Summary
हम अलगाव और माउस Wolffian वाहिनी (DD) की संस्कृति के लिए एक तरीका मौजूद है। हम यह भी सुसंस्कृत / fluorescently टैग एंटीबॉडी के साथ हौसले से पृथक WDS के पूरे माउंट immunostaining के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदर्शित करता है। साथ में, इन तकनीकों WD विकास, coiling, और भेदभाव के अध्ययन के लिए सक्षम है।
Abstract
ट्यूबल morphogenesis पुरुष प्रजनन प्रणाली सहित ज्यादातर स्तनधारी अंगों के विकास के लिए एक बुनियादी आवश्यकता है। अधिवृषण, पुरुष प्रजनन तंत्र का एक अभिन्न हिस्सा है, शुक्राणु भंडारण, परिपक्वता, और परिवहन के लिए जिम्मेदार है। वयस्क अधिवृषण एक अत्यधिक कुंडलित ट्यूब कि एक सरल और सीधे भ्रूण Wolffian वाहिनी (DD) के रूप में जाना जाता है अग्रदूत से विकसित करता है। अधिवृषण के समुचित coiling पुरुष प्रजनन क्षमता के लिए आवश्यक है, के रूप में वृषण में शुक्राणु एक oocyte खाद करने में असमर्थ हैं। हालांकि, तंत्र अधिवृषणी विकास और coiling के लिए जिम्मेदार आंशिक रूप से पूरे अंग संस्कृति और इमेजिंग तरीकों की कमी के कारण, अस्पष्ट बनी हुई है। इस अध्ययन में, हम बेहतर WD coiling और विकास है, जो भी अन्य ट्यूबलर अंगों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है की प्रक्रिया कल्पना करने के लिए इन विट्रो संस्कृति प्रणाली और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का वर्णन।
Introduction
पुरुष प्रजनन प्रणाली मुख्य रूप से वृषण के होते हैं, रोगाणु सेल विकास और भेदभाव, और एक जटिल प्रणाली है कि नलीपरक परिपक्वता, परिवहन, और शुक्राणु के भंडारण के लिए आवश्यक है के लिए साइट। अधिवृषण एक ट्यूबलर अंग वीएएस deferens के साथ वृषण और मुख्य रूप से उत्तर-वृषण विकास और रोगाणु कोशिकाओं 1 की परिपक्वता में शामिल जोड़ता है। अत्यधिक कुंडलित वयस्क माउस अधिवृषण एक सरल और सीधे अग्रदूत ट्यूब, Wolffian वाहिनी (DD) 1 से विकसित करता है। अधिवृषण के जटिल और कुंडलित संरचना आवश्यक शुक्राणु मादा जनन कोशिकाओं 2 खाद के लिए क्षमता हासिल करने के लिए है। कैसे पुरुष प्रजनन के लिए इस तरह के एक आवश्यक अंग विकसित करता है और आकार में हो जाता है अच्छी तरह से समझ नहीं है। विभिन्न तरह के संकेत दे रास्ते Wnt संकेतन मार्ग 3,4 और एण्ड्रोजन मार्ग 5 संकेत के रूप में डब्लू डी के विकास में शामिल होना दिखाया गया है। हमारे हाल ही में काम Bal की आवश्यकता की स्थापना की हैसंतुलित Wnt जन्म के पूर्व का विकास 4 के दौरान WD coiling के लिए संकेत है। हालांकि, आगे की पढ़ाई अधिवृषणी उपकला भीतर और मध्य कोशिकाओं के साथ प्रसव के बाद अधिवृषणी coiling, सेलुलर भेदभाव, और सेल करने वाली कोशिका संचार में शामिल तंत्र को समझने के लिए आवश्यक हैं।
आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल के विकास और विभिन्न अंग प्रणालियों 6 की बीमारी अंतर्निहित आणविक तंत्र की पहचान / सत्यापन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित हो गया है। इसकी व्यापक उपयोग के बावजूद, आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल की महत्वपूर्ण सीमाओं, माना जीन समारोह के संबंध के साथ लक्षित माउस म्यूटेंट के unpredicted phenotype, और कुछ मॉडल में अशक्त म्यूटेंट में कोई phenotype, आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव, श्रम गहन और भी शामिल हैं समय लेने वाली माउस मॉडल विकसित करने की प्रक्रिया। इसलिए, केवल आनुवंशिक रूप से मोदी से निष्कर्ष के महत्व की व्याख्याfied माउस मॉडल