Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescens Farvning af Mouse Wolffian Kanaler

Summary

Vi præsenterer en fremgangsmåde til isolering og dyrkning af muse Wolffian kanalen (WD). Vi viser også en detaljeret procedure for hele mount immunfarvning af dyrkede / frisk isolerede WDS med fluorescens mærkede antistoffer. Tilsammen udgør disse teknikker gør det muligt at studere WD udvikling, opvikling, og differentiering.

Abstract

Tubal morfogenese er en grundlæggende forudsætning for udviklingen af ​​de fleste pattedyr organer, herunder den mandlige reproduktive system. De epididymis, en integreret del af den mandlige reproduktive tarmkanalen, er ansvarlig for opbevaring af sæd, modning og transport. Den voksne epididymis er en meget coilrør der udvikler sig fra en enkel og lige embryonale precursor kendt som Wolffian kanal (WD). Korrekt oprulning af epididymis er afgørende for mandlige fertilitet, som sædceller i testiklerne ikke kan befrugte en oocyt. Men den mekanisme, der epididymis udvikling og oprulning er fortsat uklart, delvist på grund af manglen af ​​hele organkultur og billeddannende metoder. I denne undersøgelse beskriver vi et in vitro kultursystem og hele mount immunofluorescens protokol bedre at visualisere processen med WD oprulningen og udvikling, som også kan anvendes til at studere andre rørformede organer.

Introduction

Den mandlige reproduktive system består primært af testis, stedet for kimcelle udvikling og differentiering og et komplekst gangsystemet, der kræves for modningen, transport og opbevaring af sædceller. Epididymis er en rørformet organ, der forbinder testis med sædlederen og hovedsageligt involveret i post-testikelkræft udvikling og modning af kønsceller ^1. De stærkt coiled voksne mus epididymis udvikler sig fra en enkel og lige precursor rør, Wolffian kanal (WD) ^1. Komplekset og oprullede struktur epididymis er afgørende for sædcellerne at erhverve evnen til at befrugte kvindelige kønsceller ^2. Hvordan sådan en vigtig organ for mandlig fertilitet udvikler og kommer i form er ikke godt forstået. Forskellige signalveje er blevet vist at være involveret i udviklingen af WD såsom Wnt signalvejen ^3,4 og androgenet signalvejen ^5. Vores seneste arbejde har etableret kravet om balbalanceret Wnt signalering til WD oprulning under prænatal udvikling ^4. Imidlertid er yderligere undersøgelser nødvendige for at forstå de mekanismer, der er involveret i postnatal epididymalt coiling, cellulær differentiering, og celle-til-celle kommunikation i epididymale epitel og med interstitielle celler.

Genetisk modificerede musemodeller har vist sig at være et effektivt redskab til identifikation / validering af molekylære mekanismer bag udvikling og sygdom af forskellige organsystemer ^6. Trods dens omfattende brug, er der væsentlige begrænsninger af genetisk modificerede musemodeller, herunder uforudsete fænotype af målrettede mus mutanter med hensyn til formodede genfunktion, og ingen fænotype i nulmutanter i nogle modeller, indflydelse af genetiske og miljømæssige faktorer, arbejdskrævende og tidskrævende proces med at udvikle musemodeller. Derfor fortolkningen af ​​betydningen af ​​resultaterne kun fra genetisk modicerede musemodeller er ikke altid ligetil ^6. Disse begrænsninger kan overvindes ved hjælp af in vitro-orgel kultur system, der giver os fleksibilitet til at arbejde med flere signalveje i realtid i kontrollerede dyrkningsbetingelser. Organkultur system er medvirkende til at forstå fysiologi og patologi hele organer ^7. Endvidere billeddannelse af hele organer farvet med fluoroformærkede antistoffer kan vi visualisere markører af interesse i en tredimensionel kontekst, som den eksisterer in vivo, hvorved der tilvejebringes en bedre forståelse af organets form, struktur og funktion ^8.

