Summary
우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.
Introduction
결핵균, 결핵 (TB)의 원인이되는 에이전트는 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인이다. 약물에 민감한 TB 6 개월의 기간 동안 여러 항생제를 필요로하는 치료가 가능한 질환입니다. 치료 가능한 질병 임에도 불구하고, 결핵 사망률은 2015 일에서 150 만 것으로 추정되었다. 지난 10 년 동안, 약제 내성 결핵균의 유병률에 대한 우려가 증가하고있다. 다제 내성 결핵 (MDR-TB)가 적어도 이소니아지드 (INH) 리팜피신 (RMP), 가장 MDR-TB 균주 따라서 치료 옵션을 제한 두번째 선 TB 약물을 선택하는 것이 내성에 강한 TB로 정의된다 . 약제 내성의 효과는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 감염된 환자의 공동 치료를위한 큰 도전을 생성; 40 환자는 전 세계적으로 2,015 1 HIV 관련 결핵으로 사망. 실망, 미국 식품의 약국 Administ배급은 지난 40 년 2, MDR-TB, bedaquiline에 대한 하나의 새로운 결핵 약을 승인했다. 더 짧은 TB 치료를 찾는의 발전이 시급히 TB와 MDR-TB의 싸움에 앞서 유지하기 위해 필요하다.
전통적으로, TB 약물 스크린 화합물은 성장 배양에 첨가하여 미생물의 박멸에 그 효과는 고체 배지에서 집락 형성 단위 (CFU)을 계산하여 결정함으로써 성장 배지에서 체외 성장 조건 하에서 수행된다. CFU 카운트는 노동 집약적, 시간 소모, 비용이 많이 드는만큼, 다양한 간접 방법이 문제를 완화하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방법들은하는, Alamar 블루 생존 분석 3, 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 루시퍼 라제를 발현하는 박테리아에서 형광 발광 5 (4)의 결정 및 총 아데노신 삼인산의 추정 (A 포함TP) 6,7.
전형적인 TB는 박테리아 상주 폐포 대 식세포 (8)의 내부 phagosomes 복제 폐,의 결핵균 감염에 의해 특징된다. 간단한에서 국물 표현형 화면이 세포 외 병원균에 맞게 할 수있다; 그러나, 역사적 관점에서이 방법을 사용하여 식별 결핵균에 대한 화합물은 종종 감염 모델에서 다운 스트림 검증 단계에서 기대에 부응하는 데 실패했다. 우리는 결핵 약물이 가장 세포 내 숙주 세포 감염 모델에서 수행되는 것을 제안한다. 그럼에도 불구하고, 세포 내 모델은 높은 처리량 스크리닝 (HTS) 개발에 많은 기술적, 생물학적 장벽을 가지고있다. 큰 장애물은 여러 단계와 세정 사이에 의하여 세포 외 박테리아의 정교한 제거 예로, 악성 프로세스의 복잡성이다. 두 번째 주요 장애물은 긴 시간 재quirements는 일반적으로 CFU 문화 판에 계산에 의해 수행 성장 탐지으로 완료하는 데 3 주 이상 걸리는 과정이다. CFU 카운트를 대체하는 하나 개의 솔루션은 형광 박테리아와 함께 자동 형광 현미경으로 제공되었습니다. 그러나,이 솔루션은 많은 연구 실험실의 손이 닿지이다 초기 설비 투자를 필요로한다. 간단하고 저렴한 비용, 질병 관련 HTS 방법은 크게 신약 개발 프로세스를 향상시킬 것입니다.