हमेशा सीधा 6 नहीं है। इन सीमाओं विट्रो अंग संस्कृति प्रणाली है जो हमें लचीलापन नियंत्रित संस्कृति की स्थिति में वास्तविक समय में कई संकेत दे रास्ते में हेरफेर करने देता है में उपयोग करके दूर किया जा सकता है। अंग संस्कृति प्रणाली शरीर विज्ञान और पूरे अंगों 7 की विकृति को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। इसके अलावा, fluorophore लेबल एंटीबॉडी के साथ दाग पूरी अंगों की इमेजिंग हमें एक तीन आयामी संदर्भ में ब्याज की मार्कर कल्पना करने के लिए, के रूप में यह विवो में मौजूद है, जिससे अंग के आकार, संरचना, और समारोह 8 का एक बेहतर समझ प्रदान करने के लिए सक्षम बनाता है।
यहाँ, हम माउस भ्रूण जननांगों लकीरें के अलगाव, इन विट्रो संस्कृति और WDS के पूरे माउंट immunofluorescence इमेजिंग के लिए तरीके, कि इस तरह के रूप में WDS ट्यूबलर अंगों के morphogenesis से संबंधित प्रश्नों की एक किस्म के जवाब देने के लिए लागू किया जा सकता वर्णन किया है। इस प्रोटोकॉल में, हमपृथक माउस भ्रूण 15.5 दिनों से मूत्रजननांगी लकीरें coitum (डीपीसी) गर्भवती बांधों पोस्ट और उनके लिए 3 डी एक उपकला सेल मार्कर (cytokeratin 8, CK8), एक सेल प्रसार मार्कर (phospho-Histone 3, PH3) और सक्रिय करने के लिए immunostaining द्वारा पीछा किया सुसंस्कृत βcatenin।
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Protocol
जानवरों की देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं न्यूकैसल विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और आचार समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार आयोजित की और न्यू साउथ वेल्स पशु अनुसंधान अधिनियम, न्यू साउथ वेल्स पशु अनुसंधान विनियमन, और देखभाल के लिए ऑस्ट्रेलियाई कोड और करने की पुष्टि की थी वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए जानवरों का इस्तेमाल करते हैं। सभी चूहों पर किए गए प्रक्रियाओं न्यूकैसल विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. समय संभोग
- जोड़ी 6 - 8 सप्ताह पुराना नर और मादा चूहों सिर्फ दिन के उजाले चक्र के अंत से पहले।
- योनि प्लग की उपस्थिति सुबह (8.00 पर या इससे पहले AM), हर दिन के लिए महिलाओं की जाँच करें। प्लग के दिवस के रूप में 0.5 डीपीसी माना जाता है।
- एक नए पिंजरे (पुरुष के बिना) में योनि प्लग के साथ महिला स्थानांतरण और प्लग की तारीख लेबल।
2. माउस भ्रूणीय जननांगों लकीरें का अलगाव
- माउस embryon पृथक15.5 डीपीसी गर्भवती महिलाओं से आईसी जननांगों लकीरें 9 में वर्णित है, कुछ संशोधनों के साथ नीचे के रूप में वर्णित है।
- दोपहर के समय के रूप में गर्भवती महिलाओं दोपहर तक गर्भावस्था के अगले दिन में प्रवेश करने पर विचार कर रहे हैं इससे पहले विच्छेदन बाहर ले।
- 15.5 डीपीसी गर्भवती गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करते हुए महिलाओं के बलिदान (या संस्थागत पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार)।
- शोषक टिशू पेपर पर अपनी पीठ पर माउस रखें और स्प्रे 70% इथेनॉल के साथ पेट के उदर की ओर।
- संदंश के साथ पेट के निचले भाग की त्वचा (उदर पक्ष) लिफ्ट और शल्य कैंची का उपयोग कर एक पार्श्व चीरा बनाने, रिब पिंजरे के लिए अंत करने के लिए मूत्रजननांगी खोलने से बढ़ा। पेट को बेनकाब करने के लिए पशु के सिर की ओर त्वचा खींच।