Her har vi beskrevet de metoder til isolering af muse embryonale gonadale kamme, in vitro kultur og hele mount immunfluorescens billeddannelse af WDS, der kan anvendes til at besvare en række spørgsmål om morfogenese af rørformede organer såsom WDS. I denne protokol, viisolerede muse embryonale urogenitale kamme fra 15,5 dage efter coitum (dpc) gravide dæmninger og dyrket dem i 3 dage efterfulgt af immunfarvning for en epitelcelle markør (cytokeratin 8, Ck8), en celle proliferation markør (phospho-histon 3, PH3) og aktiv βcatenin.

Protocol

Animal pleje og eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Animal Care og etiske komité fra University of Newcastle og bekræftet til Forskning lov om New South Wales Animal, New South Wales Animal Research forordning, og den australske kode for pleje og brug af dyr til videnskabelige formål. Alle de procedurer, der gennemføres på mus blev godkendt af Animal Care og etiske komité fra University of Newcastle.

1. Time Parring

1. Pair 6 - 8 uger gammel han- og hunmus lige før slutningen af ​​dagslys cyklus.
2. Tjek hunnerne for tilstedeværelsen af ​​vaginale propper tidligt om morgenen (på eller før 08:00), hver dag. Dag af plug betragtes som 0,5 dpc.
3. Overfør hunnen med vaginalprop til en ny bur (uden han) og mærke datoen for proppen.

2. Isolering af Mouse Embryonale gonadale Ridges

1. Isoler mus embryonic gonadale kamme fra 15,5 DPC drægtige hunner som beskrevet i ^9, med et par ændringer, som beskrevet nedenfor.
2. Gennemfør dissektion før middag som den tid drægtige hunner anses for at indgå i den næste dag af graviditet ved eftermiddag.
3. Sacrifice 15,5 DPC drægtige hunner ved hjælp af cervikal dislokation (eller som pr den godkendte protokol af den institutionelle Animal Ethics Committee).
4. Hold musen på ryggen på absorberende tissuepapir og sprøjt den ventrale side af maven med 70% ethanol.
5. Løft den nederste abdominale hud (ventrale side) med pincet og gøre en lateral incision hjælp kirurgiske sakse, der strækker sig fra urogenitale åbning til ende på brystkassen. Trække huden mod hovedet af dyret for at blotlægge maven.
6. Skær de abdominale muskler med kirurgiske sakse at eksponere peritoneale hulrum. Grab gravid livmoder med pincet lige over livmoderhalsen og lave et snit. Nu løftes livmoderen ved at holde på to urinblæren og skære uterin brede ligament efterfulgt af nedskæringer på de uterotubal knudepunkter at løsrive livmoderen fra peritoneal vedhæftede fil.
7. Overfør livmoderen i et 50 ml rør indeholdende iskold HBSS (Hanks Balanced Salt Solution). Vask gravid livmoder forsigtigt med iskold HBSS for at fjerne overskydende blod.
8. Hold livmoderen i en petriskål indeholdende iskold HBSS og holde på is. Skær livmodervæggen og tag embryoner. Hold embryoner i en frisk petriskål med HBSS på is.
9. Tag en ren steril silkepapir og sætte det på en ny petriskål. Spray 70% ethanol på tissuepapiret. Hold embryo på dette væv papir på den laterale side og skær den fra underlivet anvendelse af en steril bladet i retningen som vist med stiplet linje i figur 1.
10. Fastgør embryo på en steril svamp bund ved at fastgøre rygsøjlen.
11. Placer den under dissekere stereomikroskopet og omhyggeligt skåret langs den ventrale midterlinjen. Fjern leveren og tarmene. Musen urogenitale system (nyre, ureter, testikel, WD og vas deferens) bør nu være synlig.
12. Klip testiklerne og WD, og ​​holde i en frisk petriskål med HBSS, på is. At tage ud WD og testikler, klippe sædlederen tæt på sin tilknytning til urinrøret og skære fastgørelse af nederste del af WD fra gubernaculum.
13. Pool testiklerne og WDS fra embryoner fra samme gruppe (kan variere som pr den eksperimentelle plan).