본 연구에서는 세포 내 결핵균에 대한 화합물의 활성을 결정하기에 적합한 빠른, 높은 확장 성이면서 경제적 인 분석을 제공하는 것을 목적으로, 새로운 모듈 형 HTS 시스템에보고한다. (나) 세포, (ⅱ) 세포 독성, 및 (iii)의 국물 분석법 :이 시스템은 세 개의 모듈로 구성된다. 합한 최종 결과는 액션의 전위 모드와 같은 추가 정보, 화합물 성질의 포괄적 인 설명을 제공한다. 이 SC시스템 reening하는 것은 약물 시너지 (9)의 분석을 포함한 행동 모드를 대상으로 다양한 화합물 라이브러리, 여러 프로젝트에서 사용되고, 자식 작용 (10)의 자극, 및 결핵균의 억제 독성 인자 (미공개) -secreted. 행동의 알 수없는 모드의 화합물은 또한 11 연구되고있다. 이 방법의 수정 된 버전은 또한 세포 내 결핵균 (11)에 대해 새로운 화합물을 식별 차 스크리닝 방법으로서의 산업 파트너가 채택되었다.
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Protocol
1. 균주 및 성장 매체
- 소 혈청 알부민 25 g, 덱 스트로스 10.0 g, 및 탈 이온수 460 ㎖의 염화나트륨 4.05 g을 가용화하여 알부민 스트로스 염화칼슘 원액 (ADS)을 만든다. 4 ° C에서 ADS 및 저장을 필터 소독.
- 7H9 분말 4.7 g 및 정제수 900 mL의 글리세롤 2 mL를 첨가하여 7H9 국물을 만들기. 10 분 동안 121 ° C에서 7H9 액체 배지를 오토 클레이브가 진행하기 전에 실온으로 냉각시킨다. ADS 100㎖로 7H9 액체 배지 900 ㎖의 트윈 80을 0.5 mL를 첨가하여 7H9ADST합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
- 카나마이신 설페이트 50 mg의 무게를 측정하고 1 ㎖ 탈 이온수에 녹여; 최종 농도 50 ㎎ / ㎖이다. 필터 소독 및 -20 ° C에서 보관. 7H9ADST의 1 L 당 원액을 카나마이신 0.5 ML을 추가합니다.
이 매체는 신선한해야한다, 그래서 문화의 크기에 따라 적절하게 볼륨을 확장 : 참고. - 7H에서 결핵균 성장9ADST 문화 서에서 카나마이신으로 보충. 매일 문화를 흔들어하고 OD600이 응집을 방지하기 위해 1.0에 도달하기 전에 희석.
주 :이 방법의 개발에 사용되는 결핵균 H37Rv 균주 pJAK2.A 12 플라스미드로 형질 전환 하였다. pJAK2.A은 Hsp60에 프로모터 반딧불이 루시퍼 라제 유전자의 높은 수준의 발현을 허용하고 카나마이신을 사용하여 선택 될 수 pMV361 벡터에 기초하여 통합 플라스미드이다.
2. THP-1 중간 및 유지 보수
- RPMI를 완전 배지 (대략 10 % FBS와 2 mM의 글루타민)을 만들기 위해 열 활성화 된 우 태아 혈청 (FBS) 및 RPMI 1640 500 ㎖ 내지 200 mM의 L- 글루타민 5 ㎖ 50 ㎖의 추가.
- 표준 프로토콜에 따라 13 THP-1 세포 배양 물을 유지한다. PAS 사이 배지 1 ㎖ 당 0.2 내지 1 백만의 셀 밀도를 유지하면서 간단하게, 완전 RPMI 배지에서 THP-1 세포를 성장현인.
3. 높은 처리량 세포 내 검사 루시 페라 제 발현 M. 결핵 H37Rv 사용
- 600 nm의 파장에서 분광 광도계에서 활발히 성장 세균 현탁액의 광학 밀도를 측정한다. mL를 0.1 OD 600 = 3 × 107 세균의 변환 계수를 이용하여 박테리아의 밀도를 계산한다.
- 새로운 원심 분리 튜브로 1 : 10의 감염 (MOI)의 다수 충분한 박테리아를 피펫. 10 분 동안 3,000 XG에서 펠릿 액체를 흡인. RPMI1640의 450 μL에 인간 혈청 50 μL를 추가합니다. 실험에 대한 값을 적절한하기 위해 볼륨을 확장 할 수 있습니다.
- 박테리아 opsonize 위해 10 % 인간 혈청을 함유하는 RPMI1640 500 μL 당 1 × 108 세균의 농도로 펠렛을 재현 탁. 혼합물을 30 분 동안 37 ℃에서 배양 할 수있다. 혈구와 반전 microsco 카운팅하여 THP-1 세포 배양 물 농도를 결정체육.
