Wir haben für die Entdeckung neuer Verbindungen gegen Mycobacterium tuberculosis ein modulares Hochdurchsatz – Screening – System entwickelt, und die intrazelluläre Targeting-Brühe in Bakterien sowie Zytotoxizität gegen die Säuger – Wirtszelle wächst.
Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.
Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose (TB) ist eine führende Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit. Arzneimittelempfindlichen TB ist eine behandelbare Krankheit, die für einen Zeitraum von 6 Monaten mehr Antibiotika erfordert. Trotz einer behandelbaren Krankheit zu sein, wurde TB Sterblichkeit schätzungsweise 1 1,5 Millionen im Jahr 2015 sein. In den letzten 10 Jahren wurden dort zunehmende Besorgnis über die Verbreitung von arzneimittelresistenten Tuberkulose M.. Mehrfach arzneimittelresistenter Tuberkulose (MDR-TB) als TB definiert, die mindestens Isoniazid (INH) und Rifampicin (RMP) beständig ist, und die meisten MDR-TB-Stämme sind auch resistent second-line TB Medikamente auszuwählen, wodurch Behandlungsoptionen Zu . Die Auswirkungen von Medikamentenresistenz eine größere Herausforderung für die Behandlung von Patienten schaffen-Koinfektion mit Human Immunodeficiency Virus (HIV); 400.000 Patienten starben weltweit von HIV-assoziierten TB im Jahr 2015 1. Enttäuschend, den Vereinigten Staaten Food and Drug AdministRation hat nur eine neues TB – Medikament gegen MDR-TB, Bedaquilin, in den letzten 40 Jahren 2 genehmigt. Die Fortschritte bei der Suche nach besseren und kürzeren TB-Therapien sind dringend erforderlich, um vorne zu bleiben im Kampf gegen TB und MDR-TB.
Traditionell TB Arzneimittel Bildschirme sind unter in vitro – Wachstumsbedingungen in einem Wachstumsmedium durchgeführt, wobei Verbindungen zu einer wachsenden Kultur und ihre Wirksamkeit hinzugefügt werden die Mikroorganismen bei der Beseitigung der durch Zählen koloniebildenden Einheiten (CFU) auf einem festen Medium bestimmt. Als Keimzahlen arbeitsintensiv, zeitraubend und teuer werden verschiedene indirekte Methoden, um dieses Problem zu lindern entwickelt. Solche Verfahren umfassen die Lebensfähigkeit Alamar – Blau – Assay 3, die Bestimmung der Fluoreszenz 4 von grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder Lumineszenz 5 von Luciferase-exprimierenden Bakterien, und die Schätzung der Gesamt Adenosintriphosphat (ATP) 6, 7.
Typische TB wird durch eine Infektion mit M. tuberculosis der Lunge charakterisiert, in dem sich die Bakterien befinden , und im Inneren der Phagosomen von Alveolarmakrophagen 8 nachzubilden. Die einfache in-Brühe kann phänotypische Bildschirm extrazelluläre Erreger passen; jedoch in der historischen Perspektive getroffen Verbindungen gegen M. tuberculosis diese Methode oft identifiziert verwenden , nicht die Erwartungen bei der nachgeschalteten Validierungsschritten in Infektionsmodellen zu entsprechen . Wir schlagen vor, dass TB Medikament am besten in einem intrazellulären Wirtszelle Infektionsmodell durchgeführt wird. Dennoch besitzen die intrazelluläre Modelle viele technologische und biologische Barrieren für Hochdurchsatz-Screening (HTS) Entwicklung. Eine große Hürde ist die Komplexität des Infektionsprozesses, beispielhaft durch zahlreiche Schritte und die aufwendigen Entfernung von extrazellulären Bakterien, die durch in-zwischen dem Waschen. Eine zweite große Hürde ist die lange Zeit rederungen, als Wachstumserkennung erfolgt normalerweise durch Zählen CFU auf Kulturplatten, ist ein Prozess, vervollständigen über 3 Wochen dauert. Eine Lösung für CFU Zählungen ersetzt wurde durch automatisiertes Fluoreszenz-Mikroskopie in Kombination mit fluoreszierenden Bakterien bereitgestellt. Jedoch erfordert diese Lösung eine Erstausrüstung Investition, die für viele Forschungslabors außer Reichweite ist. Eine einfache, kostengünstige und krankheitsrelevanten HTS Verfahren würde die Drug Discovery-Prozess erheblich verbessern.
In dieser Studie berichten wir über ein neues, modulares HTS – System , das auf der Bereitstellung eine schnelle und hochskalierbaren, noch wirtschaftlich, Assay geeignet zur Bestimmung der Aktivität von Verbindungen gegen intrazelluläre M. tuberculosis gerichtet ist. Dieses System besteht aus drei Modulen: (i) intrazelluläre, (ii) die Zytotoxizität und (iii) in-Broth-Assays. Das kombinierte Endergebnis liefert eine umfassende Beschreibung der Verbindung Eigenschaften, mit zusätzlichen Informationen in Bezug auf die mögliche Wirkungsweise. diese screening System in mehreren Projekten mit verschiedenen Substanzbibliotheken verwendet worden ist, die Wirkungsweise zielen, einschließlich der Analyse von Arzneimittel Synergie 9, -secreted die Stimulation von autophagy 10 und die Hemmung von M. tuberculosis Virulenzfaktor (nicht veröffentlicht). Verbindungen unbekannter Wirkungsweise haben auch 11 untersucht worden. Eine modifizierte Version dieses Verfahrens wurde auch durch unsere Industriepartner als primäre Screening – Verfahren zur Identifizierung neuer Verbindungen gegen intrazelluläre M. tuberculosis 11 angenommen.
Verwendung eines menschlichen intrazellulären Infektionsmodell für M. tuberculosis Das Ziel dieser Studie war es, ein einfaches und kostengünstiges HTS – Verfahren zu erstellen. Tuberkulose ist ein Mensch durch die Infektion von Alveolarmakrophagen gekennzeichnet Krankheit , die durch M. tuberculosis. Aufgrund Fragen der biologischen Sicherheit, Forschung sowohl biologische Modelle des Bakteriums und die Wirtszellen beteiligt hat in der Vergangenheit verwendet worden. Allerdings hat es sich gezeigt …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.
RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
1M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
M. tuberculosis H37Rv | |||
96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |