Summary
ونحن نقدم وسيلة لعزل وثقافة قناة وولف الماوس (WD). نحن أيضا يبرهن على وجود إجراءات مفصلة لجبل بأكمله المناعية من WDS مثقف / المعزولة حديثا مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا، وتمكن هذه التقنيات دراسة التطور WD، اللف، والتمايز.
Abstract
التشكل البوق هو شرط أساسي لتنمية معظم أجهزة الثدييات، بما في ذلك الجهاز التناسلي الذكري. البربخ، جزءا لا يتجزأ من الجهاز التناسلي الذكري، هو المسؤول عن تخزين الحيوانات المنوية، والنضج، والنقل. البربخ الكبار هو أنبوب ملفوف جدا أن يتطور من السلائف الجنينية بسيطة ومباشرة والمعروفة باسم قناة وولف (WD). اللف السليم من البربخ هو ضروري لخصوبة الرجال، كما الحيوانات المنوية في الخصية غير قادرين على تخصيب بويضة. ومع ذلك، فإن الآلية المسؤولة عن التنمية بربخي واللف لا تزال غير واضحة، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود طرق الثقافة الجهاز والتصوير كله. في هذه الدراسة، ونحن تصف نظام الثقافة في المختبر، وكله بروتوكول المناعي جبل لتصور أفضل لعملية WD اللف والتنمية، والتي يمكن أيضا أن تطبق على دراسة أجهزة الأنبوبية الأخرى.
Introduction
الجهاز التناسلي الذكري يتكون أساسا من الخصية، موقع لتطوير الخلايا الجرثومية والتمايز، ونظام الأقنية معقدة ما هو مطلوب للنضوج، والنقل، وتخزين الحيوانات المنوية. البربخ هو الجهاز الأنبوبي الذي يصل الخصية مع الأسهر وتشارك بشكل رئيسي في تطوير ما بعد الخصية ونضوج الخلايا الجرثومية 1. البربخ الماوس الكبار ملفوف غاية تتطور من بسيطة ومباشرة أنبوب السلائف، قناة وولف (WD) 1. بنية معقدة وملفوف من البربخ هو ضروري للحيوانات المنوية لاكتساب القدرة على تخصيب خلايا الإناث الجرثومية 2. كيف هذا الجهاز ضروري لخصوبة الرجال يتطور ويحصل في شكل ليست مفهومة جيدا. وقد ثبت مختلف مسارات الإشارات إلى أن تشارك في تطوير WD مثل إشارات Wnt مسار 3،4 والاندروجين إشارات الطريق 5. وقد أنشأت عملنا مؤخرا شرط بالanced WNT يشير لWD اللف خلال تطوير ما قبل الولادة (4). ومع ذلك، هناك حاجة مزيد من الدراسات لفهم الآليات التي تشارك في اللف بعد الولادة بربخي، تمايز الخلايا، والاتصالات خلية إلى خلية داخل الظهارة بربخي ومع خلايا الخلالية.
وقد ثبت نماذج الماوس المعدلة وراثيا ليكون أداة قوية لتحديد / التحقق من الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور والمرض من أجهزة الجسم المختلفة 6. وعلى الرغم من الاستخدام الواسع النطاق، وهناك قيود كبيرة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا، بما في ذلك النمط الظاهري غير متوقع من المسوخ الماوس المستهدفة فيما يتعلق وظيفة الجين يفترض، وليس النمط الظاهري في المسوخ فارغة في بعض الموديلات، تأثير العوامل الوراثية والبيئية، والعمل المكثف و عملية تطوير نماذج الماوس تستغرق وقتا طويلا. ولذلك، فإن تفسير أهمية النتائج فقط من مودى وراثيانماذج الماوس fied ليست دائما واضحة 6. هذه القيود يمكن التغلب عليها باستخدام في نظام الثقافة الجهاز المختبر الذي يعطي لنا المرونة اللازمة لمعالجة مسارات إشارات متعددة في الوقت الحقيقي في ظروف الثقافة التي تسيطر عليها. نظام الثقافة الجهاز هو دور أساسي في فهم علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض من أجهزة كاملة 7. وعلاوة على ذلك، والتصوير الأجهزة كلها ملطخة الأجسام المضادة fluorophore المسمى تمكننا من تصور علامات الاهتمام في سياق ثلاثي الأبعاد، كما هو موجود في الجسم الحي، وبالتالي توفير فهم أفضل لشكل الجهاز، وهيكل، وظيفة 8.
