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Neuroscience

Organotypic हिप्पोकैम्पस एक मॉडल के रूप में Neuroprotection और ट्यूमर कोशिकाओं की इनवेसिव अध्ययन के लिए संस्कृतियों स्लाइस

Published: August 27, 2017 doi: 10.3791/55359
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, Martin Luther University Halle-Wittenberg, 2Department of Anatomy, University of Otago
* These authors contributed equally

Summary

Organotypic हिप्पोकैम्पस स्लाइस संस्कृतियों (OHSC) एक इन विट्रो मॉडल है कि vivo स्थिति में बहुत अच्छी तरह से simulates प्रतिनिधित्व करते हैं । यहाँ हम एक vibratome आधारित सुधार टुकड़ा करने की क्रिया प्रोटोकॉल उपन्यास पदार्थों या ट्यूमर कोशिकाओं के जैविक व्यवहार की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता का आकलन करने में उपयोग के लिए उच्च गुणवत्ता स्लाइस प्राप्त करने के लिए वर्णन.

Abstract

organotypic हिप्पोकैम्पस स्लाइस संस्कृतियों में (OHSC), दोनों ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं के रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं को अच्छी तरह से संरक्षित कर रहे हैं । इस मॉडल के विभिंन अनुसंधान प्रश्न है कि neuroprotection पर अध्ययन शामिल है, न्यूरॉन्स, न्यूरॉन्स नेटवर्क या ट्यूमर के आक्रमण पर electrophysiological प्रयोगों को संबोधित करने के लिए उपयुक्त है । हिप्पोकैम्पस वास्तुकला और multisynaptic सर्किट में न्यूरॉन गतिविधि अच्छी तरह से OHSC में संरक्षित कर रहे हैं, भले ही टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया शुरू में ही घावों और एक glial निशान के गठन की ओर जाता है. निशान गठन संभवतः यांत्रिक गुणों और छोटे अणुओं के प्रसार व्यवहार को बदल, आदि स्लाइस पशु शल्य चिकित्सा के बिना मस्तिष्क की चोट के बाद समय पर निर्भर प्रक्रियाओं की निगरानी की अनुमति, और विभिन्न मस्तिष्क के बीच बातचीत पर अध्ययन कोशिका प्रकार, अर्थात् astrocytes, microglia और ंयूरॉंस दोनों शारीरिक और रोग स्थितियों. इस मॉडल का एक ambivalent पहलू रक्त प्रवाह और प्रतिरक्षा रक्त कोशिकाओं के अभाव है । न्यूरॉन की चोट की प्रगति के दौरान, रक्त से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को पलायन एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । के रूप में उन कोशिकाओं स्लाइस में लापता हैं, संस्कृति में आंतरिक प्रक्रियाओं बाहरी हस्तक्षेप के बिना मनाया जा सकता है । इसके अलावा, OHSC में मध्यम-बाह्य वातावरण की संरचना को ठीक नियंत्रित किया जाता है । इस विधि का एक और लाभ मानक तैयारियों की तुलना में बलि पशुओं की कम संख्या है । कई OHSC एक जानवर संभव एक जानवर में कई उपचार के साथ एक साथ अध्ययन करने से प्राप्त किया जा सकता है । इन कारणों के लिए, OHSC अच्छी तरह से ऊतक क्षति के बाद या ट्यूमर के आक्रमण के दौरान नए सुरक्षात्मक चिकित्सकीय के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए अनुकूल हैं ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल OHSC कि अत्यधिक प्रतिलिपि, अच्छी तरह से संरक्षित स्लाइस कि प्रयोगात्मक अनुसंधान की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, neuroprotection या ट्यूमर के आक्रमण के अध्ययन की तरह पैदा की अनुमति देता है की एक तैयारी विधि का वर्णन करता है ।

Introduction

OHSC एक अच्छी तरह से विशेषता इन विट्रो मॉडल में न्यूरॉन्स, astrocytes और microglia1के दोनों शारीरिक और रोग गुणों का अध्ययन कर रहे हैं । यह extracellular पर्यावरण को नियंत्रित करने और विभिन्न उत्तेजनाओं के बाद सेलुलर और रूपात्मक परिवर्तन की निगरानी करने के लिए आसान है । हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के संगठन और उनके कनेक्शन अच्छी तरह से तैयार करने के बाद संरक्षित कर रहे हैं2,3. कई फायदे से, OHSC पशु शल्य चिकित्सा के बिना मस्तिष्क की चोट और ट्यूमर के आक्रमण की निगरानी की अनुमति देते हैं । छह से आठ OHSC एक भी कुतर ब्रेन से प्राप्त किया जा सकता है । OHSC इसलिए काफी पशुओं की संख्या को कम करने और एक ही जानवर में कई दवा सांद्रता, आनुवंशिक जोड़तोड़ या अलग घाव मॉडल के परीक्षण की अनुमति मदद करते हैं । स्लाइस में आधारित परख, प्रयोगात्मक स्थितियों ठीक नियंत्रित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, द्वितीयक नुकसान की तरह रोग स्थितियों के समय निर्भर विकास आसानी से समय चूक इमेजिंग द्वारा निगरानी की जा सकती है ।

