Summary
Organotypic hippocampus skive kulturer (OHSC) representerer en i vitro modell som simulerer i vivo situasjonen veldig godt. Her beskriver vi en vibratome-basert forbedret kutting protokoll for å få høy kvalitet skiver for bruk i vurderingen neuroprotective potensialet i romanen stoffer eller biologisk atferd av kreftceller.
Abstract
I organotypic hippocampus skive kulturer (OHSC) er de morfologiske og funksjonelle kjennetegnene både neurons og gliacellene godt bevart. Denne modellen er egnet for adressering ulike problemstillinger som involverer studier på neuroprotection, elektrofysiologiske eksperimenter på neurons, nevrale nettverk eller svulst invasjon. Hippocampus arkitekturen og neuronal aktivitet i multisynaptic kretser er godt bevart i OHSC, selv om kutting prosedyren selv opprinnelig lesjoner og fører til dannelsen av et glial arr. Arr-dannelse endres antagelig de mekaniske egenskaper og diffusive atferd av små molekyler, etc. Skiver tillate overvåking av tid avhengig prosesser etter hjerneskade uten dyr kirurgi og studier på interaksjoner mellom ulike hjerne-avledet celletyper, nemlig astrocyttene, microglia og neurons under både fysiologiske og patologiske forhold. En ambivalent aspekt av denne modellen er fravær av blodstrøm og blod immunceller. Under utviklingen av neuronal skade, overføring av immunceller fra blod spille en viktig rolle. Som disse cellene mangler i skiver, kan indre prosessene i kulturen sees uten ytre forstyrrelser. Videre i OHSC kontrollert sammensetningen av medium-eksterne miljøet presist. Enda en fordel med denne metoden er lavere antall ofret dyr sammenlignet med standard forberedelser. Flere OHSC kan fås fra en dyr gjør samtidige studier med flere behandlinger i en dyr mulig. For disse grunner, OHSC er godt egnet til å analysere effekten av nye beskyttende therapeutics etter vevsskade eller svulst invasjon.
Protokollen presentert beskriver her en forberedelse metode for OHSC som kan generere svært reproduserbare, godt bevart skiver som kan brukes til en rekke eksperimentell forskning, som neuroprotection eller tumor invasjonen studier.
Introduction
OHSC er en godt karakterisert i vitro modell å studere både fysiologiske og patologiske egenskaper av neurons, astrocyttene og microglia1. Det er lett å kontrollere ekstracellulære miljøet og overvåke endres mobilnettet og morfologiske etter ulike stimuli. Organiseringen av hippocampus nevroner og deres tilkoblinger er godt bevart etter forberedelse2,3. Av flere fordeler, OHSC tillate overvåking av hjernen skader og tumor invasjonen uten dyr kirurgi. Seks til åtte OHSC kan fås fra en enkelt gnager hjerne. OHSC derfor bidra til betydelig redusere antall dyr og la teste flere narkotika konsentrasjoner, genetisk manipulasjon eller annen lesjon modeller i samme dyret. I sektor-baserte analyser, kan eksperimentelle forhold kontrolleres nøyaktig. I tillegg kan tid avhengig utviklingen av patologisk forhold som sekundær skader lett overvåkes av tidsinnstilt bildebehandling.
I den gitte protokollen, opprinnelig etablert av Stoppini et al. 4, forberedelsene er beskrevet og viktige morfologiske landemerker for valg av riktig skiver utheves. Vi anbefaler utarbeidelse av postnatal dag 7-9 rotter eller postnatal dag 4-5 mus. I disse periodene, OHSC viser en robust motstand mot mekanisk traumer og stort potensial for omorganisering av nevrale kretser. Derimot preparater fra embryonale eller voksen rotter raskt endre strukturen og mister sine organotypic morfologi under dyrking og er derfor mindre egnet for studerer langsiktige prosesser i grunnforskning5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. en annen kritisk punkt for overlevelse av OHSC er tykkelsen på sektoren seg som spredning og dermed næringsstoff levering er begrenset12,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dyreforsøk ble utført i samsvar med politikk av etikk og retningslinjer for bruk av dyr i nevrovitenskap forskning som er godkjent av europeiske fellesskap råd direktivet 2010/63/EU fra Europaparlamentet og av rådet for EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskaplige formål.