هنا، التي وصفناها الطرق لعزل الماوس التلال الغدد التناسلية الجنينية، في المختبر الثقافة وجبل بأكمله المناعي التصوير WDS، التي يمكن تطبيقها للرد على مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة التشكل من أجهزة أنبوبي مثل WDS. في هذا البروتوكول، ونحنمعزولة الماوس الجنينية التلال البولي التناسلي من 15.5 يوم تال للجماع (DPC) السدود الحوامل ومثقف منهم لمدة 3 د تليها المناعية للعلامة الظهارية خلية (cytokeratin 8، CK8)، علامة تكاثر الخلايا (الفوسفات-هيستون 3، PH3) ونشطة βcatenin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت رعاية الحيوان والإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية وأخلاقيات الحيوان من جامعة نيوكاسل، وأكد أن قانون نيو ساوث ويلز الحيوان بحوث، نيو ساوث ويلز الحيوان تنظيم البحوث، ورمز الاسترالي لرعاية و استخدام الحيوانات لأغراض علمية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتخذة على الفئران عن طريق لجنة الرعاية وأخلاقيات الحيوان من جامعة نيوكاسل.
1. الوقت التزاوج
- الزوج 6-8 أسابيع من العمر من الذكور وإناث الفئران فقط قبل نهاية دورة وضح النهار.
- تحقق من الإناث لوجود المقابس المهبلية الصباح الباكر (في أو قبل 08:00)، كل يوم. ويعتبر اليوم من المكونات 0.5 DPC.
- نقل الأنثى مع المكونات المهبلية في قفص جديد (بدون ذكر) وتسمية تاريخ المكونات.
2. عزل الفأر الجنينية الغدد التناسلية مرتفعات
- عزل embryon الماوسجيم التلال الغدد التناسلية من 15.5 DPC الإناث الحوامل كما هو موضح في 9، مع بعض التعديلات كما هو موضح أدناه.
- تنفيذ تشريح قبل الظهر كما في المرة تعتبر الإناث الحوامل للدخول في اليوم التالي من الحمل بعد الظهر.
- تضحية 15.5 DPC الإناث الحوامل باستخدام خلع عنق الرحم (أو وفقا للبروتوكول المعتمد من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوانية المؤسسية).
- الحفاظ على الماوس على ظهرها على المناديل الورقية الماصة ورش الجانب البطني من البطن مع الايثانول 70٪.
- رفع جلد البطن السفلي (الجانب البطني) مع ملقط وجعل شق الوحشي باستخدام مقص جراحي، وتمتد من افتتاح البولي التناسلي حتى النهاية لالقفص الصدري. سحب الجلد نحو رأس الحيوان لفضح البطن.
- قطع عضلات البطن مع مقص جراحي لفضح التجويف البريتوني. الاستيلاء على الرحم الحامل مع ملقط فقط فوق عنق الرحم واجراء خفض. الآن رفع الرحم عن طريق الضغط على رس المثانة البولية وقطع في الرباط واسع الرحم تليها تخفيضات في تقاطعات رحمي بوقي الرحم لفصل من المرفق البريتوني.
- نقل الرحم في أنبوب 50 مل تحتوي على الجليد الباردة HBSS (هانك المتوازن محلول الملح). غسل الرحم الحامل بلطف مع الجليد الباردة HBSS لإزالة الدم الزائد.
- إبقاء الرحم في طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة HBSS والحفاظ على الجليد. قطع جدار الرحم وإخراج الأجنة. الحفاظ على الأجنة في طبق بيتري جديدة مع HBSS على الجليد.
- إلقاء المناديل الورقية المعقمة نظيفة ووضعها على طبق بيتري جديد. رذاذ الايثانول 70٪ على المناديل الورقية. حافظ على الجنين في هذه المناديل الورقية على الجانب الوحشي وقطع عليه من أسفل البطن باستخدام شفرة معقمة في الاتجاه كما يتضح من الخط المنقط في الشكل 1.
- إصلاح الجنين على قاعدة الإسفنج العقيمة التي تعلق في العمود الفقري.
- وضعه تحت مجهر تشريحي تشريح وقطع بعناية على طول خط الوسط بطني. إزالة الكبد والأمعاء. نظام الماوس البولي التناسلي (الكلى، الحالب، الخصية، WD، والأسهر) الآن يجب أن تكون واضحة.