दिए गए प्रोटोकॉल में, मूल रूप से Stoppini एट अल द्वारा स्थापित । 4, तैयारी चरण बताए गए है और उपयुक्त स्लाइस के चयन के लिए महत्वपूर्ण रूपात्मक लैंडमार्क हाइलाइट किए गए हैं । हम प्रसव दिन 7-9 चूहों या प्रसव दिन 4-5 चूहों की तैयारी की सलाह देते हैं. इन समय में, OHSC यांत्रिक आघात के लिए एक मजबूत प्रतिरोध और न्यूरॉन सर्किट के पुनर्गठन के लिए एक उच्च क्षमता दिखा । इसके विपरीत, भ्रूण या वयस्क चूहों से तैयारी तेजी से अपनी संरचना को बदलने और खेती के दौरान अपने organotypic आकृति विज्ञान खो देते हैं और इसलिए बुनियादी अनुसंधान में लंबी अवधि प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कम उपयुक्त हैं5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. OHSC के जीवित रहने की दर के लिए एक और महत्वपूर्ण बिंदु ही प्रसार और इस प्रकार पोषक तत्वों की आपूर्ति के रूप में टुकड़ा की मोटाई है सीमित कर रहे है12,13,14।

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Protocol

< p class = "jove_content" > पशु प्रयोगों के अनुसार नैतिकता की नीति और तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में पशुओं के उपयोग पर नीति के रूप में यूरोपीय समुदाय परिषद के डायरेक्टर 2010/63/यूरोपीय संघ के यूरोपियन संसद और के द्वारा अनुमोदित किया गया वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जानवरों के संरक्षण पर यूरोपीय संघ की परिषद की ।

< p class = "jove_title" > 1. उपकरणों और संस्कृति मीडिया की तैयारी

OHSC की तैयारी के लिए
  1. उपकरणों के निम्न सेट का उपयोग करें: दो छोटे कैंची, दो घुमावदार चिमटी, एक ठीक टिप के साथ एक नोचना, तीन ब्लेड (आकार 11 के दो, आकार 15 में से एक), तीन स्केलपेल धारकों, दौर फिल्टर कागज (व्यास: ३५ मिमी), आगर, एक उस्तरा ब्लेड, एक संशोधित पाश्चर पिपेट, और एक संशोधित पाश्चर पिपेट एक टिप के बिना । उपयोग करने से पहले सभी सामग्रियों को एक आटोक्लेव में निष्फल कर ᱶ (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ).
  2. 5 ग्राम आगर वजन और १०० मिलीलीटर आसुत जल में इसे भंग । १२१.७ पर 20 मिनट के लिए समाधान निष्फल & #176; सी पर २१०.८ केपीए एक आटोक्लेव में । ६०-mm पेट्री व्यंजन में 3 मिलीलीटर तरल आगर समाधान वितरित एक बाँझ गिलास पिपेट का उपयोग कर, यह 5 ज के लिए जमना करने के लिए, प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ कवर करने के लिए संक्रमण से बचने और 4 & #176 पर दुकान, आगे का उपयोग जब तक. आगर ब्लॉक टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान दिमाग को स्थिर करने की जरूरत है ।
  3. मीडिया
    1. तैयारी मध्यम (पीएच ७.३५) के १९८ मिलीलीटर न्यूनतम आवश्यक माध्यम (मेम) और 2 एमएल एल glutamine समाधान (अंतिम एकाग्रता 2 मिमी) से मिलकर २०० मिलीलीटर बनाओ । मीडिया तैयारी के दिन समाधान तैयार करें और इसे 4 & #176; C.
      2. पर संग्रहित करे
    2. ने ४९ एमएल मेम से मिलकर कल्चरल मीडियम की १०० मिलीलीटर तैयार की, 25 मिलीलीटर हैंक्स & #39; संतुलित नमक समाधान (HBSS), 25 मिलीलीटर (v/सामान्य हार्स सीरम (एन एच एम), 1 एमएल एल-glutamine समाधान (अंतिम एकाग्रता 2 मिमी), १०० & #181; जी इंसुलिन, १२० मिलीग्राम ग्लूकोज, 10 मिलीग्राम streptomycin , १०,००० U पेनिसिलिन, और ८०० & #181; छ विटामिन सी के रूप में पहले बताया । मध्यम गर्म करें (३७ & #176; C), पीएच मान को समायोजित करने के लिए पीएच ७.४ और बाँझ फिल्टर (०.२ & #181; मी पोरे आकार). प्रक्रिया को दोहराएं (ऊपर वार्मिंग, पीएच समायोजन, आदि .) हर दूसरे दिन के माध्यम से बदलने से पहले । 4 & #176; C.
      3. पर संग्रहित करते समय एक सप्ताह के लिए सबसे अधिक मध्यम का उपयोग करें
  4. भरें १ ३५-mm पेट्री डिश के साथ तैयारी मध्यम करने के लिए मस्तिष्क की दुकान । कार्य क्षेत्र में एक कूलिंग पैक पर ऊतक इकट्ठा करने के लिए दो खाली पेट्री व्यंजन रखें ।
< p class = "jove_title" > 2. तैयारी और एक Vibratome