- 100 XG에서 멸균 원심 분리 튜브에 세포 펠렛을 10 분간 37 ° C. 상등액을 흡인하고 불완전 mL의 1 개 백만 세포의 밀도로 RPMI에서 세포를 재현 탁. 40 NG / ㎖ 최종 농도 포볼 -12- 미리 스테이트 -13- 아세테이트 (PMA)를 추가한다.
참고 :이이 분화 믹스라고한다. - 10의 MOI에서 THP-1 분화 믹스 옵 소닌 결핵균 결합 : 1, 96- 웰 평면 바닥 플레이트에서 흰색 웰 당 100 μL의 최종 믹싱 나누어지는. 정기적 균일 성을 보장하기 위해, 혼합물을 교반한다. 분화 및 감염 5 % CO2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 진행하도록 허용.
- RPMI 각 100 μL로 두 번 우물을 씻으십시오. 완전 RPMI에서 원하는 농도로 희석 된 화합물을 첨가하고 3 일 동안 배양한다.
- 웰로부터의 배지를 흡인. 각 웰 루시퍼 라제 분석 시약 50 μL를 추가한다. t와 플레이트를 밀봉ransparent 접착제 플레이트 씰러. 22 ° C에서 배양 5 분을 허용 한 후 1 초에 루미의 판독을 얻기 웰당.
4. 세포 독성 분석 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 사용하여 검정 (14)
- RPMI에서 THP-1 세포 분화 불완전 맑은 96 웰 플레이트에서 40 NG PMA / ㎖로 보충. 셀 mL의 1 백만의 밀도와 나누어지는 잘 당 100 μL를 유지한다. 분화가 5 % CO2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 진행하도록 허용.
- 웰에 완전 RPMI에 희석 된 화합물을 추가 웰로부터 배지를 흡인하고 RPMI 1640 회 씻는다. 3 일 품어.
- 5 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을하기 위해 인산 완충 용액 (PBS)을 100 mL의 MTT 0.5 g을 녹이고. 광 거리에서 -20 ° C에서 살균 필터 및 저장; 그것은이 솔루션 신선하게하는 것이 가장 좋습니다.
- 2.5 시간을 befor전자 3 일간의 잠복기의 끝, 각 웰에 MTT 용액 25 μL를 추가하고 잠복기를 완료합니다.
- 50 % N을 준비 N의 디메틸 포름 아미드 (DMF), 탈 이온수 250ml를 DMF 250ml의 혼합함으로써.
- 다음 MTT 추출 버퍼 준비 : 500 ㎖의 병 SDS 100g의 무게를 재고 50 % DMF 300 mL를 첨가. SDS 용해 할 수 있도록 낮은 열을 적용합니다. 순수한 아세트산 10 mL의 1 M 염산 12.5 mL를 넣고. 50 % DMF와 500mL의 마크까지 채우고; 추출 완충액의 최종 조성물은 50 %의 DMF, 20 % SDS, 2.5 % 아세트산, 2.5 %, 1 개 M 염산이다.
- 처리 기간의 마지막에, 각 웰에 (모든 결정을 용해 45 ℃로 가온) 추출 완충액 100 μL를 추가한다. 혼합물을 37 ℃에서 밤새 배양 허용 5 % CO2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 C를 °. 570 nm에서 흡광도를 읽어보십시오.
주 : 세포 독성 분석을 가장 잘 인트라 셀에 병렬로 수행THP-1 세포의 동일 배치 나이를 사용하여 울라 화면.
5.에서-국물 활동 분석은 레사 주린 분석 (3)를 사용하여
- 미드 로그 상 (- OD 600 0.8 ~ 0.5)로 7H9ADST에서 결핵균 성장. 0.01 OD 600에 7H9ADST로 배양을 희석. 각 웰에 희석 된 화합물을 각각의 시험 농도 및 100 μL 분취를 2 배 7H9ADST의 화합물을 희석한다.