1. forberedelse av instrumenter og kultur medier
- For utarbeidelse av OHSC bruke følgende instrumenter: to liten saks, to buet pinsett, ettall tweezer med fine tips, tre blad (to av størrelse 11, en av størrelse 15), tre skalpell holdere, runde filter papir (diameter: 35 mm), agar, en barberblad, en uendret Pasteur pipette, og en modifisert Pasteur pipette uten et tips. Sterilisere alle materialer i en autoklav før behandling ( figur 1).
- Veier 5 g agar og oppløse den i 100 mL destillert vann. Sterilisere løsningen for 20 min ved 121.7 ° C ved 210.8 kPa i en autoklav. Distribuere 3 mL væske agar løsningen i 60 mm Petri retter med en bakteriefri glass pipette, tillater det å stivne for 5 h, dekk med plast parafin film å unngå forurensning og lagre på 4 ° C til videre bruk. Agar blokker er nødvendig for å stabilisere hjernen under kutting prosedyren.
- Media
- gjøre 200 mL forberedelse mediet (pH 7.35) bestående av 198 mL minimal viktig medium (MEM) og 2 mL L-glutamin løsning (siste konsentrasjon 2 mM). Forberede løsningen ved media forberedelse og lagre den på 4 ° C.
- Forberede 100 mL kultur medium bestående av 49 mL MEM, 25 mL Hanks ' balansert salt løsninger (HBSS), 25 mL (v/v) normal hest serum (NHS), 1 mL L-glutamin løsning (siste konsentrasjon 2 mM), 100 µg insulin, 120 mg glukose, 10 mg streptomycin , 10.000 U penicillin og 800 µg vitamin C som rapportert tidligere. Varm mediet (37 ° C), justere pH verdien pH 7,4 og sterile filter (0,2 µm porestørrelse). Gjenta (varmer opp, pH, osv.) hver annen dag før du endrer medium. Bruke mediet mest for en uke når lagret på 4 ° C.
- Fylle en 35 mm Petriskål med forberedelse medium for lagring av hjernen. Plasser to tomme Petri retter for innsamling vev på en avkjølende pakke i arbeidsområdet.
2. Forberedelse og Slicing med en Vibratome
- Bruk hjernen fra 7-9 dag gammel rotter eller 4-5 dager gammel mus OHSC forberedelse etter Stoppini et al. 4 etter halshogging av dyr, Fjern skinnet fra skallen med saks.
- Innføre blad av en fin saks i foramen magnum og åpne skallen ved å kutte langs caudal (tilbake) rostral (front) aksen. Lag to skjærer vinkelrett til den første, slik at saksen peker mot venstre og høyre øret, henholdsvis (" T-snitt ").
- Åpne skallen nøye med fine tang, betalende oppmerksomhet ikke å skade hjernen. Bruk en skalpell (bladet størrelse 11) til å kutte den mest rostral delen av frontal pole og lillehjernen.
- Ved hjelp av en slikkepott, fjerne hjernen og plasser den nøye i Petriskål fylt med forberedelse medium ( figur 2). Plasser hjernen på prøveholderen, og fikse det med medisinsk cyanoacrylate lim. Bruke deler av agar for å sikre mekanisk stabilisering.
- Dissekere vevet vannrett i 350 µm tykk OHSC bruker en glidende vibratome.
- Vurdere skiver optisk bruke kikkert mikroskop. Kast OHSC av lav kvalitet umiddelbart. Det er viktig å ta bare de skiver med intakt cytoarchitecture isolert fra den midtre delen av hippocampus (se tallene 3 og 4) mellom den rygg og ventrale hippocampus.
- Skille regionen hippocampus og entorhinal cortex ved hjelp av en skalpell (rundt bladet størrelse 15; Figur 3). Perforant veien og entorhinal cortex må bevares.
- Seks til åtte OHSC hentes fra hver hjernen. Overføre 2-3 skiver til én celle kultur sett inn (pore størrelse 0,4 µm) og plasserer den i en brønn av en 6-vel kultur parabol med 1 mL kultur medium per brønn.
- Ruge 6-vel rettene på 35 ° C i en fullstendig fuktet atmosfære med 5% (v/v) CO 2 og endre celle kultur medium hver andre dag.