    के साथ टुकड़ा करने की क्रिया
  1. Stoppini एट अल के अनुसार OHSC तैयारी के लिए 7-9 दिन पुराने चूहों या 4-5 दिन पुराने चूहों से दिमाग का उपयोग करें । < सुप वर्ग = "xref" > 4 पशुओं के decapitation के बाद, खोपड़ी से त्वचा को कैंची से हटा दें ।
  2. फोरमेन मैग्नम में एक ठीक कैंची के ब्लेड परिचय और caudal (वापस) rostral (सामने) अक्ष के साथ काटने से खोपड़ी खोलो । पहले एक को सीधा करने के लिए दो कटौती करें, ताकि बाएं और दाएं कान की ओर कैंची बिंदु, क्रमशः (& #34; T-चीरा & #34;).
  3. ठीक संदंश के साथ ध्यान से खोपड़ी खुला, ध्यान दे मस्तिष्क घायल करने के लिए नहीं. एक स्केलपेल का प्रयोग करें (ब्लेड आकार 11) ललाट पोल के सबसे rostral भाग में कटौती और सेरिबैलम.
    4. एक रंग के माध्यम से
  4. , मस्तिष्क को हटा दें और इसे तैयारी माध्यम से भरी पेट्री डिश में सावधानीपूर्वक लगाएं (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ). नमूना धारक पर मस्तिष्क की स्थिति और यह चिकित्सा cyanoacrylate गोंद के साथ ठीक । यांत्रिक स्थिरीकरण को आश्वस्त करने के लिए आगर के टुकड़ों का उपयोग करें ।
  5. टुकड़े ऊतकों को क्षैतिज रूप से ३५० & #181; मी थिक OHSC प्रयोग गर्ने एक रपट vibratome.
  6. ऑप्टिकली एक दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर स्लाइस का मूल्यांकन । तुरंत कम गुणवत्ता के OHSC त्यागें । यह हिप्पोकैंपस के मध्य भाग से अलग बरकरार cytoarchitecture के साथ केवल उन स्लाइस लेने के लिए महत्वपूर्ण है (आंकड़े 3 और 4 देखें) पृष्ठीय और ventral हिप्पोकैंपस.
    7. के बीच
  7. हिप्पोकैम्पस क्षेत्र और एक स्केलपेल (गोल ब्लेड आकार 15 का उपयोग कर प्रांतस्था entorhinal अलग; < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ ). perforant मार्ग और entorhinal प्रांतस्था का संरक्षण करना होगा.
    8. प्रत्येक मस्तिष्क से
  8. छः से आठ OHSC प्राप्त होती हैं. स्थानांतरण 2-3 स्लाइस एक कोशिका संस्कृति डालने में (ताकना आकार ०.४ & #181; m) और यह एक अच्छी तरह से एक में जगह 6-अच्छी तरह से संस्कृति 1 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम से युक्त पकवान अच्छी तरह से ।
  9. की मशीन 6-अच्छी तरह से व्यंजन पर ३५ & #176; ग 5% (v/v) सह 2 के साथ एक पूरी तरह से humidified वातावरण में और सेल संस्कृति माध्यम हर दूसरे दिन बदल जाते हैं ।
    नोट: इन विट्रो (div) में 6 दिन पर अपने प्रयोगों आचरण । टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के साथ जुड़े भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 6 दिन से गायब हो जाते हैं । इस अवस्था में, microglial कक्ष एक ramified आकृति विज्ञान को फिर से दिखाते है और synaptic कनेक्शन परिपक्व हो गए हैं ।
< p class = "jove_title" > 3. ऊतक गुणवत्ता का मूल्यांकन

  1. निर्धारण, लेबलिंग और OHSC में चूकने न्यूरॉन्स के दृश्य
    1. प्रयोग करने के बाद, मशीन के साथ OHSC 5 & #181; g/मिलि propidium आयोडाइड (PI) के लिए 2 ज निर्धारण से पहले, में चूकने वाले न्यूरॉन्स के नाभिक को दाग लगाने का आदेश ।
      चेतावनी: पीआई एक संदिग्ध कैंसर है, हमेशा दस्ताने के रूप में व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनते हैं ।
    2. ०.१ एम फॉस्फेट बफर (पीएच ७.४) के साथ OHSC धो और एक 4% (वी/वी) समाधान paraformaldehyde (पीएफए) के 24 ज.
      के लिए के साथ ठीक सावधानी: पीएफए एक विषैला और संदिग्ध यलो है । धुएं हुड के तहत काम करते हैं और पीपीई.
      3. पहनते हैं
    3. 1 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ आवेषण में OHSC धोने और झिल्ली से अलग स्लाइस करने के लिए एक मेकेनिक ब्रश का उपयोग करें ।
    4. लैबल पर OHSC के साथ आईबी 4 डाई में 24 वेल प्लेट (< मज़बूत वर्ग = "xfig" > फिगर 5 ).
  2. ट्यूमर के आक्रमण का आचरण प्रयोग फ्लोरोसेंट एक प्रयोग के शुरू करने से पहले एकल कोशिकाओं
    1. 24 एच लेबल का उपयोग प्रयोगों, फ्लोरोसेंट डाई Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl का उपयोग करके ट्यूमर कोशिकाओं लेबल एस्टर (प्रेजेंट SE).
    2. अलग और एक Neubauer चैंबर का उपयोग ट्यूमर कोशिकाओं गिनती.
    3. में कक्षों को पुनर्स्थगित करना, ऐसे कि 10 & #181; L निलंबन के वांछित कक्ष संख्या (सामान्य रूप से ५०,००० या १००,००० कक्ष) शामिल हैं.
    4. लागू 10 & #181, स्लाइस संस्कृति पर सेल निलंबन के एल और कोशिकाओं 3 दिनों के लिए आक्रमण करने के लिए अनुमति देते हैं ।
      5. प्रयोग के अंत में
    5. , स्लाइस 4% (v/v का उपयोग कर संस्कृतियों को ठीक) 24 घंटे के लिए पीएफए, और लेबल के लिए एक और 24 के लिए पीआई के साथ संस्कृतियों cytoarchitecture.
      कल्पना सावधानी: पीएफए एक विषैला और संदिग्ध यलो है । धुएं हुड के तहत काम करते हैं और पीपीई.
      6. पहनते हैं
    6. आगे बढ़ते मीडिया का उपयोग कर विश्लेषण के लिए एक कवर पर्ची पर सह संस्कृतियों माउंट ।
< p class = "jove_title" > 4. OHSC प्रयोगों का मूल्यांकन