- 각 웰에 희석 된 세균 현탁액 100 ㎕를 옮긴다. 플레이트를 5 일 동안 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양 할 수있다. 탈 이온수 및 살균 필터 100 mL에 레사 주린 10 ㎎을 용해.
- 30 μL 레사 주린 용액에 추가하고 48 시간 후 색상 변화를 모니터링; 세균의 성장은 분홍색 파란색에서 색 변환으로 표시됩니다.
주 : 정량 분석도 530에서 여기와 590 nm에서의 형광 중 하나를 측정함으로써 수행 될 수있다 - 560나노 미터 또는 570 nm에서의 흡광도와 600 nm의 15.
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Representative Results
루시퍼 라제 유전자를 발현 결핵균을 이용하여 높은 처리량 스크리닝 세포
도 2a 및 표 1은 루미 의해 수집 된 원시 데이터, THP-1 세포 안에 결핵균의 TB 약물 리팜피신의 농도 증가의 효과를 나타내는, 상대적 형광 단위 (RLU)에서 발현 함유한다. 도 2a는 리팜피신의 다양한 농도에 대한 측정 RLU 원시 발광의 산포도이다. 오류 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 도 2b는 비 처리 웰에 비해 처리 된 웰의 발광의 % 감소를 나타낸다. 데이터 리팜피신은 0.1 ㎍ / ml의 농도에서 세포 내 결핵균으로부터의 RLU> 99.9 %로 감소시킬 수 있음을 보여준다. 이것은 previousl에 따른다Y는 0.1 내지 0.4 ㎍ / ㎖의 MIC (16) 사이를 출판. 각 웰에서 생성 된 발광은 결핵균 표현 전체 루시 페라 제의 지표이며, 따라서 잘 내부 결핵균의 대사 상태의 지표이다. 원시 발광 레벨 실험 사이에서 변화하는 것이 보통이다. 따라서, 원시 데이터의 비교는 신뢰할 수없는 결론을 생성합니다. 따라서, 데이터는 DMSO로 처리 한 시료 것이다 정의 음성 대조군에 대해 표준화되어야한다. M.의 감소 백분율은 웰 (도 2B)에 결핵과 같은 결과 값을 나타낼 수있다.
MTT 분석을 이용하여 세포 독성 분석
MTTassay의 진핵 세포 독성 잘 확립 된 분석이다. 이 비색 분석은 MTT (노란색)의 전환을 통해 생균을 나타낸다자주색 포르 마잔. 박테리아가 관찰 된 화합물의 독성을 감소 MTT를 대사 할 수 있기 때문에이 분석은 결핵균 감염없이 수행된다. MTT 분석을위한 일반적인 제안 570 내지 17에 의한 흡수하여 pH 지시자 페놀 레드없이 매체를 사용하는 것이다. 그러나, 이러한 방법에서 설명한 산성화 추출 완충액 (17) 페놀 레드로 인한 간섭을 최소화 할 수있다.
도 3은 시험 화합물 부호화 G1-1H의 농도 증가에 의해 야기되는 세포 독성을 나타낸다. 일반적으로, 50 % 억제 농도 (IC 50) 독성의 정도를 나타 내기 위해 사용된다. G1-1H의 경우, 10 μM 3 μM 농도의 IC 50 농도보다 명확하게된다.
