Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescensanalyse Farging av Muse Wolffian Kanaler

Summary

Vi presenterer en metode for isolering og kultur av Wolffian mus kanalen (WD). Vi viser også en detaljert prosedyre for hele mount farging av dyrkede / nylig isolerte WDS med fluorescently merkede antistoffer. Sammen utgjør disse teknikkene gjør det mulig å studere WD utvikling, kveiling og differensiering.

Abstract

Tubal morphogenesis er en grunnleggende forutsetning for utviklingen av de fleste pattedyr organer, inkludert mannlige reproduksjonssystemet. Bitestikkelen, en integrert del av den mannlige reproduktive område, er ansvarlig for oppbevaring av sperm, modning, og transport. Den voksne bitestikkelen er en svært kveilet rør som utvikler seg fra en enkel og rett embryonale forløper kjent som Wolffian kanalen (WD). Riktig coiling i bitestikkelen er avgjørende for mannlig fruktbarhet, som sperm i testiklene ikke er i stand til å befrukte en eggcelle. Imidlertid er mekanismen som er ansvarlig for utvikling epididymal og kveiling er fortsatt uklart, delvis på grunn av mangel på hele organkultur, og avbildningsmetoder. I denne studien, beskriver vi en in vitro kultursystem, og hele montere immunfluorescens-protokollen for å bedre visualisere prosessen med WD kveiling og utvikling, som også kan anvendes til å studere andre rørformede organer.

Introduction

Den mannlige reproduksjonssystemet består i hovedsak av testikkel, stedet for bakterie celle utvikling og differensiering, og et komplekst duktalt system som kreves for modningen, transport og lagring av sæd. Bitestikkelen er et rørformet organ som forbinder testikkel med sædlederen og hovedsakelig involvert i post-testikkel utvikling og modning av kjønnsceller ^1. Den svært kveilet voksen mus bitestikkelen utvikler seg fra en enkel og rett forløper tube, Wolffian kanal (WD) ^1. Komplekset og kveilet strukturen i bitestikkelen er avgjørende for sædcellene å skaffe seg kapasitet til å befrukte kvinnelige kjønnsceller ^2. Hvordan en slik vesentlig organ for mannlig fertilitet utvikler seg og kommer inn i formen er ikke godt forstått. Forskjellige signalveier er blitt vist å være involvert i utviklingen av WD som Wnt signalveien ^3,4 og androgen signalveien ^5. Vår siste arbeid har etablert kravet til balanced Wnt signalering for WD vikling under prenatal utvikling ^4. Men videre studier er nødvendig for å forstå mekanismene som er involvert i postnatal epididymal kveiling, cellulær differensiering, og celle-til-celle kommunikasjon i epididymal epitel og med interstitiell celler.

Genmodifiserte musemodeller har vist seg å være et kraftig verktøy for identifisering / validering av molekylære mekanismene bak utvikling og sykdom i ulike organsystemer ^6. Til tross for sin omfattende bruk, det er betydelige begrensninger av genmodifiserte mus modeller, inkludert uforutsette fenotype av målrettede mus mutanter med hensyn til antatt gen-funksjon, og ingen fenotype i null mutanter i enkelte modeller, påvirkning av genetiske og miljømessige faktorer, arbeidskrevende og tidkrevende prosessen med å utvikle musemodeller. Derfor tolkningen av betydningen av funnene bare fra genetisk modisert musemodeller er ikke alltid enkelt ^seks. Disse begrensninger kan overvinnes ved hjelp av in vitro-organkultur-system som gir oss den fleksibilitet til å manipulere flere signalveier i sanntid i kontrollerte dyrkningsbetingelser. Organ kultur systemet er instrumental i å forstå fysiologi og patologi av hele organer ^7. Videre avbildning av hele organer farget med fluoroformerket antistoffer gjør det mulig å visualisere de markører av interesse i en tre-dimensjonal kontekst, som det eksisterer in vivo for derved å tilveiebringe en bedre forståelse av organet form, struktur, funksjon og ^8.

Her har vi beskrevet metoder for isolering av mus embryonale gonadale rygger, in vitro kultur og hele mount immunfluorescens avbildning av WDS, som kan brukes til å besvare en rekke spørsmål om morphogenesis av rørformede organer som WDS. I denne protokollen, viisolerte mus embryonale urogenitale rygger fra 15,5 dager etter samleie (DPC) gravide demninger og dyrket dem for 3 d etterfulgt av farging for en epitelceller markør (cytokeratin 8, CK8), en celle spredning markør (fosfor-Histone 3, PH3) og aktiv βcatenin.

