세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em> 결핵균</em
Summary
우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.
Introduction
결핵균, 결핵 (TB)의 원인이되는 에이전트는 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인이다. 약물에 민감한 TB 6 개월의 기간 동안 여러 항생제를 필요로하는 치료가 가능한 질환입니다. 치료 가능한 질병 임에도 불구하고, 결핵 사망률은 2015 일에서 150 만 것으로 추정되었다. 지난 10 년 동안, 약제 내성 결핵균의 유병률에 대한 우려가 증가하고있다. 다제 내성 결핵 (MDR-TB)가 적어도 이소니아지드 (INH) 리팜피신 (RMP), 가장 MDR-TB 균주 따라서 치료 옵션을 제한 두번째 선 TB 약물을 선택하는 것이 내성에 강한 TB로 정의된다 . 약제 내성의 효과는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 감염된 환자의 공동 치료를위한 큰 도전을 생성; 40 환자는 전 세계적으로 2,015 1 HIV 관련 결핵으로 사망. 실망, 미국 식품의 약국 Administ배급은 지난 40 년 2, MDR-TB, bedaquiline에 대한 하나의 새로운 결핵 약을 승인했다. 더 짧은 TB 치료를 찾는의 발전이 시급히 TB와 MDR-TB의 싸움에 앞서 유지하기 위해 필요하다.
전통적으로, TB 약물 스크린 화합물은 성장 배양에 첨가하여 미생물의 박멸에 그 효과는 고체 배지에서 집락 형성 단위 (CFU)을 계산하여 결정함으로써 성장 배지에서 체외 성장 조건 하에서 수행된다. CFU 카운트는 노동 집약적, 시간 소모, 비용이 많이 드는만큼, 다양한 간접 방법이 문제를 완화하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방법들은하는, Alamar 블루 생존 분석 3, 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 루시퍼 라제를 발현하는 박테리아에서 형광 발광 5 (4)의 결정 및 총 아데노신 삼인산의 추정 (A 포함TP) 6,7.
전형적인 TB는 박테리아 상주 폐포 대 식세포 (8)의 내부 phagosomes 복제 폐,의 결핵균 감염에 의해 특징된다. 간단한에서 국물 표현형 화면이 세포 외 병원균에 맞게 할 수있다; 그러나, 역사적 관점에서이 방법을 사용하여 식별 결핵균에 대한 화합물은 종종 감염 모델에서 다운 스트림 검증 단계에서 기대에 부응하는 데 실패했다. 우리는 결핵 약물이 가장 세포 내 숙주 세포 감염 모델에서 수행되는 것을 제안한다. 그럼에도 불구하고, 세포 내 모델은 높은 처리량 스크리닝 (HTS) 개발에 많은 기술적, 생물학적 장벽을 가지고있다. 큰 장애물은 여러 단계와 세정 사이에 의하여 세포 외 박테리아의 정교한 제거 예로, 악성 프로세스의 복잡성이다. 두 번째 주요 장애물은 긴 시간 재quirements는 일반적으로 CFU 문화 판에 계산에 의해 수행 성장 탐지으로 완료하는 데 3 주 이상 걸리는 과정이다. CFU 카운트를 대체하는 하나 개의 솔루션은 형광 박테리아와 함께 자동 형광 현미경으로 제공되었습니다. 그러나,이 솔루션은 많은 연구 실험실의 손이 닿지이다 초기 설비 투자를 필요로한다. 간단하고 저렴한 비용, 질병 관련 HTS 방법은 크게 신약 개발 프로세스를 향상시킬 것입니다.
본 연구에서는 세포 내 결핵균에 대한 화합물의 활성을 결정하기에 적합한 빠른, 높은 확장 성이면서 경제적 인 분석을 제공하는 것을 목적으로, 새로운 모듈 형 HTS 시스템에보고한다. (나) 세포, (ⅱ) 세포 독성, 및 (iii)의 국물 분석법 :이 시스템은 세 개의 모듈로 구성된다. 합한 최종 결과는 액션의 전위 모드와 같은 추가 정보, 화합물 성질의 포괄적 인 설명을 제공한다. 이 SC시스템 reening하는 것은 약물 시너지 (9)의 분석을 포함한 행동 모드를 대상으로 다양한 화합물 라이브러리, 여러 프로젝트에서 사용되고, 자식 작용 (10)의 자극, 및 결핵균의 억제 독성 인자 (미공개) -secreted. 행동의 알 수없는 모드의 화합물은 또한 11 연구되고있다. 이 방법의 수정 된 버전은 또한 세포 내 결핵균 (11)에 대해 새로운 화합물을 식별 차 스크리닝 방법으로서의 산업 파트너가 채택되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구의 목적은 결핵균에 대한 인간의 세포 내 감염 모델을 사용하여 간단하고 비용 효율적인 HTS 방법을 만드는 것이 었습니다. 결핵은 M. 결핵하여 폐포 대 식세포의 감염에 의해 특징 인간의 질병이다. 때문에 바이오 안전성 문제, 박테리아 및 숙주 세포 모두의 생물학적 모델을 포함하는 연구는 과거에 사용되어왔다. 그러나,이 대리 박테리아와 인간이 아닌 모델의 사용은 약물 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.
Materials
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
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