인 - 국물 활동 분석 우리를레사 주린 분석을 보내고
레사 주린 분석은 일반적으로 진핵 세포에서의 세포 독성 분석을 위해 사용되지만,도 3에 국물 생균을 모니터링하는데 사용될 수있다. 레사 주린 분석은 MTT 분석과 같은 산화 환원 계 분석이다. 이는 레조 루핀 (resorufin), 적색 형광체로 레사 주린의 변환을 통해 NADPH 수준 및 NADPH 탈수소 효소 활성을 측정한다. 약물의 효능을 결정하는 가장 쉽고 빠른 방법은 우물 컬러로 블루 남아있는 가장 낮은 치료 농도을 찾는 것입니다. 도 4는 결핵균으로 변환 레사 주린의 아 프라 마이신 항생제를 다양한 농도가 가진 효과를 나타내는 96- 웰 플레이트의 일부를 도시한다. 인 - 국물 MIC 2.5 및 5 ㎍ / ㎖의 사이 인 것으로 결정되었다. 이 / mL의 18 1.5 μg의의 이전에 발행 된 값보다 약간 높은이지만, acceptab 내에도 여전히제작 범위. 대부분의 경우, 색의 변화는 오히려 점진적, 그래서 자신감 결정을하기가 어렵습니다. 이러한 조건 하에서, 흡광도 또는 형광을 사용하여 변환 레사 주린의 실제 양을 정량화하는 것이 좋다. 인해 레사 주린과 레조 루핀 (resorufin), MIC 결정 흡광도를 사용하는 유사 흡광도 특성을 두 개의 서로 다른 파장 및 복잡한 계산 (15)을 사용한 측정이 필요하다. 따라서, 최적의 방법은 제조자의 문헌 15에 기재된 바와 같이, 530 - 560 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장을 이용하여 형광을 측정하는 방법이다.
도 4는 대폭 스크리닝 결과를 변경할 수 며칠에 걸친 배양와 관련된 불일치의 전위 소스를 나타낸다. 때문에 본 실험에 사용 된 37 ° C의 배양기 부적절하게 가습하기 위해, (P)의 가장자리에 우물 lates을 훨씬 더 증발을 겪었다. 모든 15 DMSO 처리 된 웰을 동일한 것으로 가정되지만, 좌측 및 상단 가장자리를 따라 웰 볼륨 감소했다. 이 웰은 상기 플레이트의 중간에 다른 DMSO 처리 된 웰과 다른 색상을 가질 것으로 보인다. 동일한 불일치는 2.5 ㎍ / mL의 아 프라 마이신을 처리 한 웰에서 관찰 될 수있다. 이 경우, 감소 된 볼륨은 분광 광도계와 형광에 의한 정량적 독서로 이어질 것입니다. 관리가 불일치의 원인을 피하기 위해 잘 가습 인큐베이터을 유지하기 위해주의해야하므로 증발, 장기간 배양 시간에 모든 실험에 대한 의미가된다.
그림 1 : 방법 회로도. 고 처리량 스크리닝 시스템 (3 개) 별도의 모듈에 대한 분석 회로도를 나타내는 도면. _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 : 세포 내에서 대표 데이터는 THP-1 세포 안에 결핵균을 제거하는 리팜피신의 유효성을 검사한다. 각 처리 (리팜피신) 농도 (상대 발광 단위) 판독 평균 발광의 (A) 그래프. 오류 바는 각 세중의 평균의 표준 오차를 나타낸다. 값이 높을수록 더 큰 효과를 나타내 리팜피신의 처리에 의한 발광의 계산 % 감소의 (B) 그래프. 이 경우의 90 % 억제 농도 (IC 90)는 대체로 0.01 및 0.1 ㎍ / ㎖의 사이이다."NK>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : 독성 (MTT) 검정에서 대표 데이터 차별화 된 THP-1 세포에 대한 화합물의 G1-1H 독성을 조사. 높은 값이 건강한 THP-1 세포를 나타내는 처리 화합물 G1-1H, 각각의 농도 값을 계산 "제어 퍼센트"그래프. 이 경우의 IC (50)는 대체로 10 내지 30 μM이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 레사 주린 분석에서 대표 데이터는 E를 검사합니다인스 국물 결핵균 억제에서의 아 프라 마이신 ffectiveness. 질적 데이터 인해 바이오 레벨 3 (BSL3) 실험실 장비 제한이 경우에 수집된다. 사진은 DMSO 또는 아 프라 마이신 다양한 양의 어느 처리 결핵균을 함유하는 96- 웰 플레이트의 일부를 도시한다. DMSO를 처리 한 웰 핑크 청색으로부터 색 변환에 의해 나타낸 바와 같이, 레조 루핀 (resorufin) 레사 주린하기의 전환을 나타냈다. 아 프라 마이신 처리 된 샘플은 분명히 5 ㎍ / mL를 아래의 색 변환을 시행 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| [리팜피신] | Rep1 | Rep2 | Rep3 | % 감소 | |
| 4 ㎍ / ㎖의 | (184) | (190) | (210) | 195 | (100) |
| 1 ㎍ / ㎖의 | (244) | (215) | (159) | (206) | (100) |
| 0.1 ㎍ / mL의 | 1,037 | 731 | 976 | (915) | 98 |
| 0.01 ㎍ / ㎖의 | 19200 | 24400 | 23919 | 22506 | (54) |
| 0 ㎍ / ㎖의 | 39877 | 49655 | 57728 | 49087 | 0 |
표 1 : 리팜피신의 세포 IC (90)의 판정에 대한 루시페라아제 분석 원시 데이터.