- शल्य कैंची के साथ पेट की मांसपेशियों कट पेरिटोनियल गुहा का पर्दाफाश करने के लिए। सिर्फ गर्भाशय ग्रीवा के ऊपर संदंश के साथ सगर्भा गर्भाशय ले लो और एक काट कर। अब टी पर धारण करके गर्भाशय उठाओ मूत्राशय और गर्भाशय व्यापक बंध पेरिटोनियल लगाव से अलग करने के लिए गर्भाशय uterotubal जंक्शनों पर कटौती के द्वारा पीछा काटा।
- युक्त ठंडा HBSS (हांक बैलेंस्ड नमक समाधान) एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में गर्भाशय स्थानांतरण। ठंडा HBSS के साथ धीरे सगर्भा गर्भाशय धो अतिरिक्त रक्त हटा दें।
- युक्त ठंडा HBSS एक पेट्री डिश में गर्भाशय रखें और बर्फ पर रख। गर्भाशय की दीवार कट और भ्रूण को बाहर ले। बर्फ पर HBSS के साथ एक ताजा पेट्री डिश में भ्रूण रखें।
- एक साफ बाँझ टिशू पेपर ले लो और एक नया पेट्री डिश पर डाल दिया। टिशू पेपर पर 70% इथेनॉल स्प्रे। पार्श्व पक्ष पर इस टिशू पेपर पर भ्रूण रखें और दिशा में एक बाँझ ब्लेड का उपयोग कर पेट के निचले हिस्से से यह कटौती के रूप में चित्रा 1 में बिंदीदार रेखा से दिखाया गया है।
- कशेरुका स्तंभ लगाए द्वारा एक बाँझ स्पंज आधार पर भ्रूण को ठीक करें।
- यह विदारक stereomicroscope के तहत जगह और ध्यान से उदर midline के साथ काटा। जिगर और आंतों निकालें। माउस मूत्रजननांगी प्रणाली (गुर्दे, मूत्रवाहिनी, वृषण, डब्लू डी, और वीएएस deferens) अब दिखाई जानी चाहिए।
- वृषण और WD बाहर कट, और, HBSS के साथ एक ताजा पेट्री डिश में रखने के लिए बर्फ पर। WD और वृषण बाहर ले करने के लिए, मूत्रमार्ग के लिए अपने लगाव के करीब वीएएस deferens में कटौती और gubernaculum से डब्लू डी के निचले हिस्से की कुर्की काटा।
- एक ही समूह के भ्रूण (इस प्रायोगिक योजना के अनुसार भिन्न हो सकते हैं) से वृषण और WDS पूल।
3. भ्रूण जननांगों लकीरें की संस्कृति (चित्रा 2)
- 10% FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम), 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1% एल glutamine के साथ DMEM / F12 सप्लीमेंट द्वारा भ्रूण जननांगों लकीरें संवर्धन के लिए मध्यम तैयार। एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया गर्म।
- 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली के प्रति अच्छी तरह से मीडिया के 300 μL जोड़ें।
- एक ताजा पेट्री थाली ले लो और उस पर बाँझ HBSS की एक छोटी सी बूंद डाल दिया। एक पॉली कार्बोनेट ट्रैक खोदना झिल्ली रखो (0.881, एम) ने अपनी चमक सतह HBSS का सामना करना पड़ के साथ HBSS के इस गिरावट पर।
- का उपयोग करते हुए साफ संदंश (अपने किसी न किसी सतह पर, ऊपर की ओर का सामना करना पड़) झिल्ली पर दो WDS और gonads डाल दिया है और बाँझ पोंछे / शोषक कागज का उपयोग HBSS की अधिकतम राशि को हटा दें। शोषक कागज के साथ ऊतक मत छुओ; अन्यथा, यह ऊतकों को नुकसान होगा।
- सुनिश्चित करें कि न तो है और न ही WDS gonads एक दूसरे को छू रहे हैं। अन्यथा, वे बाद में गर्मी के दौरान एक साथ रहना होगा।
- एक 24 अच्छी तरह से थाली एयर मध्यम इंटरफेस में 300 μL संस्कृति के माध्यम से और उन्हें संस्कृति युक्त के कुएं में ऊतकों के साथ झिल्ली स्थानांतरण। WDS का एक पित्ताशय विकास में झिल्ली परिणामों पर बहुत ज्यादा संस्कृति के माध्यम से।
- 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं, 5% सीओ 2 की उपस्थिति में।
- हर दिन संस्कृति के माध्यम से बदलें। विंदुक के साथ मध्यम बदलने के लिए, अच्छी तरह से पहले से मध्यम हटाने और फिर prewarmed ताजा माध्यम के 300 μL जोड़ें।