Protocol

Dyr omsorg og eksperimentelle prosedyrer ble gjennomført i samsvar med retningslinjene fra Animal Care og etikkomiteen ved University of Newcastle og bekreftet til New South Wales forsøksdyrloven, New South Wales forsøksdyr forordning, og den australske koden for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige formål. Alle prosedyrer gjennomført på mus ble godkjent av Animal Care og etikkutvalg ved universitetet i Newcastle.

1. Tid Mating

1. Par 6 - 8 uker gammel mann og hunnmus like før slutten av dagslys syklus.
2. Sjekk hunnene for tilstedeværelse av vaginal plugger tidlig morgen (på eller før 08:00), hver dag. Day of plugg regnes som 0,5 DPC.
3. Overfør kvinne med vaginal plugg inn i en ny bur (uten mann), og merker den datoen pluggen.

2. Isolering av mus embryonale gonadal Ridges

1. Isoler mus embryonic gonadale rygger fra 15,5 DPC gravide hunner som beskrevet i ^9, med noen modifikasjoner som beskrevet nedenfor.
2. Gjennomføre disseksjon før middag som tiden gravide kvinner anses å gå inn i neste dag av svangerskapet av ettermiddagen.
3. Sacrifice 15,5 DPC gravide ved hjelp av halshugging (eller som per den godkjente protokollen ved den institusjonelle dyreetikk Committee).
4. Hold musen på ryggen på absorberende papir og spray ventral side av magen med 70% etanol.
5. Løft den nedre magehuden (ventral side) med tang og gjøre en lateral snitt bruker kirurgisk saks, som strekker seg fra urogenitale åpning til slutt på brystkassen. Trekk huden mot hodet på dyret for å eksponere magen.
6. Skjær magemusklene med kirurgisk saks for å avsløre bukhulen. Grab gravid livmor med pinsett like over livmorhalsen og gjøre et kutt. Nå løfter livmoren ved å holde på to urinblæren og kutte livmor brede ligament, etterfulgt av kutt på de uterotubal veikryss å løsne livmor fra peritoneal vedlegg.
7. Overfør livmoren inn i et 50 ml rør inneholdende iskald HBSS (Hanks Balanced Salt Solution). Vask gravid livmor forsiktig med iskald HBSS for å fjerne overflødig blod.
8. Holde livmoren i en petriskål inneholdende iskald HBSS og holde på is. Skjær livmorveggen og ta ut embryoer. Hold embryoene i en frisk petriskål med HBSS på is.
9. Ta en ren steril silkepapir og sette den på en ny petriskål. Spray 70% etanol på silkepapir. Hold embryo på denne silkepapir på den laterale side og kutte den fra nedre del av magen ved hjelp av en steril blad i den retning som er vist med stiplet linje i figur 1.
10. Fest embryo på et sterilt kakebunn ved å feste ryggraden.
11. Plasser den under dissekere stereo og forsiktig klippe langs ventrale midtlinjen. Fjern leveren og tarmene. Musen urogenitale system (nyre, ureter, testikler, WD og sædlederen) skal nå være synlig.
12. Skjær ut testis og WD, og ​​holde en frisk petriskål med HBSS, på is. For å ta ut WD og testis, kutte sædlederen nær sin tilknytning til urinrøret og kutte feste nedre del av WD fra gubernaculum.
13. Pool testiklene og WDS fra embryoer i samme gruppe (dette kan variere i henhold til forsøksplan).