| [G1-1H] | 담당자 1 개 A570 | 담당자 2 A570 | 의원 3 A570 | 평균 A570 | 치료의 % |
| 30 μM | 0.056 | 0.056 | 0.055 | 0.056 | (7) |
| 10 μM | 0.518 | 0.488 | 0.492 | 0.499 | (62) |
| 3 μM | 0.652 | 0.638 | 0.656 | 0.649 | (80) |
| 0 μM | 0.822 | 0.782 | 0.815 | 0.806 | (100) |
표 2 : Differe에서 세포 독성 시험 화합물 G1-1H의 결정을위한 MTT 분석법에서 원시 데이터NT 농도.
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Discussion
이 연구의 목적은 결핵균에 대한 인간의 세포 내 감염 모델을 사용하여 간단하고 비용 효율적인 HTS 방법을 만드는 것이 었습니다. 결핵은 M. 결핵하여 폐포 대 식세포의 감염에 의해 특징 인간의 질병이다. 때문에 바이오 안전성 문제, 박테리아 및 숙주 세포 모두의 생물학적 모델을 포함하는 연구는 과거에 사용되어왔다. 그러나,이 대리 박테리아와 인간이 아닌 모델의 사용은 약물 검사가 가장 결핵균 19, 20에 감염된 인간 세포로 이루어집니다 나타내는 약물 개발의 히트를 리드 성공의 가난한 예측 것으로 나타났다, (21, 22).
이 방법에서는, 고급 인간 대 식세포 등 THP-1 세포주에 대한 현재의 최첨단 선별 프로토콜을 채택했다. 높은 달성하기 위해서처리량, 우리는 감염 프로토콜에 대한 몇 가지 기술적 인 개선 사항을 소개했다. 무엇보다도, 우리는 CFU 결정에 관련된 모든 단계를 대체 루시 페라 제 기반 리포터 시스템을 대체. 반딧불 루시퍼 인해 간단한 종점 분석법, 숙주 세포의 리소좀 효소에 의한 분해성 및 최소 장비 요구에 선택되었다. 이 교체 효과적으로 30 일의 잠복기뿐만 아니라 도금 및 콜로니 계수 단계와 연관된 노동 및 소모품 비용을 제거.
우리가 도입 된 두 번째 주요 개선은 더 단순 감염 프로토콜에 웰 사이의 처리량과 일관성을 향상 배치 프로세싱 감염이었다. 단일 단계로 분화 감염 단계를 결합함으로써, 우리는 일일하여 프로토콜을 단축 할 수 있었다. 동시에, 우리는 일반적으로 분화와 infectio 사이에 발생할 수있는 세척의 3 라운드를 줄일 수 있었다인하여 분리 가능한 THP-1 세포의 손실의 원인 인 N.