Merk: Gjennomføre eksperimenter på 6 dag i vitro (div). Inflammatoriske reaksjoner forbundet med kutting prosedyren forsvinner etter dag 6. På dette stadiet, microglial celler Vis en ramified morfologi igjen og synaptic tilkoblinger har modnet.
3. Evaluering av vevet kvalitet
- fiksering, merking og visualisering av degenereres nerveceller i OHSC
- etter utføre eksperimenter, ruge OHSC med 5 µg/mL propidium iodide (PI) for 2t før fiksering, i rekkefølgen stain kjerner i degenereres neurons.
FORSIKTIG: PI er et mulig karsinogen, alltid bruke personlig verneutstyr (PVU) som hansker. - Vask OHSC med 0.1 M fosfatbuffer (pH 7.4) og fikse dem med en 4% (v/v) løsning av paraformaldehyde (PFA) for 24 h.
FORSIKTIG: PFA er en giftig og mistenkt kreftfremkallende. Arbeid under avtrekksvifte og slitasje PPE. - Vask OHSC i setter inn med 1 mL PBS og bruke en mekaniker pensel til å skille sektorene fra membranen.
- Merke OHSC med IB 4 fargestoff i en 24-vel plate ( figur 5).
- etter utføre eksperimenter, ruge OHSC med 5 µg/mL propidium iodide (PI) for 2t før fiksering, i rekkefølgen stain kjerner i degenereres neurons.
- Gjennomføring av svulst invasjonen eksperimenter ved hjelp av fluorescently merket enkeltceller
- 24 timer før starten av et eksperiment, etiketten kreftceller ved å bruke fluorescerende farge Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl Ester (CFDA SE).
- Koble og telle kreftceller bruker en Neubauer kammer.
- Resuspend cellene i medium, slik at 10 µL av suspensjon inneholder ønsket celle nummer (vanligvis 50.000 eller 100.000 celler).
- 10 µL av cellen suspensjon på skive kulturen og at cellene å invadere for 3 dager.
- På slutten av eksperimentet, fikse skive kulturer med 4% (v/v) PFA 24 h, og Merk co kulturer med PI for en annen 24 h å visualisere cytoarchitecture.
FORSIKTIG: PFA er en giftig og mistenkt kreftfremkallende. Arbeid under avtrekksvifte og slitasje PPE. - Montere co kulturer på en cover slip for videre analyse bruker montering media.
4. Evaluering av OHSC eksperimenter
analysere OHSC med en AC confocal laserskanning mikroskopet (CLSM). For deteksjon av PI merket, degenereres nerveceller eller PI merket cytoarchitecture bruke monokromatisk lys bølgelengde λ = 543 nm og et utslipp band pass filter for bølgelengder λ = 585-615 nm. For CFDA merket kreftceller eller IB 4 microglia, bruke en eksitasjon bølgelengden til λ = 488 nm. Registrere en z-stabel med 2 µm tykke optisk skiver for både eksperimentelle typer, og brukes for evaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neuroprotection studier: Å avgjøre neuronal skade, PI positiv kjerner og IB4 positiv microglia i hver tredje optisk inndelingen i granule celle laget (GCL) av dentate gyrus (DG) regnes. For svulst invasjonen eksperimenter, ble maksimal intensitet z-projeksjon av stabelen brukt til å beregne området som dekkes av kreftceller, som et mål av invasjonen og visualisere ulike invasjonen mønstre (figur 6).
I ubehandlet kontrollen OHSC (CTL) forble neurons godt bevart. I GCL av DG ble nesten ingen PI positiv neuronal kjerner (figur 5A) observert. I molekylær laget, var fleste microglial cellene ramified. I GCL av DG, bare svært få IB4 positiv microglial celler (figur 5A) ble oppdaget. Etter inkubasjon med 50 µM N-methyl-D-aspartic syre (NMDA) en sterk økning i antall PI positiv neuronal kjerner (figur 5B) og IB4 positiv microglial celler (figur 5B) ble oppdaget i forhold til kontrollen OHSC. Pre skadet OHSC av lavere kvalitet kan identifiseres ved høyere antall amoeboid microglia og PI positiv celler i DG (figur 5C) under kontroll forhold. Behandle pre skadede sektorer med NMDA førte til ødeleggelse av DG cytoarchitecture og et svært høyt antall PI positiv død celler sprer seg til hilum og CA3 regionen (figur 5 d).