< p style = "मार्जिन-लेफ्ट: 40px;" > एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (CLSM) के साथ OHSC का विश्लेषण करें । pi का पता लगाने के लिए लेबल, चूकने न्यूरॉन्स या pi cytoarchitecture उपयोग रंग के प्रकाश तरंग दैर्ध्य & #955; = ५४३ एनएम और एक उत्सर्जन बैंड पास फिल्टर तरंग दैर्ध्य के लिए फ़िल्टर & #955; = 585-615 एनएम । फॉर प्रेजेंट लेबलेड ट्यूमर सेल या आईबी 4 microglia, & #955 के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें; = ४८८ एनएम । दोनों प्रायोगिक प्रकारों के लिए, 2 & #181 के साथ z-स्टैक रिकॉर्ड करें; m थिक ऑप्टिकल स्लाइस और मूल्यांकन के लिए उपयोग किया गया ।

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Representative Results

Neuroprotection अध्ययन: न्यूरॉन्स की क्षति का निर्धारण करने के लिए, पीआई पॉजिटिव नाभिक और आईबी की संख्या में4 पॉजिटिव microglia की हर तीसरी ऑप्टिकल सेक्शन में dentate गाइरस (DG) का granules सेल लेयर (GCL) गिना गया । ट्यूमर आक्रमण प्रयोगों के लिए, अधिक से अधिक तीव्रता z-स्टैक का प्रक्षेपण ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा कवर क्षेत्र की गणना के लिए इस्तेमाल किया गया था, आक्रमण का एक उपाय के रूप में और अलग आक्रमण पैटर्न कल्पना (चित्रा 6) ।

अनुपचारित नियंत्रण OHSC (CTL) में, न्यूरॉन्स अच्छी तरह से संरक्षित रहे. डीजी के GCL में लगभग कोई PI पॉजिटिव न्यूरॉन नाभिक (चित्रा 5 ए) मनाया गया. आणविक परत में, microglial कोशिकाओं के बहुमत ramified थे । डीजी के GCL में केवल बहुत कम आईबी4 पॉजिटिव microglial सेल (फिगर 5) का पता लगाया गया । ५० µ एम एन-मिथाइल-D-एसपारटिक एसिड (एनएमडीए) के साथ मशीनीकरण के बाद PI पॉजिटिव न्यूरॉन नाभिक की संख्या में एक मजबूत वृद्धि (चित्रा 5B) और आईबी4 सकारात्मक microglial कोशिकाओं (चित्रा 5B) का पता लगाया गया जब नियंत्रण OHSC की तुलना में. लोअर क्वालिटी के पूर्व क्षतिग्रस्त OHSC को नियंत्रण शर्तों के तहत डीजी (फिगर 5C) में amoeboid microglia और पीआई पॉजिटिव सेल की अधिक संख्या से पहचाना जा सकता है । एनएमडीए के साथ पूर्व क्षतिग्रस्त स्लाइस का इलाज डीजी cytoarchitecture के विनाश और वृक्कनाभि और CA3 क्षेत्र (चित्रा 5d) के लिए प्रसार PI सकारात्मक मौत कोशिकाओं की एक बहुत अधिक संख्या के साथ नेतृत्व किया.

ट्यूमर आक्रमण अध्ययन: स्लाइसेस दो ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइंस U138 (फिगर 6A) और LN229 (फिगर घमण्ड) के ५०,००० कोशिकाओं के साथ तीन दिन तक इलाज किया गया । दोनों ही मामलों में स्लाइस संस्कृतियों की cytoarchitecture बरकरार रही और कोर्नु ammonis और डीजी को संरक्षण दिया गया. इसके अलावा, दोनों सेल लाइनों अलग आक्रमण व्यवहार दिखाया । जबकि U138 कोशिकाओं दौर का गठन, स्पष्ट रूप से अलग ट्यूमर (चित्रा 6A), LN229 कोशिकाओं एकल ट्यूमर spheroids के भीतर एक ट्यूमर नेटवर्क का निर्माण और अक्सर भेद करने के लिए मुश्किल थे. जब स्लाइस संस्कृतियों में ट्यूमर मास की राशि को देखते हुए, LN229 कोशिकाओं के लिए एक उच्च इनवेसिव पाया गया जब U138 कोशिकाओं के साथ तुलना में ।