ध्यान दें:WD morphogenesis पर विभिन्न संकेत दे रास्ते के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, आवश्यक मात्रा में रासायनिक activators और / या अवरोधकों संस्कृति के माध्यम से जोड़ा जा सकता है। - संस्कृति के लिए 3 डी ऊतकों। भीतर 3 डी, uncoiled एक 15.5 डीपीसी भ्रूण से एकत्र WDS अत्यधिक जटिल ट्यूब (चित्रा 3 बी) में बदलना। Wnt अवरोध, IWR1, के अलावा WD coiling (चित्रा 3 सी) के निषेध में यह परिणाम है।
- कटाई के लिए इन ऊतकों ठंडा पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश ले। पेट्री थाली में सुसंस्कृत gonad और WD साथ झिल्ली स्थानांतरण। झिल्ली पीबीएस पर जारी करेगी। पीबीएस में यह सिंक और जननपिंड और WD बाहर ले जाने की झिल्ली प्रेस।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर या आरटी पर 1 घंटे के लिए के साथ 4% paraformaldehyde (पीएफए) हे / एन ऊतकों को ठीक करें। यदि आवश्यक हो, निर्धारण से पहले WDS के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों ले।
4. पूरा पर्वत इम्यूनोफ्लोरेसेंस
- धो तय ऊतकों पीबीएस-टी (पीबीएस + 1% के साथ 3xट्राइटन X-100) धीमी कमाल, 10 मिनट प्रत्येक, आरटी पर साथ।
- इथेनॉल (25%, 50%, 75% और 100%), 10 मिनट प्रत्येक के एक वर्गीकृत श्रृंखला में ऊतकों निर्जलीकरण, 4 डिग्री सेल्सियस पर, धीमी गति से कमाल (~ 30 rpm) के साथ। इस चरण में, ऊतकों 75% इथेनॉल में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
- इथेनॉल बदलने के लिए, ऊतकों 2 मिनट के लिए अबाधित रखने के लिए और जाने के लिए ऊतकों बसने। जितना संभव हो उतना सतह पर तैरनेवाला बाहर ले लो और फिर इथेनॉल के अगले उच्च एकाग्रता जोड़ें। ऊतकों को कोई नुकसान से बचने के लिए, पिपेट टिप किसी भी स्तर पर ऊतकों स्पर्श नहीं करना चाहिए।
- निर्जलीकरण के बाद धीमी गति से कमाल के साथ, इथेनॉल (100%, 75%, 50% और 25%), 10 मिनट प्रत्येक के एक वर्गीकृत श्रृंखला में ऊतकों rehydrate, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
- , सौम्य कमाल (~ 30 rpm) के साथ पीबीएस-टी (पीबीएस + 0.1% ट्राइटन X-100), 4x, 20 मिनट प्रत्येक, आरटी पर साथ ऊतकों को धो लें।
- बफर अवरुद्ध साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए ऊतकों ब्लॉक (पीबीएस + 1% बीएसए + 0.2% गैर वसा शुष्क दूध पाउडर + 0.3% ट्राइटन X-100)।
- afteआर अवरुद्ध, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान करने के ऊतकों (बफर अवरुद्ध में पतला) हस्तांतरण और सौम्य कमाल (~ 30 rpm) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन। इस्तेमाल किया प्राथमिक एंटीबॉडी के dilutions सामग्री तालिका में वर्णित हैं।
- अगले दिन, पीबीएस मीट्रिक टन (पीबीएस + 2% गैर वसा शुष्क दूध पाउडर + 0.5% बीच 20), 4x, 30 मिनट प्रत्येक, आरटी पर साथ ऊतकों धोने सौम्य कमाल (~ 30 rpm) के साथ।
- अवरुद्ध बफर में 250 (इस कदम के अलग-अलग एंटीबॉडी के लिए अनुकूलन की जरूरत है) और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं, कोमल कमाल के साथ: इस चरण धोने के बाद, 1 की एक कमजोर पड़ने पर माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें।
- अब के बाद से ऊतकों के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी प्रकाश के प्रति संवेदनशील fluorophores के साथ लेबल रहे प्रकाश के संपर्क को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर रखने के लिए।
- धो ऊतकों, पीबीएस-टी (पीबीएस + 0.1% बीच 20), 30 मिनट प्रत्येक के साथ 3x कोमल कमाल के साथ।
- दाग ऊतकों बढ़ते के लिए स्लाइड तैयार करें।