3. Culture of Embryonic gonader Ridges (figur 2)

1. Forbered medium for dyrking av embryonale gonadale rygger ved å supplere DMEM / F12 med 10% FBS (føtalt bovint serum), 1% penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin. Varm opp mediet til 37 ° C i et vannbad.
2. Tilsett 300 ul av medium per brønn av en 24-brønners cellekulturplate.
3. Ta en frisk Petri plate og sette en liten dråpe sterilt HBSS på den. Sett en polykarbonat spor etsemembran (0,881; m) på denne dråpe HBSS med sine blanke overflate som vender mot HBSS.
4. Bruke rene pinsett sette to WDS og gonadene på membranen (på sin ru overflate, vendt oppover) og ta den maksimale mengden av HBSS ved hjelp av sterile våtservietter / absorberende papir. Ikke ta på vev med absorberende papir; ellers vil det skade vevet.
5. Pass på at verken WDS eller gonadene berører hverandre. Ellers vil de holde sammen under påfølgende inkubasjon.
6. Overfør membranen med vevene i brønnen på en 24-brønners plate inneholdende 300 ul kulturmedium og kulturen dem ved luft-medium grensesnitt. For mye dyrkingsmedium på membraner resulterer i en cystisk vekst av WDS.
7. Inkuber platen ved 37 ° C inkubator i nærvær av _5% CO2.
8. Endre kulturen medium hver dag. For å endre medium med pipette, fjern mediet fra brønnen først og deretter legge til 300 mL av prewarmed friskt medium.
   notat:For å studere effekten av forskjellige signalveier på WD morfogenese, kan kjemiske aktivatorer og / eller inhibitorer ved de påkrevde konsentrasjoner tilsettes til kulturmediet.
9. Kultur vev for 3 d. Innen tre d, uncoiled WDS samlet inn fra en 15,5 DPC embryo forvandle seg svært convoluted rør (Figur 3B). Tilsetningen av Wnt inhibitor, IWR1, fører til en hemming av WD vikling (figur 3C).
10. For høsting disse vev ta en petriskål med iskald PBS. Overfør membranen med kultiverte gonade og WD inn i Petri plate. Membranen vil flyte i PBS. Trykk membranen til å synke den i PBS og ta ut gonade og WD.
11. Fest vev med 4% paraformaldehyd (PFA) O / N ved 4 ° C og i 1 time ved RT. Om nødvendig, ta lyse felt bilder av WDS før fiksering.

4. Hele Mount immunfluorescens

1. Vask de faste vev 3x med PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) med langsom vugging, 10 minutter hver, ved RT.
2. Dehydrere vevet i en gradert serie av etanol (25%, 50%, 75% og 100%), 10 minutter hver, ved 4 ° C, med langsom gynge (~ 30 rpm). På dette trinnet kan vevet bli lagret ved 4 ° C i 75% etanol.
   1. For å endre etanol, holde vev uforstyrret i 2 min og la vev slå seg ned. Ta ut så mye supernatant som mulig og deretter legge den neste høyere konsentrasjon av etanol. For å unngå skade på vev, bør pipettespissen ikke røre vev på noe tidspunkt.
3. Etter dehydrering, rehydrere vevet i en gradert serie av etanol (100%, 75%, 50% og 25%), 10 minutter hver, ved 4 ° C, med langsom vugging.
4. Vask vev med PBS-T (PBS + 0,1% Triton X-100), 4x, 20 minutter hver, ved RT, med myk, vuggende (~ 30 rpm).
5. Blokkere vev i 1 time ved RT med blokkeringsbuffer (PBS + 1% BSA + 0,2% ikke-fettholdig tørrmelkpulver + 0,3% Triton X-100).
6. afteR-blokkerende, overføre vev til primær antistoffoppløsning (fortynnet i blokkeringsbuffer) og inkuberes O / N ved 4 ° C med forsiktig gynge (~ 30 rpm). Fortynninger av de primære antistoffene som anvendes er beskrevet i Materialer tabell.
7. Den neste dag, vaskes vevet med PBS-MT (PBS + 2% ikke-fettholdig tørrmelkpulver + 0,5% Tween-20), 4x, 30 minutter hver, ved RT, med myk, vuggende (~ 30 rpm).
8. Etter dette vasketrinn, tilsett sekundært antistoff i en fortynning på 1: 250 (dette trinn må optimaliseringen for de enkelte antistoffer) i blokkeringsbuffer og inkuberes i 1 time ved romtemperatur, med forsiktig vugging.
9. Fra nå og utover holde vev dekket med aluminiumsfolie for å unngå eksponering for lys som sekundære antistoffer merket med lysfølsomme fluorophores.
10. Vask vev 3x med PBS-T (PBS + 0,1% Tween-20), 30 minutter hver, med forsiktig vugging.
11. Forbered lysbilder for montering av farget vev.
    1. For dette, kuttet glass dekkglassi tynne strimler med en diamant penn og stokk to strimler en over den andre på glasset lysbildet bruker neglelakk. Gjør to grenser og sted vev i mellom disse to grensene.
    2. Legg DAPI inneholder monteringsmedium og sette på et dekkglass. Påfør spiker emalje på hjørnene av dekkglass å fikse det til raset.
       Merk: Vev er nå klar for bildebehandling. Lagre disse lysbilder ved -20 ° C.