Figure 1
चित्र 1: विच्छेदन उपकरण और सामग्री. टुकड़ा संस्कृतियों की तैयारी के लिए, विच्छेदन उपकरण और सामग्री का एक उपयुक्त सेट के रूप में दिखाया गया है की आवश्यकता है । सेट छोटे विनिमेय ब्लेड के साथ तीन नश्तर शामिल हैं, एक रंग, दो महीन कैंची, तीन संदंश, एक सामांय पाश्चर पिपेट, टिप के बिना एक पाश्चर पिपेट, आगर, पेट्री व्यंजन, फिल्टर कागज, एक शीतलक पैक, तैयारी मध्यम, और चिकित्सा cyanoacrylate गोंद. विच्छेदन उपकरण उपयोग से पहले autoclaved होना चाहिए और इसे एक बाँझ वातावरण में रखने के लिए एक प्लास्टिक पैकेज में रखा गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: चूहे मस्तिष्क में हिप्पोकैम्पस गठन का स्थान । हिप्पोकैम्पस गठन, काले बिंदीदार रेखा द्वारा दिखाया एक द्विपक्षीय मस्तिष्क प्रांतस्था और thalamus द्वारा संलग्न संरचना है । हिप्पोकैंपस पार्श्व निलय के लौकिक सींग में उभार । हिप्पोकैंपस bilaminar है, कोर्नु ammonis (हिप्पोकैंपस उचित) और dentate गाइरस (या प्रावरणी dentate) से मिलकर, एक लेमिना के साथ दूसरे के अंदर लुढ़का । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: चूहे OHSC का दृश्य । एक पूरे मस्तिष्क टुकड़ा युक्त OHSC एक दूरबीन द्वारा कल्पना को ऊतक की गुणवत्ता का आकलन है । स्लाइस एक पेट्री ठंडा तैयारी मध्यम (ए, बी) के साथ भरा पकवान में रखा जाता है । मस्तिष्क टुकड़ा का इज़ाफ़ा । बरकरार हिप्पोकैंपस (एचसी) और entorhinal प्रांतस्था की छवि (ग) के बायीं और दाईं ओर दिखाई दे रहे हैं । OHSC मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से अलग है । डीजी, कोर्नु ammonis उपक्षेत्रों CA1 और CA3, hilus क्षेत्र (HI), entorhinal प्रांतस्था (ईसी) और आणविक परत (एमएल) का दाना कोशिका परत (GCL) स्पष्ट रूप से विशिष्ठ (घ) हैं । C, D: स्केल बार = 4 मिमी ।

Figure 4
चित्रा 4: OHSC में समय निर्भर परिवर्तन ।
सीधे तैयारी के बाद, microglia और astrocytes एक glial निशान बनाने के लिए शुरू करते हैं । से 1-3 दिन इन विट्रो (div) gliosis और शोफ गठन मनाया जाता है । हिप्पोकैम्पस गठन और डीजी का स्तरीकरण अब नहीं दिख रहा है । सेलुलर स्तर पर, OHSC पर 5 div सक्रिय कोशिकाओं की संख्या में कमी प्रदर्शित करते हैं । 6 div पर, लगभग कोई सूजन मौजूद है, स्लाइस पतली है, और क्षेत्रों आंतरिक न्यूरॉन सर्किट में शामिल बच गए हैं । OHSC अब प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । स्केल बार = 1 mm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: CLSM द्वारा ऊतक गुणवत्ता का मूल्यांकन । CLSM द्वारा पता चला के रूप में, एक अच्छा ंयूरॉन संरक्षण गैर क्षतिग्रस्त नियंत्रण OHSC (CTL) में मनाया जाता है । वस्तुतः कोई पीआई पॉजिटिव न्यूरॉन नाभिक (लाल) और केवल कुछ आईबी4 पॉजिटिव microglial सेल (ग्रीन) डीजी (ए) के granules सेल लेयर (GCL) में पाए जाते हैं । गैर-क्षतिग्रस्त OHSC के विपरीत, PI और आईबी की संख्या में एक मजबूत वृद्धि4 सकारात्मक कोशिकाओं एनएमडीए-घावों OHSC (बी) के GCL में दिखाई दे रहा है । डीजी, सक्रिय microglial कोशिकाओं और पूर्व क्षतिग्रस्त OHSC में PI सकारात्मक नाभिक की एक बड़ी संख्या (ग, D) की आकृति विज्ञान कृपया ध्यान दें । पट्टियां = ५० µ m. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: CLSM द्वारा ट्यूमर आक्रमण के दृश्य. निर्धारण के बाद लागू किया गया PI (लाल में) OHSC के cytoarchitecture लेबल, जबकि प्रेजेंट (हरे रंग में) टुकड़ा पर आक्रमण ट्यूमर कोशिकाओं को दिखाता है । आक्रमण के समय के तीन दिनों के बाद U138 कोशिकाओं की आक्रमण प्रक्रिया की कल्पना की जाती है. एकल ट्यूमर spheroidsस्पष्ट रूप से (एक) भेद कर रहे हैं । इसके विपरीत, ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन LN229 एक ट्यूमर नेटवर्क (ख) का गठन किया । सलाखों = ४०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल OHSC की तैयारी का वर्णन करता है । यह मॉडल आंतरिक क्षमताओं और मस्तिष्क ऊतक के शारीरिक और रोग उत्तेजनाओं के आवेदन के बाद प्रतिक्रियाओं के परीक्षण की अनुमति देता है । electrophysiological मापदंडों के विश्लेषण के अलावा, OHSC और क्षतिग्रस्त हो सकता है सभी प्रकार के सेल पर नुकसान का प्रभाव निर्धारित किया जा सकता है । विभिन्न पदार्थों के साथ उपचार और क्षतिग्रस्त प्रक्रियाओं या मैक्रोफेज और लिम्फोसाइटों के अभाव में चिकित्सा के विस्तृत वर्णन संभव है ।