- قطع الخصية و WD، ونضع في طبق بتري جديدة مع HBSS، على الجليد. لإخراج WD والخصية، وقطع الأسهر قريبة من حرصه على مجرى البول وخفض الحجز على الجزء السفلي من WD من رسن.
- تجمع الخصيتين وWDS من الأجنة من نفس المجموعة (و يمكن أن يختلف وفقا لخطة تجريبية).
3. ثقافة الجنينية الغدد التناسلية مرتفعات (الشكل 2)
- إعداد المتوسطة لزراعة التلال الغدد التناسلية الجنينية من خلال استكمال DMEM / F12 مع 10٪ FBS (مصل بقري جنيني)، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و 1٪ L-الجلوتامين. تدفئة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام لكل بئر من 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية.
- تأخذ لوحة بيتري الطازجة ووضع قطرة صغيرة من المعقم HBSS على ذلك. وضع غشاء البولي المسار حفر (0.881؛ م) على هذا قطرة من HBSS مع سطح ساطع تواجه HBSS.
- وضعت باستخدام ملقط نظيفة اثنين WDS والغدد التناسلية على الغشاء (على سطحه خشن، التي تواجه أعلى) وإزالة أكبر قدر ممكن من HBSS باستخدام مناديل معقمة / ورقة ماصة. لا تلمس الأنسجة مع ورقة ماصة للرطوبة؛ خلاف ذلك، فإنه سوف يضر الأنسجة.
- ضمان أن لا WDS ولا الغدد التناسلية ولمس بعضها البعض. خلاف ذلك، فإنها تلتصق ببعضها البعض أثناء الحضانة لاحقة.
- نقل الغشاء مع الأنسجة في بئر من 24 لوحة جيدا يحتوي على 300 ميكرولتر مستنبت والثقافة لهم في واجهة المتوسطة الهواء. الكثير من مستنبت على النتائج الأغشية في نمو الكيسي من WDS.
- احتضان لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية، في ظل وجود 5٪ CO 2.
- تغيير ثقافة المتوسط كل يوم. لتغيير المتوسطة مع ماصة، وإزالة المتوسطة من أول جيدا ثم إضافة 300 ميكرولتر من متوسطة جديدة prewarmed.
ملاحظة:لدراسة تأثير مسارات الإشارات المختلفة على WD التشكل، ويمكن أن يضاف المنشطات الكيميائية و / أو مثبطات في التركيزات المطلوبة لمستنبت. - ثقافة الأنسجة لمدة 3 د. خلال 3 د، WDS محلول التي تم جمعها من 15.5 DPC الجنين تتحول إلى أنابيب الملتوية للغاية (الشكل 3B). إضافة المانع WNT، IWR1، والنتائج في تثبيط WD اللف (الشكل 3C).
- لحصاد هذه الأنسجة تأخذ طبق بيتري مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني. نقل الغشاء مع الغدد التناسلية مثقف وWD إلى لوحة بيتري. فإن غشاء تطفو على برنامج تلفزيوني. اضغط على غشاء لاغراقها في برنامج تلفزيوني واخراج الغدد التناسلية و WD.
- إصلاح الأنسجة مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) O / N عند 4 درجات مئوية أو لمدة 1 ساعة على RT. إذا لزم الأمر، واتخاذ الصور الحقل مشرقة من WDS قبل التثبيت.
4. الجامع جبل المناعي
- غسل الأنسجة الثابتة 3X مع برنامج تلفزيوني-T (PBS + 1٪تريتون X-100) مع هزاز بطيئة، 10 دقيقة لكل منهما، في RT.
- يذوى الأنسجة في سلسلة متدرجة من الايثانول (25٪، 50٪، 75٪ و 100٪)، و 10 دقيقة لكل منهما، في 4 درجات مئوية، مع بطء هزاز (~ 30 دورة في الدقيقة). في هذه الخطوة، والأنسجة ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية في 75٪ من الإيثانول.
- لتغيير الإيثانول، والحفاظ على الأنسجة دون عائق لمدة 2 دقيقة، والسماح للأنسجة يستقر. إخراج أكبر قدر من طاف وقت ممكن ثم قم بإضافة تركيز أعلى المقبل من الإيثانول. لتجنب أي ضرر للأنسجة، ينبغي للطرف ماصة لا تلمس الأنسجة في أي مرحلة.