- इस के लिए, कांच कवर फिसल जाता है कटौतीएक हीरे की कलम और का उपयोग कर पतली स्ट्रिप्स में दो स्ट्रिप्स नाखून तामचीनी का उपयोग कर गिलास स्लाइड पर एक दूसरे के ऊपर चिपके रहते हैं। इन दो सीमाओं के बीच में दो चौके और जगह ऊतकों बनाओ।
- DAPI युक्त बढ़ते मध्यम जोड़ें और एक कवर पर्ची पर डाल दिया। कवर पर्ची के कोनों पर नाखून तामचीनी लागू स्लाइड करने के लिए इसे ठीक करने के लिए।
नोट: ऊतकों अब इमेजिंग के लिए तैयार हैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर इन स्लाइड्स स्टोर।
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Representative Results
विकास के दौरान, WD महत्वपूर्ण परिवर्तन जिसमें एक सरल और सीधे ट्यूब एक अत्यधिक जटिल और coiled वाहिनी में तब्दील हो जाता आए। ऊपर वर्णित विधियों का प्रयोग, WDS संस्कृति की स्थिति में एक समान परिवर्तन से गुजरना। यहाँ हम के लिए 3 डी (चित्रा 3) सुसंस्कृत WDS से परिणाम से पता चला है। आणविक WD morphogenesis में शामिल तंत्र काटना करने के लिए, संस्कृति के माध्यम अवरोधकों और activators अलग संकेत दे रास्ते को निशाना बनाने के साथ पूरक हो सकते हैं। चित्रा -3 सी विशेष अवरोध, IWR1 10 सिगनल Wnt की उपस्थिति में करने के बाद संस्कृति के 3 डी डब्लू डी uncoiled दिखाता है। तीर coiled मार्क (चित्रा 3 बी) और WDS (आंकड़े 3 ए और सी) uncoiled WD coiling (चित्रा 3 सी) के निषेध में WNT सिगनल परिणामों के उस दमन का संकेत है। इस प्रकार, इस संस्कृति प्रणाली आणविक गतिविधियों के दौरान शामिल तंत्र काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताWDS की opment (या अन्य अंगों)।
विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं लेबल के लिए, हम WDS पर पूरे माउंट immunostaining (चित्रा 4) का प्रदर्शन किया। यहाँ हम लेबलिंग cytoskeletal, cytoplasmic और परमाणु प्रोटीन के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग मान्य डेटा प्रस्तुत करते हैं। चित्रा -4 ए cytokeratin 8 (CK8, उपकला कोशिकाओं के एक मार्कर) WDS के immunostaining (एक तीर से चिह्नित) तीन दिनों के लिए सुसंस्कृत प्रतिनिधित्व करता है। हम यह भी PH3 (phospho-Histone 3, एक सेल प्रसार मार्कर) के लिए immunostaining द्वारा सेल प्रसार का आकलन करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल का आवेदन किया है। चित्रा 4 बी PH3 पूरे माउंट immunostaining के एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। ग्रीन एक तीर से चिह्नित डॉट्स PH3 सकारात्मक इसलिए proliferating कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा 4C WDS हौसले 18.5 डीपीसी माउस भ्रूण से पृथक पर सक्रिय β-catenin के लिए immunostaining दिखाता है। चित्रा 4D में नकारात्मक नियंत्रण (आईजीजी नियंत्रण) कोई धुंधला से पता चलता। इन परिणामों पर प्रकाश डालाइस पूरे माउंट immunostaining प्रोटोकॉल है, जो भी कई अलग अलग एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता की मजबूती।
15.5 डीपीसी भ्रूण से चित्रा 1. भ्रूण gonads के अलगाव के लिए चीरा की साइट के चित्रण। सफेद बिंदीदार रेखा मूत्रजननांगी लकीरें अलग करने के लिए एक 15.5 डीपीसी भ्रूण में एक चीरा बनाने के लिए साइट का प्रतीक है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. प्रवाह आरेख अंग संस्कृति के लिए चरणबद्ध प्रक्रिया का वर्णन है। Vi के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण ईडब्ल्यू।