एक सफल तैयारी और संवर्धन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम के लिए कर रहे हैं: 1) बाँझ शर्तों के तहत काम करते हैं, 2) मीडिया सही ढंग से तैयार, तापमान और पीएच पर विचार, और 3) OHSC की हैंडलिंग के दौरान आवश्यक मैनुअल निपुणता विकसित.

OHSC के लक्षण

क्योंकि ंयूरॉन कोशिकाओं के अनछुए आकृति विज्ञान और उनके vivo-like संगठन में, स्लाइस को organotypic कहा जाता है । OHSC की परत pyramidale और परत granulosum से मिलकर बनता है, पिरामिडीय कोर्नु ammonis (CA1, सीए, CA3) और डीजी दानेदार कोशिकाओं से बना है । हिप्पोकैंपस के भागों अत्यधिक आदेश दिया और afferent फाइबर अनुमानों एक गैर अतिव्यापी रास्ते में अलग परतों में समाप्त कर रहे हैं । entorhinal प्रांतस्था (perforant मार्ग), डीजी, CA3 और CA1 न्यूरॉन्स के बीच efferences की तैयारी के बाद बरकरार रहना और कार्यात्मक रूप से vivo मेंउन लोगों के समान व्यवहार. के रूप में पहले दिखाया गया है, वृक्ष पेड़ों के विकास, synapse गठन और OHSC में दानेदार कोशिकाओं के नेटवर्क गतिविधियों तीव्र स्लाइस समय से प्राप्त की तुलना कर रहे है मिलान नियंत्रण14,15,16।

Oligodendrocytes और astrocytes दोनों प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा OHSC में अध्ययन किया गया है । Oligodendrocytes विभिन्न रूपात्मक उपप्रकारों17,18सहित एक organotypic स्थानिक वितरण, प्रदर्शन । साथ ही, axons इन विट्रो मेंपहले दो हफ्तों के दौरान myelinated हो जाते हैं । कुछ लेखकों माने कि परत astrocytes के विशिष्ट स्थानीयकरण टुकड़ा संस्कृतियों में अनुपस्थित है और विश्वास है कि astrocytes एक पूर्ण परिपक्वता विट्रो मेंपहुंच नहीं है । इस पहलू का पूरी तरह से उत्तर नहीं दिया जा सकता है, क्योंकि astrocytes के सभी सक्रियण चरणों के लिए विशिष्ट मार्कर अभी भी1,19,20लापता हैं ।

पहले 3 दिनों में तैयारी के बाद, microglial कोशिकाओं प्रवास और प्रसार के साथ प्रतिक्रिया और टुकड़ा सतह पर जमा है, जहां वे astrocytes के साथ एक साथ glial निशान फार्म । सभी कोशिकाएँ अत्यधिक सक्रिय अवस्था में होने लगती हैं. हालांकि, OHSC की भीतरी परतों में और 3 और 6 div के बीच, microglial कोशिकाओं को एक ramified रूप की ओर अपने amoeboid आकृति विज्ञान बदल, छोटे सेलुलर निकायों और लंबी शाखाओं में बंटी ठीक cytoplasmic दखलंदाजी सभी दिशाओं में विस्तारित की विशेषता21 ,22.

इसी तरह की अभिव्यक्ति और ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के वितरण वयस्क ऊतक और OHSC2,23में सूचित किया गया है । synaptic धाराओं की आवृत्ति, लघु synaptic धाराओं और OHSC में GABAergic धाराओं की आवृत्ति (7, 14 और 21 div) प्रसव दिनों पर तीव्र तैयारी की तुलना में काफी अलग नहीं हैं 14 या 15 क्रमशः. इसके विपरीत, glutamatergic संकेतों की आवृत्ति तीव्र स्लाइसों की तुलना में OHSC में अधिक है15.