Tumor invasjonen studier: Skiver ble behandlet med 50 000 celler av de to glioblastom linjene U138 (figur 6A) og LN229 (figur 6B) i tre dager. I begge tilfeller cytoarchitecture av skive kulturer forble intakt og cornu ammonis og DG ble bevart. Videre cellelinjer både viste tydelig invasjonen atferd. Mens U138 celler dannet rundt, tydelig tydelige svulster (figur 6A), LN229 celler bygget en svulst nettverk innen enkelt svulst spheroids og var ofte vanskelig å skille. Når du ser på mengden av svulst masse skive kulturer, fant en høyere invasiveness for LN229 celler sammenlignet med U138 celler.
Figur 1: disseksjon verktøy og materialer. For utarbeidelse av skive kulturer er egnet disseksjon verktøy og materialer nødvendig som vist. Settet inneholder tre skalpeller med små utskiftbare blad, en slikkepott, to fine saks, tre tang, en vanlig Pasteur pipette, en Pasteur pipette uten tips, agar, Petri retter, filter papir, kjøling pack, forberedelse medium og medisinsk Cyanoacrylate lim. Disseksjon verktøy må autoklaveres før forbruk og plassert i en plast pakke å holde det i et sterilt atmosfære. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: plassering av hippocampus formasjonen i rotte hjernen. Hippocampus dannelsen, vist av den svarte stiplede linjen er en bilateral struktur omgitt av hjernebarken og thalamus. Hippocampus buler i timelige Hornet av lateral ventrikkel. Hippocampus er bilaminar, som består av cornu ammonis (hippocampus riktig) og dentate gyrus (eller fascia dentate), med en lamina fremhevet inne i den andre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: visualisering av rotten OHSC. En hele hjernen skive som inneholder OHSC er visualisert ved en kikkert å vurdere kvaliteten vev. Skiver holdes i en Petriskål fylt med avkjølt forberedelse medium (A, B). Forstørrelse på hjernen sektoren. Intakt hippocampus (HC) og entorhinal cortex er synlige på venstre og høyre side av bildet (C). OHSC er atskilt fra resten av hjernen. Det granule celle laget (GCL) av DG, cornu ammonis underfelt CA1 og CA3, hilus regionen (HI), entorhinal cortex (EC) og molekylære laget (ML) er klart kan skilles (D). C, D: skala bar = 4 mm.
Figur 4: Tid avhengig endringer i OHSC.
Direkte etter utarbeidelse, microglia og astrocyttene begynne å danne et glial arr. Fra 1-3 dager i vitro (div) gliosis og ødem dannelse er observert. Lagdeling av hippocampus formasjon og DG er ikke lenger synlig. På cellenivå vise OHSC på 5 div en reduksjon i antall aktivert celler. På 6 div, nesten ingen ødem finnes, stykket er tynnere og områdene i indre nevrale kretser har overlevd. OHSC kan nå brukes til eksperimenter. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: evaluering av vevet kvalitet av CLSM. Idet avsløre av CLSM, er en god neuronal bevaring observert i kontrollen ikke-lesioned OHSC (CTL). Nesten finnes ingen PI positiv neuronal kjerner (rød) og bare noen IB4 positiv microglial celler (grønn) i granule celle laget (GCL) av DG (A). I motsetning til ikke-lesioned OHSC er en sterk økning i antall PI og IB4 positiv celler synlig i GCL av NMDA-lesioned OHSC (B). Merk morfologi av DG, aktivert microglial celler og et stort antall PI positiv atomkjerner i pre skadet OHSC (C, D). Barer = 50 µM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: visualisering av svulst invasjon av CLSM. PI (i rødt) brukt etter fiksering etikettene cytoarchitecture av OHSC, mens CFDA (i grønt) illustrerer kreftceller invadere sektoren. Invasjonen prosessen av U138 celler er visualisert etter tre dager med invasjonen tid. Enkelt svulst spheroidser klart kan skilles (A). Derimot dannet glioblastom celle linjen LN229 en svulst nettverk (B). Barer = 400 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nåværende protokollen beskriver utarbeidelsen av OHSC. Denne modellen gjør testing av iboende evner og reaksjoner av hjernevevet etter fysiologiske og patologiske stimuli. Foruten analyser av elektrofysiologiske parametere, OHSC kan være lesioned og effekten av skade på alle celletyper kan bestemmes. Behandling med forskjellige stoffer og den detaljerte beskrivelsen av lesioning prosesser eller helbredelse i fravær av makrofager og lymfocytter er mulig.