चित्रा 3. संस्कृति की स्थिति में सामान्य WD morphogenesis। (ए) वृषण और WD 15.5 डीपीसी भ्रूण से अलग किया। (बी) दबाई WD DMSO (नियंत्रण) की उपस्थिति में 3 डी संस्कृति के बाद। (सी) नहीं WD coiling IWR1 उपचार (एक Wnt अवरोध) के साथ मनाया गया। तीर डब्लू डी के निशान; टी, वृषण के निशान। बार्स 100 माइक्रोन के बराबर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. पूरी WDS की immunolabeling माउंट। (ए - बी) WDS इसोला के पूरे माउंट immunostaining15.5 डीपीसी भ्रूण से टेड और के लिए CK8 (ए) और PH3 (बी) के लिए 3 डी सुसंस्कृत। (सी) WD पर पूरे माउंट immunofluorescence βcatenin सक्रिय 18.5 डीपीसी भ्रूण से अलग किया। (डी) नकारात्मक नियंत्रण (आईजीजी नियंत्रण) सक्रिय βcatenin के लिए 18.5 पर डीपीसी WD कोई धुंधला दिखा। तीर coiled डब्लू डी के निशान; टी, वृषण के निशान। बार्स 100 माइक्रोन के बराबर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
अंग संस्कृति प्रणाली पारंपरिक सेल संस्कृति प्रणाली पर कई फायदे हैं। इस प्रणाली के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच मूल संरचनात्मक संबंधों और बातचीत को बरकरार रखे। यह विवो प्रणालियों में mimics और सेल संस्कृति के अध्ययन जहां आला कारक अनुपस्थित है की तुलना में अधिक सटीक जानकारी देता है। अंग संस्कृति सिस्टम के उपयोग भी पूरे जानवर का उपयोग कर अधिक लाभ है। ये पूरे जानवर, आसान देखभाल और अंग संस्कृति प्रणाली के रखरखाव, आदि इसके अलावा का उपयोग कर की ऊंची लागत में शामिल हैं, विभिन्न औषधीय एजेंटों या दवाओं पृथक / सुसंस्कृत अंगों और अंग की सीधी प्रतिक्रिया नहीं है और पूरे शरीर को हो सकता है पर परीक्षण किया जा सकता का अध्ययन किया।
वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम भ्रूण WDS के सफल संस्कृति के लिए विचार किया जाना चाहिए कि कर रहे हैं। ऊतकों, उनकी ईमानदारी को नुकसान पहुँचाए बिना सावधानी से एकत्र किया जाना चाहिए क्षतिग्रस्त ऊतकों की अच्छी तरह से विकसित नहीं है और सिस्टिक हो जाते हैं। के शीर्ष पर मीडिया के अतिरिक्तफिल्टर भी WDS का एक पित्ताशय विकास की ओर जाता है। हम किसी भी संक्रमण के बिना टिशू कल्चर हुड के बाहर ऊतक अलगाव और संस्कृति का प्रदर्शन किया। संस्कृति के माध्यम से तैयार किया है और टिशू कल्चर हुड के अंदर 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए जोड़ा गया है। इसलिए, उचित तकनीक का उपयोग करते हुए जल्दी से काम करने और आवश्यक सावधानियों ले रही है, टिशू कल्चर हुड के बाहर एकत्र WDS किसी भी संक्रमण के बिना संवर्धित किया जा सकता है। सुसंस्कृत ऊतकों कटाई करते हैं, देखभाल के रूप में वे बहुत कमजोर हैं और संदंश के साथ सीधे नहीं पकड़ा जाना चाहिए लिया जाना चाहिए। ऊतकों के बजाय पीबीएस की एक पतली फिल्म है कि संदंश के दो हथियार के बीच रूपों में उठाया जाना चाहिए।
हम भी इस पांडुलिपि में एक विस्तृत पूरे माउंट immunofluorescence प्रक्रिया का वर्णन किया है। confocal माइक्रोस्कोपी या stereoscopy का उपयोग करते हुए पूरे माउंट धुंधला के बाद ऊतकों के Z ढेर इमेजिंग सीरियल सेक्शनिंग और एकाधिक स्लाइड धुंधला बिना पूरे ऊतकों के माध्यम से खंड के लिए एक लाभ देता है। इस प्रकार, यह का एक बेहतर विचार देता हैलक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति का स्थान। एंटीबॉडी पैठ एक कम संकेत है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च फाइबर / बाह्य मैट्रिक्स सामग्री के साथ ऊतकों में मुश्किल है। लंबे समय तक permeabilization और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन की वृद्धि की