonad och WD i Petri plattan. Membranet kommer att flyta på PBS. Tryck på membranet för att sänka den i PBS och ta ut gonad och WD.
11. Fäst vävnader med 4% paraformaldehyd (PFA) O / N vid 4 ° C eller under 1 h vid RT. Om det behövs, ta ljusa fält bilder av WDS innan fixeringen.

4. Hela Mount Immunofluorescens

1. Tvätta de fasta vävnaderna 3 gånger med PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) med långsam gungning, 10 min vardera, vid RT.
2. Dehydratisera vävnaderna i en graderad serie av etanol (25%, 50%, 75% och 100%), 10 min vardera, vid 4 ° C, med långsam gungning (~ 30 rpm). Vid detta steg kan vävnaderna förvaras vid 4 ° C i 75% etanol.
   1. Om du vill ändra etanol, hålla vävnader ostört under 2 minuter och låt vävnaderna lugna ner. Ta reda på så mycket supernatant som möjligt och sedan lägga till nästa högre koncentration av etanol. För att undvika eventuella skador på vävnader, bör pipettspetsen inte röra vävnaderna i något skede.
3. Efter dehydrering, rehydrera vävnaderna i en graderad serie av etanol (100%, 75%, 50% och 25%), 10 min vardera, vid 4 ° C, med långsam gungning.
4. Tvätta vävnader med PBS-T (PBS + 0,1% Triton X-100), 4x, 20 min vardera, vid RT, med försiktig skakning (~ 30 rpm).
5. Blockera vävnaderna under 1 h vid RT med blockeringsbuffert (PBS + 1% BSA + 0,2% fettfri torrmjölkspulver + 0,3% Triton X-100).
6. afteR-blockerande, överföra vävnader till primär antikropp lösning (utspädd i blockerande buffert) och inkubera O / N vid 4 ° C med försiktig skakning (~ 30 rpm). Spädningar av de primära antikropparna som användes beskrivs i Material Tabell.
7. Nästa dag, tvätta vävnader med PBS-MT (PBS + 2% fettfri torrmjölkspulver + 0,5% Tween-20), 4x, 30 min vardera, vid RT, med försiktig skakning (~ 30 rpm).
8. Efter detta tvättningssteg, tillsätt sekundär antikropp vid en utspädning av 1: 250 (detta steg behöver optimering för individuella antikroppar) i blockerande buffert och inkubera under 1 h vid RT, med försiktig skakning.
9. Från och med nu och framåt hålla vävnaderna täckta med aluminiumfolie för att förhindra exponering för ljus som sekundära antikroppar är märkta med ljuskänsliga fluoroforer.
10. Tvätta vävnaderna 3 gånger med PBS-T (PBS + 0,1% Tween-20), 30 min vardera, med försiktig skakning.
11. Förbered glas för montering av färgade vävnader.
    1. För detta klipp täckglasi tunna strimlor med användning av en diamantpenna och hålla fast två remsor ovanpå varandra på glasskivan med hjälp av nagellack. Gör två gränser och placera vävnader mellan dessa två gränser.
    2. Lägg DAPI innehåller monteringsmedium och sätta på ett täckglas. Applicera nagellack i hörnen av täckglaset för att fixa det till bilden.
       Obs: Vävnader är nu redo för avbildning. Lagra dessa bilder vid -20 ° C.

Representative Results

Under utveckling, WD genomgår stora förändringar där en enkel och rakt rör förvandlas till en mycket komplex och lindade kanal. Med användning av metoder som beskrivits ovan, WDS undergår en liknande omvandling i odlingsbetingelser. Här har vi visat de resultat från WDS odlade under 3 d (Figur 3). Att dissekera molekylära mekanismer som är involverade i WD morfogenes kan odlingsmediet kompletteras med hämmare och aktivatorer inriktade på olika signalvägar. Figur 3C visar rullas WD efter 3 d odling i närvaro av Wnt signalering specifik inhibitor, IWR1 ^10. Pilarna markerar lindade (figur 3B) och avlindas WDS (figurerna 3A och C) vilket indikerar att undertryckande av Wnt-signaleringsresulterar i hämning av WD haspling (figur 3C). Således kan denna kultur systemet användas för att dissekera de molekylära mekanismer som är involverade under devellingen av WDS (eller andra organ).