3. Kultur af embryonale gonadale Ridges (figur 2)

1. Forbered medium til dyrkning af embryonale gonadale kamme ved at supplere DMEM / F12 med 10% FBS (føtalt bovint serum), 1% penicillin / streptomycin og 1% L-glutamin. Varm mediet til 37 ° C i et vandbad.
2. Tilsæt 300 pi medier pr brønd af en 24-brønds celledyrkningsplade.
3. Tag en frisk Petri plade og sætte en lille dråbe sterilt HBSS på det. Sæt en polycarbonat track etch membran (0,881 m) på denne dråbe HBSS med sin skinnende overflade vender mod HBSS.
4. Brug rene pincet sætte to WDS og gonader på membranen (på sin ru overflade, der vender opad), og fjern den maksimale mængde HBSS sterile klude / absorberende papir. Rør ikke vævet med absorberende papir; ellers vil det ødelægge vævet.
5. Sørg for, at hverken de WDS eller gonaderne rører hinanden. Ellers vil de holde sammen under efterfølgende inkubation.
6. Membranfilteret overføres med vævene i brønden af ​​en 24-brønds plade indeholdende 300 pi dyrkningsmedium og kultur dem på luft-medium-grænsefladen. For meget dyrkningsmedium på membraner resulterer i en cystisk vækst i WDS.
7. Inkubér pladen ved 37 ° C inkubator i nærvær af _5% CO2.
8. Skift dyrkningsmediet hver dag. For at ændre mediet med pipette til at fjerne mediet fra brønden først og derefter tilføje 300 pi af forvarmet frisk medium.
   Note:Til undersøgelse af virkningen af ​​forskellige signalveje på WD morfogenese, kan kemiske aktivatorer og / eller inhibitorer ved de nødvendige koncentrationer tilsættes til dyrkningsmediet.
9. Kultur væv i 3 d. Inden 3 d, rullet WDS indsamlet fra en 15,5 dpc foster forvandle meget indviklede rør (figur 3B). Tilsætningen af Wnt-inhibitor, IWR1, resulterer i inhibering af WD coiling (figur 3C).
10. For høst disse væv tage en petriskål med iskoldt PBS. Overfør membranen med dyrkede gonadedosis og WD i petriskål. Membranen vil flyde på PBS. Tryk på membranen til at synke det i PBS og tag gonade og WD.
11. Fastgør væv med 4% paraformaldehyd (PFA) O / N ved 4 ° C eller i 1 time ved stuetemperatur. Hvis det er nødvendigt, tage lyse felt billeder af WDS før fiksering.