अवधि में इस तरह के मामलों में उपयोगी हो सकता है। पूरे माउंट धुंधला की अन्य नुकसान यह है कि एक एकल कोशिका के स्तर पर संकल्प को प्राप्त करने के लिए कठिन है और विशेष उद्देश्यों / माइक्रोस्कोप की आवश्यकता हो सकती है। हम 4% पीएफए में दोनों 1 घंटे और ओ / एन निर्धारण प्रदर्शन किया और पाया कि इन तरीकों CK8, PH3, और सक्रिय βcatenin एंटीबॉडी सहित हमारी प्रयोगशाला में परीक्षण किया एंटीबॉडी के बहुमत के लिए अच्छी तरह से काम किया। हम भी सफलतापूर्वक PH3 या सक्रिय βcatenin साथ CK8 colocalized है। colocalization के लिए, दोनों मार्करों के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी एक साथ जोड़ा गया था। ये एंटीबॉडी विभिन्न प्रजातियों में उठाया जाना चाहिए। पूरे माउंट immunofluorescence प्रक्रिया के दौरान, जब जोड़ने या हटाने के समाधान के रूप में ऊतकों easil हो सकता अत्यंत सावधानी से लिया जाना चाहिएY विंदुक टिप / स्थानांतरण पिपेट में ऊपर खींचा और प्लास्टिक के लिए अटक जाते हैं। इससे बचने के लिए, एक त्रिविमदर्शी या विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे एक 200 μL विंदुक टिप के साथ समाधान बदलने और ट्यूबों के तल पर समाधान का एक छोटा सा छोड़ दें। हम एक स्वच्छ पारदर्शी कांच बीकर में अपशिष्ट समाधान एकत्रित सलाह देते हैं। प्रत्येक समाधान परिवर्तन के बाद, एक स्टिरियोस्कोप के तहत ट्यूबों में ऊतकों की संख्या गिनती। ऊतकों का आकस्मिक नुकसान के मामले में, वे कांच बीकर से बरामद किया जा सकता है। पिपेट सुझावों का समाधान स्थानांतरित ऊतकों स्पर्श नहीं करना चाहिए, क्योंकि यह ऊतकों को नुकसान पहुंचा है और उन्हें इमेजिंग के लिए अनुपयुक्त छोड़ देंगे लिए इस्तेमाल किया।
सना हुआ WDS बढ़ते के लिए, हम coverslips WDS के शीर्ष पर सीधे डाल उन्हें सेक और उनकी आकृति विज्ञान विकृत कर सकते हैं के रूप में गुहा स्लाइड इस्तेमाल किया। ऊतकों की मोटाई के आधार पर, गुहा की गहराई आसानी से इस्तेमाल किया coverslip स्ट्रिप्स की संख्या अलग से चालाकी से किया जा सकता है। स्लाइड preparatio का यह तरीकाn किफायती है क्योंकि यह केवल कवर फिसल जाता है और एक हीरे की कलम की आवश्यकता है। इमेजिंग भी coverslipping के रूप में यह ओरिएंट करने के लिए आसान है और दाग WDS को स्थानांतरित करने से पहले वे coverslips के तहत तय कर रहे हैं से पहले किया जा सकता है। पूरे माउंट immunostaining के साथ, जेड ढेर इमेजिंग बेहतर छवियों देता है और अधिक जानकारी प्रदान करता है। अलग उपचार समूहों से छवियों को लेने के लिए, जोखिम ही रखा जाना चाहिए।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए स्त्री रोग कैंसर विज्ञान समूह के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम के हिस्से में राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद, ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद, और कैंसर संस्थान एनएसडब्ल्यू (पीएसटी) से धन के द्वारा समर्थित है। एमके न्यूकैसल स्नातकोत्तर रिसर्च फैलोशिप के विश्वविद्यालय के एक प्राप्तकर्ता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 µm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| phospho-Histone 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | - |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
References
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- Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nat Med. 14, 979-984 (2008).