Representative Results

Under utviklingen gjennomgår WD betydelige endringer, hvor en enkel og rett rør er forvandlet til en svært komplisert og kveilet kanal. Ved hjelp av metodene som er beskrevet ovenfor, WDS gjennomgå en tilsvarende endring i kultur forhold. Her har vi vist resultatene fra WDS dyrket i 3 d (figur 3). Å dissekere molekylære mekanismer som er involvert i WD morfogenese, kan kulturmediet suppleres med inhibitorer og aktivatorer er målrettet mot forskjellige signalveier. Figur 3C viser uncoiled WD etter 3 d av kultur i nærvær av Wnt signale spesifikk hemmer, IWR1 ^10. Piler mark kveilet (figur 3B) og uncoiled WDS (figur 3A og C) som indikerer at undertrykkelse av Wnt signal resultater i hemming av WD coiling (figur 3C). Således kan dette kultursystem bli brukt til å dissekere de molekylære mekanismer som er involvert i løpet av utvik-ling av WDS (eller andre organer).

For å markere ulike celletyper, utførte vi hele mount farging på WDS (figur 4). Her presenterer vi data som validerer bruken av denne protokollen for merking cytoskeletal, cytoplasma, og kjernefysiske proteiner. Figur 4A viser cytokeratin 8 (CK8, en markør av epitelceller) farging av WDS (markert med en pil) dyrket i tre dager. Vi har også søkt den samme protokollen for å vurdere celleproliferasjon ved farging for PH3 (fosfor-Histone tre, en celledeling markør). Figur 4B viser et representativt bilde av PH3 hele mount farging. Grønne prikker er merket med en pil representerer PH3 positive dermed prolifererende celler. Figur 4C viser farging for aktive β-catenin på WDS nylig isolerte fra 18,5 DPC museembryoer. Den negative kontroll (IgG kontroll) i figur 4D viser ingen farging. Disse resultatene høydepunktrobustheten hele denne mount immunofarging-protokollen, som også kan brukes til mange forskjellige antistoffer.

Figur 1. Illustrasjon av området av snittet for isolering av embryonale gonader fra 15,5 DPC embryo. Den hvite stiplede linjen markerer stedet for å lage et snitt i en 15,5 DPC embryo for å isolere urogenitale rygger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Flytskjema som beskriver trinnvis prosedyre for orgel kultur. Klikk her for å VIew en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Normal WD morphogenesis i dyrkningsforhold. (A) testikkel og WD isolert fra 15,5 DPC embryo. (B) Coiled WD etter 3 d kultur i nærvær av DMSO (kontroll). (C) Ingen WD vikling ble observert med IWR1 behandling (en Wnt-hemmer). Arrow markerer WD; t, markerer testikkel. Barer lik 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Antall montere immunolabeling av WDS. (A - B) Hele mount farging av WDS isolated fra 15,5 DPC embryoer og dyrket i 3 dager for CK8 (A) og PH3 (B). (C) Aktiv βcatenin hele mount immunfluorescens på WD isolert fra 18,5 DPC embryo. (D) Negativ kontroll (IgG kontroll) for aktiv βcatenin på 18,5 DPC WD viser ingen flekker. Pilmerkene kveilet WD; t, markerer testikkel. Barer lik 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den organkultursystemet har mange fordeler fremfor de tradisjonelle cellekultursystem. Dette systemet beholder de opprinnelige strukturelle relasjoner og interaksjoner mellom ulike celletyper. Det etterligner in vivo-systemer, og gir mer nøyaktig informasjon enn cellekulturstudier der nisje faktor er fraværende. Bruken av organkultursystemer selv ha fordeler i forhold til å bruke hele dyret. Disse inkluderer høyere kostnader ved å bruke hele dyret, lettstelt og vedlikehold av orgel kultur system, etc. Dessuten kan ulike farmakologiske stoffer eller legemidler testes på isolerte / kultur organer og direkte respons av orgelet og ikke hele kroppen kan være undersøkt.

Det er flere viktige tiltak som må vurderes for vellykket kultur av embryonale WDS. Vev må hentes omhyggelig uten å skade deres integritet, som skadet vev ikke vokser godt og blir cystisk. Overskudd av media på toppen avfilter fører også til en cystisk vekst av WDS. Vi utførte vev isolasjon og kultur utenfor vevskultur panseret uten forurensning. Kulturmedium ble fremstilt og tilsatt til 24-brønners plater inne i vevskultur hette. Derfor bruker riktig teknikk, jobber raskt og ta nødvendige forholdsregler, WDS samlet inn utenfor vevskultur panseret kan dyrkes uten forurensning. Mens høste de dyrkede vev, bør man være forsiktig som de er svært skjøre og bør ikke bli fanget direkte med pinsett. Vev bør i stedet bli plukket opp på en tynn film av PBS som dannes mellom de to armer av tang.