- وبعد الجفاف، وترطيب أنسجة في سلسلة متدرجة من الإيثانول (100٪، 75٪، 50٪ و 25٪)، و 10 دقيقة لكل منهما، في 4 درجات مئوية، مع هزاز بطيئة.
- غسل الأنسجة مع PBS-T (PBS + 0.1٪ تريتون X-100)، 4X، 20 دقيقة لكل منهما، في RT، مع طيف هزاز (~ 30 دورة في الدقيقة).
- منع الأنسجة لمدة 1 ساعة على RT مع عازلة تمنع (PBS + 1٪ BSA + 0.2٪ الخالي من الدسم الحليب الجاف مسحوق + 0.3٪ تريتون X-100).
- بعد عملية الشراءص عرقلة، ونقل الأنسجة إلى حل الأجسام المضادة الأولية (المخفف في عرقلة العازلة)، واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية مع طيف هزاز (~ 30 دورة في الدقيقة). ووصف التخفيفات من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في جدول المواد.
- في اليوم التالي، وغسل الأنسجة مع PBS-MT (PBS + 2٪ الخالي من الدسم مسحوق الحليب الجاف + 0.5٪ توين-20)، 4X، 30 دقيقة لكل منهما، في RT، مع طيف هزاز (~ 30 دورة في الدقيقة).
- وبعد هذه الخطوة الغسيل، إضافة الأجسام المضادة الثانوية في التخفيف من 1: 250 (هذه الخطوة تحتاج الأمثل لأجسام مضادة الفردية) في المخزن الحجب واحتضان لمدة 1 ساعة على RT، مع هزاز لطيف.
- من الآن فصاعدا حفاظ على الأنسجة مغطاة بورق الألمنيوم لمنع التعرض للضوء كما وصفت الأجسام المضادة الثانوية مع fluorophores الحساسة للضوء.
- غسل الأنسجة 3X مع برنامج تلفزيوني-T (PBS + 0.1٪ توين-20)، 30 دقيقة لكل منهما، مع هزاز لطيف.
- إعداد الشرائح لتركيب الأنسجة الملون.
- لهذا، وقطع زلات غطاء زجاجيإلى شرائح رقيقة باستخدام قلم الماس والعصا قطعتين أحدهما على الآخر على شريحة زجاجية باستخدام المينا الأظافر. جعل اثنين من الحدود والأنسجة مكان ما بين هذه الحدود البلدين.
- إضافة دابي تحتوي المتوسطة المتزايدة وضعت على زلة غطاء. تطبيق المينا الأظافر في زوايا الغطاء زلة لإصلاحه إلى الشريحة.
ملاحظة: الأنسجة هي الآن جاهزة للتصوير. تخزين هذه الشرائح في -20 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خلال التنمية، وWD يخضع لتغيرات كبيرة حيث يتم تحويل أنبوب بسيط ومستقيم إلى قناة معقدة للغاية وملفوف. استخدام الأساليب المذكورة أعلاه، WDS يخضع لعملية تحول مماثل في ظروف الثقافة. هنا نحن أظهرت النتائج من WDS تربيتها لمدة 3 د (الشكل 3). لتشريح الآليات الجزيئية المشاركة في WD التشكل، مستنبت يمكن أن تستكمل مع مثبطات ومنشطات تستهدف مسارات الإشارات المختلفة. ويبين الشكل 3C محلول WD بعد 3 د للثقافة في وجود إشارات Wnt المانع محددة، IWR1 10. السهام نحتفل ملفات (الشكل 3B) ومحلول WDS (أرقام 3A و C) مما يدل على أن قمع النتائج إشارات WNT في تثبيط WD اللف (الشكل 3C). وبالتالي، فإن هذا النظام يمكن استخدام الثقافة لتشريح الآليات الجزيئية المعنية خلال جمعةاإلمنائية من WDS (أو أجهزة أخرى).