The Most avgjørende skritt for en vellykket forberedelse og dyrking er å: 1) fungerer under sterile forhold, 2) forberede media riktig, vurderer temperatur og pH, og 3) utvikle nødvendig fingerferdighet under håndtering av OHSC.
Egenskapene til OHSC
På grunn av uendret morfologi av neuronal celler og deres i vivo-som organisasjon, skiver kalles organotypic. OHSC består av stratum pyramidale og stratum granulosum, består av pyramideformet cornu ammonis (CA1, ca 2, CA3) og DG detaljert celler. Deler av hippocampus er svært organisert og afferente fiber anslagene avslutte i forskjellige lag i en ikke-overlappende måte. Efferences mellom entorhinal cortex (perforant veien), DG, CA3 og CA1 neurons forblir intakt etter utarbeidelse og oppføre seg funksjonelt lik de i vivo. Som tidligere vist, utvikling av dendrittiske trær, synapse dannelse og nettverket aktiviteter detaljert cellene i OHSC kan sammenlignes med akutt skiver fra tid matchet kontroller14,15,16.
Oligodendrocytes og astrocyttene har vært studert i OHSC av både lys og elektronmikroskop. Oligodendrocytes viser en organotypic romlige fordelingen, inkludert forskjellige morfologiske subtyper17,18. Axons bli også myelinated under de første to ukene i vitro. Noen forfattere postulerte at lag bestemt lokalisering av astrocyttene er fraværende i skive kulturer og tror at astrocyttene ikke oppnår en full modning i vitro. Fullt dette aspektet kan ikke besvares, siden bestemte markører for alle aktiveringstrinnene av astrocyttene mangler fortsatt1,19,20.
I de første 3 dagene etter utarbeidelse, microglial celler svare med migrasjon og spredning og akkumuleres på skive overflaten hvor de danner glial arret med astrocyttene. Alle celler synes å være i en svært-aktivert begrunne. Men i den indre lag av OHSC og mellom 3 og 6 div endre microglial celler deres amoeboid morfologi mot en ramified form, preget av liten mobilnettet organer og lenge forgrening fine cytoplasmatiske utstikkende deler utvidet i alle retninger21 ,22.
Lignende uttrykk og distribusjon av glutamat reseptorer er rapportert i voksen vev og OHSC2,23. Hyppigheten av synaptic strømninger, miniatyr synaptic strøm og hyppigheten av GABAergic strømmer i OHSC (7, 14 og 21 div) ikke er vesentlig forskjellig forhold til akutt forberedelser på postnatal dager 14 eller 15 henholdsvis. I kontrast, er hyppigheten av glutamatergic signaler høyere i OHSC enn i akutt skiver15.
Sammenligning av ulike forberedelse metoder
Utarbeidelse av embryonale og tidlig postnatal vev er ganske enkelt, på grunn av god celle overlevelse priser i vitro. Det anses at på dette tidlige stadium neuronal cellene er fortsatt migratory og aktive fører til tap av organotypic organisasjonen skiver1. Etter 7-9 postnatal dager, er noen synaptic tilkoblinger i rotter etablert. I de neste 2-3 uker i vitro moden synapser13. En av fordelene med presentert modellen er dens motstand mot mekanisk traume under utarbeidelse og dens høy plastisitet på grunn av alderen av dyr (7-9 dager)1,14,24. Det må nevnes at sektorene er svært følsomme for mekanisk manipulasjoner av instrumenter. Selv det galt innfallsvinkel av slicing kan forårsake skråning kutting av neuronal fiber ansvarlig for anterograd eller retrograd neuronal død. Utarbeidelse av skive kulturer fra voksen dyr for langsiktige formål er utfordrende og fortsatt ikke etablert. Slike OHSC viser en massiv degenerasjon etter utarbeidelse antagelig på grunn av tap av plastisitet1. Likevel er det et sterkt behov for en forberedelse metoden tillater for arbeid med voksen skiver.