विभिंन तैयारी विधियों की तुलना

भ्रूण और जल्दी प्रसव ऊतक की तैयारी काफी आसान है, क्योंकि अच्छा सेल जीवित रहने की दरों में इन विट्रो। यह विचार किया जाना चाहिए कि इस प्रारंभिक चरण में, न्यूरॉन्स कोशिकाओं अभी भी प्रवासी हैं और सक्रिय1स्लाइस के organotypic संगठन के नुकसान के लिए अग्रणी. 7-9 प्रसव दिनों के बाद, चूहों में कुछ synaptic कनेक्शन स्थापित किए जाते हैं. अगले 2-3 हफ्तों के दौरान इन विट्रो synapses परिपक्व13। प्रस्तुत मॉडल के फायदों में से एक तैयार करने के दौरान यांत्रिक आघात के लिए प्रतिरोध है और इसकी उच्च प्लास्टिक जानवरों की आयु के कारण (7-9 दिन)1,14,24। यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि स्लाइसें उपकरणों द्वारा यांत्रिक जोड़तोड़ के लिए अत्यधिक संवेदनशील हैं । यहां तक कि टुकड़ा करने की क्रिया के गलत कोण anterograde या प्रतिगामी ंयूरॉन निधन के लिए जिंमेदार ंयूरॉन फाइबर के इच्छुक काटने का कारण हो सकता है । लंबी अवधि के प्रयोजनों के लिए वयस्क जानवरों से स्लाइस संस्कृतियों की तैयारी और चुनौतीपूर्ण अभी भी स्थापित नहीं है । इस तरह के OHSC एक बड़े पैमाने पर अध कि शीघ्र ही तैयारी संभवतः प्लास्टिक की हानि के कारण1के बाद दिखा । फिर भी, वहां एक तैयारी वयस्क स्लाइस के साथ काम के लिए अनुमति विधि के लिए एक मजबूत की जरूरत है ।

कई तैयारी के तरीकों के लिए, हौसले से उत्पाद के ऊतकों 300-400 µm की एक मोटाई के लिए कटा हुआ है, एक ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग करने के लिए अलग हिप्पोकैंपस कटौती । इस त्वरित विधि अक्सर व्यापक ऊतक नुकसान में परिणाम कर सकते हैं । OHSC की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण कारकों उनके अंतिम मोटाई और समय वे इन विट्रो मेंरखा जाता है रहे हैं । सबसे अधिक जीवित रहने की दर के साथ सबसे अच्छा परिणाम 300-400 µm मोटी स्लाइस के लिए हासिल किया गया है । मोटा स्लाइस ऊपरी परतों में संस्कृति प्रसार के कारण समय के दौरान पतित1सीमाएं । वैज्ञानिक प्रश्नों के आधार पर कहा, OHSC या तो सीधे तैयारी के बाद या संस्कृति में कई दिनों के बाद उपयोग किया जाता है । इसलिए, वर्षों में कई खेती की तकनीक, रोलर-ट्यूब तकनीक1,13 या स्थैतिक स्लाइस तकनीक4की तरह स्थापित किया गया ।

अलग तैयारी तरीकों से हम आश्वस्त है कि इंटरफ़ेस तकनीक का उपयोग कर एक साथ एक vibratome के लिए सबसे सटीक और कम से OHSC की तैयारी के लिए हानिकारक प्रक्रिया है तारीख । इस विधि आगे छिद्रित झिल्ली का उपयोग करके सुधार हुआ है । OHSC अपने 3d संरचना रखने के लिए, आकृति रहने और महीनों के लिए कार्यात्मक रूप से बरकरार है, और नेत्रहीन खेती की अवधि के दौरान मूल्यांकन किया जा सकता है25।

अनुप्रयोगों

OHSC जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक पशुओं14,26से तैयार किया जा सकता है । वे महीनों के लिए जीवित है और लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए12,13विकल्प प्रदान करते हैं । OHSC शारीरिक, औषधीय, रूपात्मक और विकासात्मक प्रश्न14,उच्च मानक के तहत27 पता करने के लिए उपयोग किया जाता हैneurotherapeutics या स्टेम सेल थेरेपी26,27,28के जीर्ण आवेदन के रूप में ized शर्तों । synaptic संचरण, synaptic प्लास्टिक, वृक्ष के जीर्ण मिर्गी के प्रभाव के पिरामिड कोशिकाओं के spins, या neurogenesis सभी अतिरिक्त क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करने से संबंधित प्रक्रियाओं के विकासात्मक पहलुओं की जांच । 29,30,31,३२.

ग्लूटामेट, प्राथमिक उत्तेजक न्यूरोट्रांसमीटर और ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स excitotoxicity में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । Excitotoxic घावों स्ट्रोक, अल्जाइमर रोग, एचआईवी neurotoxicity, दर्दनाक मस्तिष्क की चोट और मरम्मत तंत्र14,24की तरह स्नायविक रोगों के दौरान होते हैं । ग्लूटामेट रिसेप्टर एगोनिस्ट एनएमडीए, α-अमीनो-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic एसिड (AMPA), या kainic एसिड OHSC की नकल करने के लिए आवेदन चयनात्मक और क्षेत्र विशिष्ट न्यूरॉन सेल मौत26,28,३३ ,३४. इसके अलावा, glial कोशिका प्रतिक्रिया के लिए ंयूरॉंस की चोट उदा, microglial प्रवासन और OHSC में phagocytosis पहले से विश्लेषण किया गया है3,३५। घाव के दौरान microglia के प्रभाव bisphosphonate clodronate३६द्वारा इन कोशिकाओं के औषधीय कमी की भविष्यवाणी की जा सकती है ।