لتسمية أنواع مختلفة من الخلايا، أجرينا جبل بأكمله المناعية على WDS (الشكل 4). نحن هنا تقديم بيانات التحقق من صحة استخدام هذا البروتوكول لوضع العلامات هيكل الخلية، حشوية، والبروتينات النووية. يمثل الشكل 4A cytokeratin 8 (CK8، وهو علامة من الخلايا الظهارية) المناعية من WDS (تميزت سهم) مثقف لمدة ثلاثة أيام. لقد طبقنا أيضا نفس البروتوكول لتقييم انتشار الخلايا المناعية التي كتبها لPH3 (الفوسفات-هيستون 3، علامة تكاثر الخلايا). ويبين الشكل 4B صورة ممثل PH3 جبل بأكمله المناعية. النقاط الخضراء تميزت سهم تمثل PH3 إيجابية الخلايا وبالتالي المتكاثرة. الشكل 4C يظهر المناعية لالنشط β-كاتينين على WDS المعزولة حديثا من 18.5 أجنة الفئران شركة ظفار. سيطرة سلبية (مراقبة مفتش) في الشكل 4D تظهر أي تلطيخ. هذه النتائج الضوءمتانة هذا كله بروتوكول جبل المناعية، والتي يمكن أن تستخدم أيضا لكثير من الأجسام المضادة المختلفة.
الشكل 1. رسم توضيحي لموقع شق لعزل الغدد التناسلية الجنينية من 15.5 DPC الجنين. يمثل خط منقط أبيض الموقع لإجراء شق في جنين 15.5 شركة ظفار لعزل التلال البولية التناسلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مخطط تدفق يصف إجراءات التدريجية للثقافة الجهاز. الرجاء النقر هنا لالسادسEW نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. عادي WD التشكل في ظروف الثقافة. (أ) خصية وWD معزولة عن 15.5 DPC الجنين. (ب) ملفوف WD بعد 3 الثقافة د بحضور DMSO (مراقبة). وقد لوحظ (C) لا WD اللف مع العلاج IWR1 (مثبط WNT). يمثل السهم WD. ر، يمثل الخصية. الحانات تساوي 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الجامع جبل immunolabeling من WDS. (A - B) كامل جبل المناعية من WDS ايزولاتيد من 15.5 الأجنة DPC وتربيتها لمدة 3 د لCK8 (A) وPH3 (B). (C) أحدث βcatenin جبل بأكمله المناعي على WD عزل من 18.5 DPC الجنين. (D) السيطرة السلبية (مراقبة مفتش) لβcatenin نشطة على 18.5 DPC WD تظهر أي تلطيخ. السهم علامات ملفوف WD. ر، يمثل الخصية. الحانات تساوي 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظام الثقافة الجهاز لديه العديد من المزايا على خلية نظام الثقافة التقليدية. هذا النظام يحتفظ العلاقات الهيكلية الأصلية والتفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا. أنه يحاكي في أنظمة الجسم الحي ويعطي معلومات أكثر دقة من دراسات ثقافة الخلية حيث العامل المتخصصة غائب. استخدام أنظمة الثقافة الجهاز حتى يكون من المزايا أكثر من استخدام كل الحيوانات. وتشمل هذه التكلفة المرتفعة لاستخدام الحيوان كله، والرعاية سهلة وصيانة نظام الجهاز ثقافة، الخ وعلاوة على ذلك، ومختلف وكلاء الدوائية أو العقاقير يمكن اختبارها على أجهزة معزولة / مثقف واستجابة مباشرة من الجهاز وليس الجسم كله يمكن أن يكون درس.
هناك العديد من الخطوات الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار لثقافة ناجحة من WDS الجنينية. يجب جمع الأنسجة بعناية دون الإضرار سلامتها، والأنسجة التالفة التي لا تنمو بشكل جيد وتصبح الكيسي. تزيد من وسائل الإعلام على قمةيؤدي مرشح أيضا لنمو الكيسي من WDS. أجرينا العزلة الأنسجة والثقافة خارج غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة من دون أي تلوث. وقد أعد ثقافة متوسطة وتضاف إلى 24 لوحات جيدة داخل نسيج الثقافة هود. لذلك، وذلك باستخدام الأسلوب السليم، والعمل بسرعة واتخاذ الاحتياطات اللازمة، WDS جمعها خارج النسيج هود الثقافة يمكن أن يكون مثقف دون أي تلوث. في حين حصد الأنسجة مثقف، ينبغي توخي الحذر لأنها هشة جدا، وينبغي ألا أمسك مباشرة مع ملقط. يجب بدلا من ذلك اختار الأنسجة حتى في طبقة رقيقة من برنامج تلفزيوني التي تشكل بين ذراعي من الملقط.