Att märka olika celltyper, utförde vi hela berget immunfärgning på WDS (Figur 4). Här presenterar vi uppgifter validera användningen av detta protokoll för märkning cytoskelettala, cytoplasmatiska och nukleära proteiner. Figur 4A representerar cytokeratin 8 (CK8, en markör för epitelceller) immunfärgning av WDS (markerad med en pil) odlades under tre dagar. Vi har också tillämpat samma protokoll för att bedöma celltillväxt genom immunfärgning för PH3 (fosfo-Histon 3, en cell proliferation markör). Figur 4B visar en representativ bild av PH3 hela montera immunfärgning. Gröna prickar markerade med en pil representerar PH3 positiva därmed prolifererande celler. Figur 4C visar immunfärgning för aktivt β-catenin på WDS nyligen isolerade från 18,5 DPC musembryon. Den negativa kontrollen (IgG-kontroll) i Figur 4D visar ingen färgning. Resultaten understrykerrobustheten detta hela berget immunfärgning protokoll, som även kan användas för många olika antikroppar.

Figur 1. Illustration av platsen för snittet för isolering av embryonala könskörtlar från 15,5 DPC embryo. Den vita streckade linjen markerar platsen för att göra ett snitt i en 15,5 DPC embryo att isolera urogenitala åsar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Flödesschema som beskriver stegvis förfarande för organkultur. Klicka här för att VIew en större version av denna siffra.

Figur 3. Normal WD morfogenes i odlingsbetingelser. (A) Testikel och WD isolerades från 15,5 DPC embryo. (B) Lindad WD efter 3 d odling i närvaro av DMSO (kontroll). (C) nr WD lindning observerades med IWR1 behandling (en Wnt-hämmare). Pilen markerar WD; t, markerar testikel. Barer lika med 100 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Hela montera immunmärkningen av WDS. (A - B) Hela Mount immunfärgning av WDS isolated från 15,5 DPC embryon och odlas under 3 d för CK8 (A) och PH3 (B). (C) Aktiv βcatenin hela berget immunofluorescens på WD isolerade från 18,5 DPC embryo. (D) negativ kontroll (IgG-kontroll) för aktivt βcatenin på 18,5 DPC WD visar ingen färgning. Arrow märken lindade WD; t, markerar testikel. Barer lika med 100 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Organkultursystem har många fördelar jämfört med traditionella cellodlingssystem. Systemet behåller de ursprungliga strukturella relationer och interaktioner mellan olika celltyper. Det härmar in vivo-system och ger mer exakt information än cellkulturstudier där nisch faktorn är frånvarande. Användningen av organkultursystem har även fördelar jämfört med användning av hela djuret. Dessa inkluderar den högre kostnaden för att använda hela djuret, enkel skötsel och underhåll av organkultursystem, etc. Dessutom kan olika farmakologiska medel eller läkemedel testas på isolerade / odlade organ och direkt respons av organet och inte hela kroppen kan vara studeras.

Det finns flera viktiga steg som måste beaktas för framgångsrik odling av embryonala WDS. Vävnader måste samlas försiktigt utan att skada deras integritet, som skadade vävnader inte växer bra och bli cystisk. Överskott av media på toppen avfilter leder också till en cystisk tillväxt WDS. Vi utförde vävnads isolering och odling utanför vävnadsodling huven utan kontaminering. Odlingsmedium framställdes och sattes till 24-brunnars plattor inne i vävnadsodling huva. Därför, med hjälp av rätt teknik, arbetar snabbt och vidta nödvändiga försiktighetsåtgärder, kan WDS samlats utanför vävnadsodling huva odlas utan kontaminering. Medan skörda de odlade vävnader, bör försiktighet iakttas eftersom de är mycket sköra och bör inte gripas direkt med pincett. Vävnader bör i stället hämtas i en tunn film av PBS som bildas mellan de två grenarna av pincett.