이 프로토콜은 여러 가지 이점을 수여 THP-1 세포주의 내측 선별을 위해 개발되었다. THP-1, 불멸화 세포주로서, 20 개 이상의 통로 (23)에 대한 시험 관내 배양 확실하게 할 수있다. 높은 처리량 설정을 공급하기에 충분한 세포를 유지하기 어려울 수 있습니다 대형 검진 캠페인, 특히 중요합니다. 또한, THP-1에서의 테스트 결과에 변동을 최소화하는 균질 유전 적 배경을 제공합니다. 이것은 숙주 세포 반응 (10)에 영향을 시험 화합물에 매우 유익하다. 추가 보너스로서, THP-1 세포주에서 유전자 발현 작은 방해 RNA들 (siRNA가) (24)에 의해 하향 조절 될 수있다. 이 히트 화합물의 작용 모드로 다운 스트림 조사를위한 유용한 도구를 제공합니다. 이 방법은 THP-1 세포주를 사용하여 설계되었지만, 그것을이전 10 쉽게 도시 된 바와 같이, 말초 혈 단핵 세포 (PBMC) 일차 인간 세포에 대해 적응 될 수있다.
가장 폐포 대 식세포 및 결핵균의 실제 상호 작용을 모방하기 위해, 세포 분석 프로토콜은 박테리아 opsonize하는 단계를 포함한다. 인간 혈청 코트 결핵균과 옵 소닌 및 보완 수용체 3 (CR3) (25)를 통해 셀 입력을 용이하게합니다. 벌거 벗은 박테리아는 렉틴 수용체 (8)를 통해 대 식세포를 입력 할 가능성이 더 높습니다. 기관지 유체가 인간 혈청 (25), 옵 소닌, 또는 그 부족의 구성 요소를 포함하는 것으로 알려져 있음을 감안할 때, 심사 결과에 근본적인 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 일부는, 상기 감염 과정 (16)을 단순화하기 위해이 단계를 건너 뛸 수도 있고, 그 때문에 리튬의 크기만큼 인간 혈청을 입수 가능하지 않을brary 11 상영된다.
세포 내 분석 전에 루시퍼 라제 시약을 첨가하여 웰에서 부착 물질을 포함하는 모든 액체를 제거하는 단계를 포함한다. 이 단계는 웰 당 사용량 시약을 감소시키면서, 신호 대 잡음비를 증가시키기 위해 설계된다. 분리 및 THP-1 및 부동성 결핵균이 제거 될 용해하기 때문에,이 단계의 포함은 위양성 THP-1을 죽이는 화합물에 대한 데이터는 아니지만 M. 결핵을 생성 할 수있다. 따라서, 각 웰 루시퍼 라제 시약 (100 μL)의 동일한 양을 첨가하는 제조자의 권장 프로토콜은 세포 독성 화합물을 함유하는 웰에서 결핵균 생존 분석하기 위해 따라야한다.
개똥 벌레 루시퍼 라제 시스템에 대조적으로, 세균 LUX 시스템은 신호 발생 (26) 외부의 시약을 필요로하지 않는다. 하나,반딧불 시스템은 다음과 같은 이유로 룩스 시스템을 선호한다 : 첫째, 박테리아 시스템은 마이코 박테리아 (26)에 독성이있을 수 있습니다. 둘째, 더 복잡한 리포터 시스템 (반딧불 1 개 유전자 대 LUX 5 개 유전자) 시험 화합물에 의한 억제 신호에 더 민감하다. 마지막으로, 개똥 벌레 루시페라아제 분석법 시판 시약은 최적의 신호 생성을 위해 필요한 조건을 제공한다. 한편, 박테리아 루시퍼 라제 시스템 ATP 생산 및 신호 생성 박테리아의 내부에 존재하는 공동 인자에 의존한다. 이들은 다른 치료 사이에서 변화하고 제어하기가 쉽지 않아요 수 있습니다. 따라서, 시스템 반딧불 루시퍼 라제 시약의 첨가 반응 조건을 표준화하고 모든 처리 전체 루시페라아제 활성의보다 신뢰할 수있는 측정을 제공한다.
CFU 판정 긴 박테리아 농도를 정량화 금 표준 수있다. 계약에서, bioluminescence, 대부분의 기자들처럼, 박테리아의 직접 측정하지 않습니다. 대신, RLU는 CFU와 세균의 대사 상태의 함수이다. 기타 특정 조건 5에서 발광 생물 마이코 박테리아에 대한 RLU와 CFU의 대부분 선형 관계를 증명하고있다. 어떤 경우에, 루시 페라 제 분석 신호의 상당한 감소, 숙주 세포 안에 결핵균 적합성 루시퍼 라제의 효소 활성을 나타내는 것이 감소의 실제 억제보다 근본적인 원인 다른없이. 따라서 이러한 화합물은 약물 검사의 관점에서 관심이 될 것입니다 및 방법 개발에서 제외되어서는 안된다.