4. Hele Mount Immunofluorescens

1. Vask de faste væv 3x med PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) med langsom vuggende, 10 min hver, ved stuetemperatur.
2. Dehydrer vævene i en gradueret række af ethanol (25%, 50%, 75% og 100%), 10 min hver ved 4 ° C, under langsom rocking (~ 30 rpm). På dette trin kan vævene opbevares ved 4 ° C i 75% ethanol.
   1. For at ændre ethanol, holde væv uforstyrret i 2 minutter og lad væv slå sig ned. Tag så meget supernatant som muligt, og derefter tilføje det næste højere koncentration af ethanol. For at undgå skader på væv, bør pipettespidsen ikke røre væv på noget tidspunkt.
3. Efter dehydrering, rehydrere vævene i en gradueret række af ethanol (100%, 75%, 50% og 25%), 10 min hver ved 4 ° C, under langsom vipning.
4. Vask væv med PBS-T (PBS + 0,1% Triton X-100), 4x, 20 min hver, ved stuetemperatur, under forsigtig vipning (~ 30 rpm).
5. Blokere væv i 1 time ved stuetemperatur med blokeringsbuffer (PBS + 1% BSA + 0,2% fedtfri tørmælk pulver + 0,3% Triton X-100).
6. after blokering, overføre vævet til primær antistofopløsning (fortyndet i blokeringspuffer) og inkuberes O / N ved 4 ° C under forsigtig vipning (~ 30 rpm). Fortyndinger af de primære antistoffer anvendes, er beskrevet i Materialer tabel.
7. Den næste dag, vask væv med PBS-MT (PBS + 2% fedtfri tørmælk pulver + 0,5% Tween-20), 4x, 30 min hver, ved stuetemperatur, under forsigtig vipning (~ 30 rpm).
8. Efter denne vasketrin tilsættes sekundært antistof ved en fortynding på 1: 250 (dette trin behov optimering for individuelle antistoffer) i blokerende buffer og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur under forsigtig vipning.
9. Fra nu og frem holde væv dækket med alufolie for at forhindre udsættelse for lys som sekundære antistoffer er mærket med lysfølsomme fluoroforer.
10. Vask vævene 3x med PBS-T (PBS + 0,1% Tween-20), 30 min hver, under forsigtig vipning.
11. Forbered dias til montering af farvede væv.
    1. For dette, skære dækglasi tynde strimler ved hjælp af en diamant pen og holde to strimler én over den anden på objektglasset ved hjælp neglelak. Lav to grænser og placere væv i mellem disse to grænser.
    2. Tilføj DAPI indeholder montering medium og sat på et dækglas. Påfør neglelak i hjørnerne af dækglasset til at ordne det til dias.
       Bemærk: Væv er nu klar til billeddannelse. Opbevar disse slides ved -20 ° C.

Representative Results

Under udvikling, WD foretages væsentlige ændringer, hvor en enkel og lige rør er omdannet til en meget kompleks og sammenrullet kanal. Anvendelse af fremgangsmåder beskrevet ovenfor, WDS undergår en lignende transformation i dyrkningsbetingelser. Her har vi vist resultaterne fra WDS dyrket i 3 d (figur 3). At dissekere molekylære mekanismer involveret i WD morfogenese, kan dyrkningsmediet suppleres med inhibitorer og aktivatorer rettet mod forskellige signalveje. Figur 3C viser rullet WD efter 3 d af dyrkning med forekomst af Wnt signalering specifikke inhibitor, IWR1 ^10. Pile markerer coiled (figur 3B) og rullet WDS (figur 3A og C), hvilket viser at undertrykkelse af Wnt signalering resulterer i hæmning af WD coiling (figur 3C). Således kan denne kultur systemet, anvendes til at dissekere de molekylære mekanismer, der er involveret i devellingen af ​​WDS (eller andre organer).

For at mærke forskellige celletyper, udførte vi hele mount immunfarvning på WDS (figur 4). Her præsenterer vi data validering brugen af ​​denne protokol for mærkning cytoskeletal, cytoplasmatisk, og nukleare proteiner. Figur 4A repræsenterer cytokeratin 8 (Ck8, en markør for epitelceller) immunfarvning af WDS (markeret med en pil) dyrket i tre dage. Vi har også anvendt den samme protokol til at vurdere celledeling ved immunfarvning for PH3 (phospho-histon 3, en celledeling markør). Figur 4B viser et repræsentativt billede af PH3 hele mount immunfarvning. Grønne prikker markeret med en pil repræsenterer PH3 positive dermed prolifererende celler. Figur 4C viser immunfarvning for aktiv β-catenin på WDS frisk isolerede fra 18,5 dpc muse embryoer. Den negative kontrol (IgG kontrol) i figur 4D viser ingen farvning. Disse resultater højdepunktrobustheden af ​​denne hele mount immunfarvning protokol, som også kan bruges til mange forskellige antistoffer.