एक और महत्वपूर्ण आवेदन OHSC का उपयोग ट्यूमर आक्रमण की जांच के लिए vivo स्थितियों में नकल उतार उठता है । तंत्रिकाबंधार्बुद सेल लाइनों द्वारा गठित Spheroids टुकड़ा संस्कृतियों, एक घटना है कि३७अतिव्यापी प्रजातियों था हमलावर में सक्षम थे । सेल लाइनों के प्रसार घुसपैठ पैटर्न vivo३७में मनाया पैटर्न जैसा दिखता था । इसके अलावा, प्राथमिक ग्लियोब्लास्टोमा spheroids OHSC में प्रत्यारोपित अपने आक्रमण क्षमता और स्टेम सेल चरित्र कई दिनों से अधिक इन विट्रो३८में रखा । इस प्रकार, मॉडल आक्रमण पैटर्न और ंयूरॉन ऊतक और ट्यूमर कोशिकाओं है कि vivo३७,३८ मेंमनाया उन से संबंधित के बीच बातचीत के अवलोकन की अनुमति देता है । कोलेजन या जेल आधारित मॉडल की तुलना में (उदा)३९, OHSC का उपयोग मस्तिष्क में मेटास्टेसिस और ट्यूमर के आक्रमण पर विश्लेषण के लिए और अधिक लाभकारी लगता है. शारीरिक वातावरण, जिसमें न्यूरॉन और glial कोशिका प्रकार और extracellular मैट्रिक्स शामिल हैं, यथावत रहता है.

इसके अलावा, OHSC नियंत्रित परिस्थितियों में एकल ट्यूमर कोशिकाओं और मस्तिष्क ऊतक के बीच सीधा संपर्क का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं । उदाहरण के लिए, microglial कोशिकाओं को ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमताओं को बढ़ाने के लिए३५आक्रमण के लिए मार्गदर्शक संरचनाओं के गठन के द्वारा मस्तिष्क में प्रवेश पाया गया ।

इसके अलावा, आक्रमण प्रक्रियाओं पर क्षणिक और स्थाई सेलुलर परिवर्तन के प्रभाव का विश्लेषण किया जा सकता है । तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं में मेटास्टेसिस जुड़े बृहदांत्र कैंसर जीन 1 (MACC1) की एक स्थिर अभिव्यक्ति एक वृद्धि हुई प्रसार और बाद के आक्रमण के साथ जुड़ा हुआ था४०। ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइनों में कोशिका कठोरता के क्षणिक परिवर्तन सीधे सेल लाइनों४१के इनवेसिव गुणों के साथ संबद्ध किया गया था । OHSC और ट्यूमर सेल सह संस्कृतियों इस प्रकार संभावित दवा परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, नैदानिक टिप्पणियों के प्रजनन, और मॉडल और छवि के लिए अत्यधिक नियंत्रित और मानकीकृत शर्तों के तहत ट्यूमर आक्रमण ।

प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों में अध्ययन के बाद, OHSC एक और अधिक जटिल प्रणाली में प्रयोग प्रदर्शन के लिए तार्किक अगले पसंद कर रहे है अनुमानित करने के लिए vivo में शर्तों । मस्तिष्क स्लाइस में ब्याज की एक और क्षेत्र vivo मेंपरीक्षण से पहले संभावित चिकित्सीय दवाओं की स्क्रीनिंग है । मस्तिष्क स्लाइस निगरानी नियंत्रण और पशु शल्य चिकित्सा के बिना चोटों की नकल उतारने की अनुमति देते हैं । तक 8 OHSC प्राप्त किया जा सकता है और आवश्यक पशुओं की संख्या काफी कम है । यह समान सेटिंग्स के तहत लेकिन अलग या कई शर्तों के साथ एक ही जानवर में परिणाम प्राप्त करने के लिए संभव है । इस प्रकार, OHSC एक शक्तिशाली उपकरण रूपात्मक, सेलुलर, घाव की अवधि, माध्यमिक क्षति और ट्यूमर के प्रसार के विकास के दौरान आणविक परिवर्तन दूसरों के बीच निरीक्षण करने के लिए है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

लेखक अपनी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए वीडियो रिकॉर्डिंग और चल्द Ghadban के साथ उसके समर्थन के लिए क्रिस्टीन Auste शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । Urszula Grabiec रॉक्स Programm FKZ 29/18 द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-Well Falcon 35-3046
Agar Fluka 5040
Autoclav Systec DX-45
CFDA  Thermo Fisher V12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium  Invitrogen 32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Labs FL-1101
Glucose Merk 1083371000
Glutamin Invitrogen 25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) Invitrogen 24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+) Invitrogen 14170-138
Insulin Sigma Aldrich I5500
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960
L-Glutamin Invitrogen 25030-024
LN229 Cell-Lines-Service 300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) B.Braun 1050052
Millicell Culture Inserts Millipore PICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich M3262
Normal Horse Seum Invitrogen 26050-088
Penicillin Streptomycin Invitrogen 15140-122
Petri dishes (all sizes) Greiner 627160/664160/628160
PFA Roth 0335.1 toxic
Propidium iodid (PI) Sigma Aldrich 81845-25MG toxic
U138 ATCC HTB-14
Vibratome Leica Leica VT 1200

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Grabiec, U., Hohmann, T., Hammer, N., Dehghani, F. Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (126), e55359, doi:10.3791/55359 (2017).

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