Vi har också beskrivit en detaljerad hela montera immunofluorescens förfarande i detta manuskript. Z-stack avbildning av vävnader efter hela montera färgning med hjälp av konfokalmikroskopi eller stereoskopi ger en fördel till snitt genom hela vävnaden utan seriesnitt och färgning flera bilder. Således, det ger en bättre uppfattning omplatsen för uttryck av målproteiner. Antikropp penetration är svårt i vävnader med hög fiber / extracellulärmatrix innehåll resulterar i en lägre signal. Längre permeabilisering och ökad varaktighet inkubering med primära antikroppar kan vara användbara i sådana fall. Den andra nackdelen med hela montera färgning är att upplösningen på en enda cell nivå är svårt att uppnå och kan behöva särskilda mål / mikroskop. Vi utförde både en timme och O / N fixering i 4% PFA och funnit att dessa metoder fungerat bra för majoriteten av antikroppar som testas i vårt laboratorium inklusive CK8, PH3, och aktiva βcatenin antikroppar. Vi har också framgångsrikt samlokaliserades CK8 med PH3 eller aktivt βcatenin. För colocalization har primära antikroppar för både markörerna tillsättas samtidigt. Dessa antikroppar måste höjas i olika arter. Under hela berget immunofluorescens förfarande, bör största möjliga försiktighet iakttas när du lägger till eller ta bort lösningar vävnaderna kan vara easily dras upp i pipettspetsen / överföringspipett och fastna till plasten. För att undvika detta, byta lösningar med en 200 mikroliter pipettspets under stereoskop eller dissektion mikroskop och lämnar en liten bit av lösningen på botten av rören. Vi rekommenderar att samla in avfallslösningar i en ren transparent glasbägare. Efter varje lösning förändring, räkna antalet vävnader i rören enligt ett stereoskop. Vid oavsiktlig förlust av vävnad, kan de återvinnas från glasbägare. Pipettspetsar används för att överföra lösningar ska aldrig röra vävnader, eftersom detta kommer att skada vävnaderna och lämna dem olämpliga för avbildning.

För montering av färgade WDS använde vi hålighet diabilder som att sätta täck direkt ovanpå WDS kan komprimera dem och förvränga deras morfologi. Beroende på tjockleken hos vävnader kan djupet hos kaviteten lätt manipuleras genom att variera antalet av täckremsor som används. Denna metod för glid FÖRBEREDELSEn är ekonomiskt eftersom det kräver bara täckglas och en diamant penna. Imaging kan också göras innan täckglas som det är lätt att orientera och förflytta färgade WDS innan de fastställs enligt täck. Med hela berget immunfärgning, ger Z-stack avbildning bättre bilder och ger mer information. För att ta bilder från olika behandlingsgrupper, bör exponeringen hållas samma.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Corning, USA	3524	can be purchased from other vendors
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30031.02	can be purchased from other vendors
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Sigma, USA	D8437	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum (FBS)	Interpath,  Australia	SH30034.02	10% FBS used in culture medium
L-Glutamine	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30034.01	1% concentration used
Penicillin/Streptomycin	Gibco, USA	15070-063	1% concentration used
Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch	Whatman, USA	110409	Membrane (0.8 µm)
IWR1	Sigma, USA	10161-5mg	100 µM concentration used
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences, USA	15710	16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot be disposed of in the sink
Ethanol	Thermo Scientific Fisher, USA	214-20L PL	Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.
Tween-20	Thermo Scientific Fisher, USA	2509-500ml	Very viscous, careful while dispensing
Triton X-100	Sigma, USA	T8787-50ml	Very viscous, careful while dispensing
Di-Sodium Hydrogen Phosphate	Thermo Scientific Fisher, USA	621-500mg	can be purchased from other vendors
Sodium Di-hydrogen Phosphate	Ajax Finechem, USA	4745-500g	can be purchased from other vendors
Sodium Chloride	Thermo Scientific Fisher, USA	465-500g	can be purchased from other vendors
Cytokeratin8/Troma I	Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)	TROMA-I	1:250 in blocking buffer
active βcatenin	Cell Signalling Technology,  USA	D13A1	1:200 in blocking buffer
phospho-Histone 3	Millipore, MA, USA	06-570	1:200 in blocking buffer
Alexa488 Goat anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  USA	111-545-047	1:250 in blocking buffer
Alexa594 Goat anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  USA	112-585-072	1:250 in blocking buffer
Glycerol	Thermo Fisher Scientific, USA	242-500ml	can be purchased from other vendors
n-Propyl galate	Sigma, USA	2370	-
2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)	Sigma, USA	D9564-10mg	Use to stain nucleic acids (DNA)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific, USA	2225-500ml	Solvent
Cover Slips (24 x 50 mm)	Lomb Scientific	CS24501GP	-