Figur 1. Illustration af det sted, indsnit til isolering af embryonale gonader fra 15,5 dpc foster. Den hvide stiplede linje markerer stedet for at gøre et snit i et 15,5 dpc foster at isolere urogenitale kamme. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Blokdiagram beskriver trinvis procedure for organ- kultur. Klik her til view en større version af dette tal.

Figur 3. Normal WD morfogenese i dyrkningsbetingelser. (A) Testis og WD isoleret fra 15,5 dpc foster. (B) Spiraliseret WD efter 3 d kultur i nærvær af DMSO (kontrol). (C) nr WD coiling blev observeret med IWR1 behandling (en Wnt inhibitor). Arrow markerer WD; t, markerer testis. Barer er lig med 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Hele mount immunolabeling af WDS. (A - B) Hele mount immunfarvning af WDS isolated fra 15,5 dpc fostre og dyrket i 3 dage for Ck8 (A) og PH3 (B). (C) Aktiv βcatenin hele mount immunofluorescens på WD isoleret fra 18,5 dpc foster. (D) Negativ kontrol (IgG kontrol) til aktiv βcatenin på 18,5 dpc WD viser nogen farvning. Pil mærker coiled WD; t, markerer testis. Barer er lig med 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den organkultur system har mange fordele frem for den traditionelle cellekultursystem. Dette system bevarer de oprindelige strukturelle relationer og interaktioner mellem forskellige celletyper. Det efterligner in vivo-systemer og giver mere præcise oplysninger end cellekultur studier, hvor den niche faktor er fraværende. Anvendelsen af ​​organsystemer dyrkningssystemer endda have fordele ved at benytte hele dyret. Disse omfatter de højere omkostninger ved at bruge hele dyret, nem pleje og vedligeholdelse af orgel kultur-system, etc. Desuden kan forskellige farmakologiske midler eller lægemidler testes på isolerede / dyrkede organer og direkte svar af orglet og ikke hele kroppen kan være studerede.

Der er flere kritiske trin, der skal overvejes for vellykket kultur af embryonale WDS. Væv skal indsamles omhyggeligt uden at beskadige deres integritet som beskadigede væv ikke vokser godt og blive cystisk. Overskud af medier på toppen affilter fører også til en cystisk vækst på WDS. Vi udførte væv isolering og dyrkning uden for vævskultur hætte uden nogen forurening. Dyrkningsmedium blev fremstillet og tilsat til plader med 24 brønde inde i vævskultur hætte. Derfor bruger korrekt teknik, der arbejder hurtigt og tage de nødvendige forholdsregler, kan WDS indsamlet udenfor vævskultur hætte dyrkes uden nogen forurening. Mens høste de dyrkede væv, bør der udvises forsigtighed, da de er meget skrøbelige og bør ikke greb direkte med pincet. Væv bør i stedet blive hentet i en tynd film af PBS, der danner mellem de to grene af pincet.