루시퍼 라제 세포 기반 스크리닝 프로토콜에 대한 대안은 자동 형광 현미경 기반 접근법 11, 27, 28, 29. 루시퍼 라제분석 출력은 조도계로 측정 한 형광 현미경 질적 된 이미지를 생성하는 반면 얻어진 데이터는 정량적이다. 그러나, 영리 컴퓨터 프로그래밍을 통해, 화상은 정량 데이터를 생성하기 위해 분석 될 수있다. 또한, 형광 현미경은 세포 생존, 세포 수 및 감염의 실제 속도와 같은 중요한 파라미터 수집 매우 유용하다 여러 형광체가 동시에 사용되는 것을 허용한다. 하나는 예측할 수 있듯이, 이러한 혜택은 일부 차질이 제공됩니다. 자동화 된 형광 현미경 장비의 초기 투자는 루미 또는 형광의 비용보다 몇 배 이상 많은 연구 실험실의 손이 닿지 않는, 따라서이다. 장비에 액세스 할 수있는 사용자의 경우, 시료 처리는 이미지 수집 및 데이터 분석을하기 전에 고려되어야한다. 이 두 단계는 라이브러리의 크기 증가와 전반적인 시간 투자에 영향을 미친다. 숙주 세포의 requir에게 추가적인 형광 라벨의 포함따라서, 추가 사용자 개입 및 시간 투자를 필요로 ES 고정, 염색 및 세척 단계. 또한, 형광 현미경으로 데이터 수집 및 분석, 자동화되지만, 여전히 간단한 루시페라아제 분석 판독보다 훨씬 더 많은 시간과 자원을 필요로한다. 따라서 루시퍼 라제 리포터 세포 기반 스크리닝 방법은 간단하고 더 높은 스루풋이 가능하다.
루시퍼 라제 세포 기반 스크리닝 방법은 형광 현미경 기반 스크리닝 방법에 비해 하나의 중요한 한계가있다. 이 루시퍼 라제 분석이 호스트 식세포의 건강 상태에 관한 데이터를 제공하지 않는다는 점 때문이다. 세포 독성 화합물은 대 식세포의 사멸을 야기하고, 따라서 생균은 배지로 방출 될 수 있고, 더 이상 최종 루시페라아제 분석 신호에 기여하지 않을 것이다. 따라서, 세포 독성 화합물, 따라서 세포 내 결핵균 및 generat라는의 죽음을 유발 나타나는오 탐지 개 큰 숫자. 이 문제를 해결하기 위해 호스트 식세포에서 화합물의 세포 독성을 평가하기 위해 MTT 분석 우리의 방법을 갖추고있다. 스크리닝 방법의이 모듈은 우리에게 관심의 화합물의 drugability에 대한 추가 정보를 제공하고보다 적게보다는 이상적인 약물 후보의 조기 제거 할 수 있습니다.
대안 적으로, 하나는 종래 자동 형광 현미경을 수행하기 루시페라아제 기반 세포 분석을 사용할 수있다. 큰 화합물 라이브러리 화면에서이 대 식세포 감염 모델의 복합 효과의 신속하고 효율적인 평가를 할 수 있습니다. 이전에 출판 연구 (11)에 의해 예시 된 바와 같이 그 결과, 자동화 된 형광 현미경, 더 나은 후보에 대한 자세한 연구를 위해 예약 할 수 있습니다.
루시 페라 제 기반의 세포 내 분석의 저렴한 비용과 간단한 성격도 크게 작은 테스트하고자하는 연구자 혜택화학 라이브러리 어. 전반적으로, 루시퍼 기반 세포 분석은 모든 탄환의 연구소 및 다양한 크기의 프로젝트를 스크리닝하는 매우 유연한 도구로 입증되었다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
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