وصفناها أيضا كامل إجراءات مفصلة المناعي جبل في هذه المخطوطة. Z كومة التصوير من الأنسجة بعد جبل بأكمله تلطيخ باستخدام المجهر متحد البؤر أو الاستريوسكوبية يعطي ميزة للقسم من خلال النسيج كله دون باجتزاء المسلسل وتلطيخ عدة شرائح. وهكذا، فإنه يعطي فكرة أفضل عنموقع التعبير عن البروتينات المستهدفة. اختراق الأجسام المضادة من الصعب في الأنسجة، مع الألياف عالية / محتوى المصفوفة خارج الخلية مما أدى إلى إشارة أقل. قد يكون أطول permeabilization وزيادة مدة الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية تفيد في مثل هذه الحالات. والعيب الآخر من جبل بأكمله تلطيخ هو أن قرار على مستوى خلية واحدة من الصعب تحقيق وقد تحتاج الأهداف الخاصة / المجاهر. أجرينا كلا 1 ساعة و O / N التثبيت في 4٪ PFA وجدت أن هذه الأساليب تعمل بشكل جيد بالنسبة للغالبية من الأجسام المضادة اختباره في المختبر لدينا بما في ذلك CK8، PH3، والأجسام المضادة βcatenin النشطة. ونحن أيضا colocalized بنجاح CK8 مع PH3 أو βcatenin نشطة. لcolocalization، أضيفت الأجسام المضادة الأولية لكلا علامات في وقت واحد. يجب أن تثار هذه الأجسام المضادة في الأنواع المختلفة. أثناء إجراء المناعي جبل كله، ينبغي اتخاذ أقصى درجات الحرص عند إضافة أو إزالة الحلول مثل الأنسجة يمكن أن يكون بسهولة اكبرذ وضعت في ماصة / نقل ماصة وتتعثر في البلاستيك. لتجنب هذا الأمر، تغيير حلول مع 200 ميكرولتر ماصة تحت المجسام أو تشريح المجهر وتترك قليلا من الحل في الجزء السفلي من الأنابيب. ونحن نوصي جمع الحلول النفايات في دورق زجاجي شفاف نظيف. بعد كل تغيير الحل، والاعتماد على عدد من الأنسجة في أنابيب تحت المجسام. في حالة فقدانها من الأنسجة، ويمكن استردادها من كوب زجاجي. نصائح ماصة تستخدم لنقل الحلول ينبغي أن لا تلمس الأنسجة حيث سيؤدي ذلك إلى تلف الأنسجة وترك يجعلها غير صالحة للتصوير.
لتركيب WDS الملون، كنا الشرائح تجويف كما وضع coverslips مباشرة على الجزء العلوي من WDS يمكن ضغط عليها وتشويه التشكل. وهذا يتوقف على سمك الأنسجة، وعمق تجويف يمكن التلاعب بها بسهولة من خلال تغيير عدد من شرائط ساترة المستخدمة. هذا الأسلوب من محضرات الشرائحن من الناحية الاقتصادية لأنه يتطلب زلات غطاء الوحيدة وقلم الماس. ويمكن أيضا أن يتم التصوير قبل coverslipping لأنه من السهل لتوجيه وتحريك WDS الملون قبل أن يتم إصلاحها تحت coverslips. مع جبل المناعية كله، والتصوير Z كومة يعطي صورة أفضل وتوفر المزيد من المعلومات. لأخذ الصور من مجموعات العلاج المختلفة، يجب أن تبقى التعرض نفسه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ونود أن نشكر أعضاء المجموعة الأورام أمراض النساء لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وهذا العمل في جزء يدعمها تمويل من الصحة الوطنية ومجلس البحوث الطبية، والمجلس الأسترالي للأبحاث، ومعهد السرطان في نيو ساوث ويلز (PST). عضو الكنيست هي المستفيدة من جامعة نيوكاسل الدراسات العليا زمالة أبحاث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 µm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| phospho-Histone 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | - |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
References
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice. Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).
- Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 9, 283-292 (2005).
- Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling. Dev Biol. 412, 234-249 (2016).
- Murashima, A., et al. Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation. Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development? Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).
- Hirashima, T., Adachi, T. Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development. PLoS One. 10, 0135343 (2015).
- Chan, W. Y., Blomberg, L. A. Germline Development: Methods and Protocols. Methods Mol Biol. 825, (2012).
- Karner, C. M., et al. Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development. Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).
- Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nat Med. 14, 979-984 (2008).