Vi har også beskrevet en detaljeret hel mount immunfluorescens procedure i dette manuskript. Z-stack billeddannelse af væv efter hele mount farvning hjælp konfokal mikroskopi eller stereoskopi giver en fordel til snit gennem hele vævet uden seriel sektionering og farvning flere dias. Det giver således et bedre indtryk afplaceringen af ​​ekspression af målproteiner. Antistof penetration er vanskeligt i væv med højt fiberindhold / ekstracellulær matrix indhold resulterer i et lavere signal. Længere permeabilisering og øget varighed inkubation med primære antistoffer kan være nyttige i sådanne tilfælde. Den anden ulempe ved hele mount farvning er, at opløsningen i en enkelt celle niveau er svært at opnå og kan have behov for særlige mål / mikroskoper. Vi udførte både 1 time og O / N fiksering i 4% PFA og fandt, at disse metoder fungerede godt for de fleste af testede i vores laboratorium, herunder Ck8, PH3, og aktive βcatenin antistoffer antistoffer. Vi har også med held colocalized Ck8 med PH3 eller aktiv βcatenin. For co-lokalisering, blev primære antistoffer for begge markørerne tilsat samtidigt. Disse antistoffer skal rejses i forskellige arter. Under hele mount immunfluorescens procedure, skal der tages yderste omhu, når du tilføjer eller fjerner løsninger væv kan være easily trækkes op i pipettespidsen / overførsel pipette og sidde fast på plastik. For at undgå dette, ændre opløsninger med en 200 uL pipettespids under en Stereoskopet eller dissektion mikroskop og efterlade en lille smule af opløsning ved bunden af ​​rørene. Vi anbefaler at indsamle affaldet løsninger i en ren gennemsigtigt glas bægerglas. Efter hver løsning ændring, tælle antallet af væv i rørene under en Stereoskopet. I tilfælde af utilsigtet tab af væv, kan de udvindes fra bægerglas. Pipettespidser til overførsel af løsninger bør aldrig røre væv, da dette vil beskadige væv og efterlade dem uegnede til billedbehandling.

Til montering af de farvede WDS, vi brugte hulrum slides som at sætte dækglas direkte på toppen af ​​WDS kan komprimere dem og fordreje deres morfologi. Afhængig af tykkelsen af ​​væv, kan dybden af ​​hulrummet nemt manipuleres ved at variere antallet af dækglas strips anvendte. Denne metode til dias FORBEREDELSEn er økonomisk, da det kræver kun dækglas og en diamant pen. Imaging kan også gøres før dækglas, da det er let at orientere og flytte farvede WDS, før de er faste under dækglas. Med hele mount immunfarvning, Z-stack imaging giver bedre billeder og giver flere oplysninger. Til at tage billeder fra forskellige behandlingsgrupper, bør eksponeringen holdes samme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Corning, USA	3524	can be purchased from other vendors
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30031.02	can be purchased from other vendors
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Sigma, USA	D8437	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum (FBS)	Interpath,  Australia	SH30034.02	10% FBS used in culture medium
L-Glutamine	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30034.01	1% concentration used
Penicillin/Streptomycin	Gibco, USA	15070-063	1% concentration used
Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch	Whatman, USA	110409	Membrane (0.8 µm)
IWR1	Sigma, USA	10161-5mg	100 µM concentration used
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences, USA	15710	16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot be disposed of in the sink
Ethanol	Thermo Scientific Fisher, USA	214-20L PL	Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.
Tween-20	Thermo Scientific Fisher, USA	2509-500ml	Very viscous, careful while dispensing
Triton X-100	Sigma, USA	T8787-50ml	Very viscous, careful while dispensing
Di-Sodium Hydrogen Phosphate	Thermo Scientific Fisher, USA	621-500mg	can be purchased from other vendors
Sodium Di-hydrogen Phosphate	Ajax Finechem, USA	4745-500g	can be purchased from other vendors
Sodium Chloride	Thermo Scientific Fisher, USA	465-500g	can be purchased from other vendors
Cytokeratin8/Troma I	Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)	TROMA-I	1:250 in blocking buffer
active βcatenin	Cell Signalling Technology,  USA	D13A1	1:200 in blocking buffer
phospho-Histone 3	Millipore, MA, USA	06-570	1:200 in blocking buffer
Alexa488 Goat anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  USA	111-545-047	1:250 in blocking buffer
Alexa594 Goat anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  USA	112-585-072	1:250 in blocking buffer
Glycerol	Thermo Fisher Scientific, USA	242-500ml	can be purchased from other vendors
n-Propyl galate	Sigma, USA	2370	-
2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)	Sigma, USA	D9564-10mg	Use to stain nucleic acids (DNA)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific, USA	2225-500ml	Solvent
Cover Slips (24 x 50 mm)	Lomb Scientific	CS24501GP	-