Vi har også beskrevet en detaljert hel mount immunfluorescens prosedyren i dette manuskriptet. Z-stack avbildning av vev etter hele mount flekker ved hjelp konfokalmikroskopi eller stereos gir en fordel til snitt gjennom hele vev uten serie seksjonering og flekker flere lysbilder. Dermed gir det et bedre inntrykk avplasseringen av ekspresjon av målproteiner. Antistoff penetrasjon er vanskelig i vev med høy fiber / ekstracellulære matrise innhold som resulterer i et lavere signal. Lengre permeabiliseringen og øket varighet av inkubasjon med primære antistoffer kan være nyttig i slike tilfeller. Den andre ulempen med hel mount farging er at oppløsningen ved en enkelt celle nivå er vanskelig å oppnå, og kan ha behov for spesielle mål / mikroskoper. Vi har utført både en time og O / N fiksering i 4% PFA og funnet at disse fremgangsmåter fungerte bra for de fleste av antistoffene som ble testet i vårt laboratorium, inkludert CK8, PH3, og aktive βcatenin antistoffer. Vi har også lykkes colocalized CK8 med PH3 eller aktiv βcatenin. For colocalization, ble primære antistoffer for begge merkene lagt samtidig. Disse antistoffene må heves i forskjellige arter. Under hele mount immunfluorescens prosedyre, bør ytterste forsiktighet tas når du legger til eller fjerner løsninger som vev kan være easily trukket opp i pipettespissen / overføringspipetten og sette seg fast i plast. For å unngå dette, må du endre løsninger med en 200 mL pipette under et stereoskop eller disseksjon mikroskop og la litt av løsningen på bunnen av rørene. Vi anbefaler å samle avfallsløsninger i et rent gjennomsiktig glass beger. Etter hver løsning endring, telle antall vev i rørene under ett stereoskop. I tilfelle av utilsiktet tap av vev, kan de utvinnes fra glassbeger. Pipettespisser brukes for å overføre løsninger skal aldri berøre vev da dette vil skade vev og la dem uegnet for bildebehandling.

For montering av farget WDS, brukte vi hulrom lysbilder som å sette dekk direkte på toppen av WDS kan komprimere dem og forvrenge deres morfologi. Avhengig av tykkelsen av vev, kan dybden av hulrommet lett manipuleres ved å variere antallet av dekkstrimler som brukes. Denne metoden for lysbildet agingn er økonomisk som det krever bare dekkglass og en diamant penn. Imaging kan også gjøres før coverslipping som det er lett å orientere og bevege farget WDS før de plasseres under dekkglass. Med hele mount farging, gir Z-stack bildebehandling bedre bilder og gir mer informasjon. For å ta bilder fra ulike behandlingsgruppene, bør eksponeringen holdes samme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Corning, USA	3524	can be purchased from other vendors
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30031.02	can be purchased from other vendors
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Sigma, USA	D8437	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum (FBS)	Interpath,  Australia	SH30034.02	10% FBS used in culture medium
L-Glutamine	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30034.01	1% concentration used
Penicillin/Streptomycin	Gibco, USA	15070-063	1% concentration used
Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch	Whatman, USA	110409	Membrane (0.8 µm)
IWR1	Sigma, USA	10161-5mg	100 µM concentration used
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences, USA	15710	16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot be disposed of in the sink
Ethanol	Thermo Scientific Fisher, USA	214-20L PL	Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.
Tween-20	Thermo Scientific Fisher, USA	2509-500ml	Very viscous, careful while dispensing
Triton X-100	Sigma, USA	T8787-50ml	Very viscous, careful while dispensing
Di-Sodium Hydrogen Phosphate	Thermo Scientific Fisher, USA	621-500mg	can be purchased from other vendors
Sodium Di-hydrogen Phosphate	Ajax Finechem, USA	4745-500g	can be purchased from other vendors
Sodium Chloride	Thermo Scientific Fisher, USA	465-500g	can be purchased from other vendors
Cytokeratin8/Troma I	Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)	TROMA-I	1:250 in blocking buffer
active βcatenin	Cell Signalling Technology,  USA	D13A1	1:200 in blocking buffer
phospho-Histone 3	Millipore, MA, USA	06-570	1:200 in blocking buffer
Alexa488 Goat anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  USA	111-545-047	1:250 in blocking buffer
Alexa594 Goat anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  USA	112-585-072	1:250 in blocking buffer
Glycerol	Thermo Fisher Scientific, USA	242-500ml	can be purchased from other vendors
n-Propyl galate	Sigma, USA	2370	-
2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)	Sigma, USA	D9564-10mg	Use to stain nucleic acids (DNA)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific, USA	2225-500ml	Solvent
Cover Slips (24 x 50 mm)	Lomb Scientific	CS24501GP	-