For flere forberedelse metoder skiver fersk forbrukeravgift vev til en tykkelse på 300-400 µm, bruker et vev helikopter for å kutte isolert hippocampus. Denne rask metode kan ofte føre utbredt vevsskade. Kritiske faktorene for kvaliteten på OHSC er deres siste tykkelse og tiden de holdes i vitro. De beste resultatene med høyeste overlevelse er oppnådd for 300-400 µm tykke skiver. I tykkere skiver utarte de øvre lagene under kultur tid på grunn av diffusjon begrensninger1. Avhengig av de vitenskapelige spørsmålene, brukes OHSC enten direkte etter forberedelse eller flere dager i kultur. Derfor gjennom årene ble flere dyrking teknikker etablert som Berg-Tube teknikk1,13 eller statisk skive teknikker4.
Av ulike forberedelse metoder vi er overbevist om at ved hjelp av grensesnittet teknikken med en vibratome er mest nøyaktige og minst skadelige fremgangsmåten for å forberede OHSC hittil. Denne metoden er ytterligere forbedret ved hjelp av porøse membraner. OHSC holde 3D strukturen, bo morphologically og funksjonelt intakt i måneder og kan visuelt vurderes under dyrking periode25.
Programmer
OHSC kan tilberedes fra vill type og transgene dyr14,26. De overleve i måneder og gi muligheter for langsiktig eksperimenter12,13. OHSC brukes til å løse fysiologiske, farmakologiske, morfologiske og utviklingsmessige spørsmål14,27 under svært standardized forhold som kronisk bruk av neurotherapeutics eller stilk cellen terapi26,27,28. Etterforskningen av utviklingsmessige aspekter av neuronal tilkobling eller prosesser knyttet til synaptic overføring, synaptiske plastisitet, effekter av kronisk epilepsi dendrittiske spines pyramideformet celler, eller neurogenesis alle representere flere felt 29,30,31,32.
Glutamat, primære eksitatoriske nevrotransmitter og ionotropic glutamat reseptorer spille en sentral rolle i excitotoxicity. Excitotoxic lesjoner forekommer under nevrologiske sykdommer som slag, Alzheimers sykdom, HIV nevrotoksisitet, traumatisk hjerneskade og reparasjon mekanismer14,24. Anvendelse av glutamat reseptor agonister NMDA, α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) eller kainic syre OHSC etterlikner selektiv og regionen bestemt neuronal celle død26,28,33 ,34. Videre glial celle respons neuronal skade f.eks, microglial overføring og fagocytose i OHSC har tidligere blitt analysert3,35. Påvirkning av microglia under lesjonen kan forutsies av farmakologiske uttømming av disse cellene ved de bisfosfonat clodronate36.
En ytterligere viktige programmet oppstår mimicking i vivo betingelser for undersøkelser av svulst invasjon ved hjelp av OHSC. Spheroids dannet av glioma linjer var i stand til å invadere skive kulturer, et fenomen som var arter overlappende37. Diffus infiltrasjon mønster av cellelinjer brukes lignet de observerte mønster i vivo37. I tillegg primære glioblastom spheroids implantert i OHSC holdt sin invasjon potensielle og stamcelleforskningen tegn over flere dager i vitro38. Dermed lar modell observasjon av invasjonen mønstre og interaksjoner mellom neuronal vev og tumorceller som tilsvarer de observeres i vivo37,38. I forhold til kollagen eller gel synes baserte modeller (f.eks)39, bruk av OHSC mer gunstig for analyser på metastasering og tumor invasjonen i hjernen. Fysiologiske miljøet, inkludert neuronal og glial celletyper og ekstracellulær matrix, forblir intakt.
Videre OHSC kan studere direkte interaksjoner mellom enkelt kreftceller og hjernevev under kontrollerte forhold. For eksempel ble microglial celler funnet for å forbedre egenskapene til kreftceller angi hjernen ved å danne styrende strukturer for invasjonen35.
I tillegg kan effekten av midlertidig og permanent mobilnettet endringer på invasjonen prosesser analyseres. Et stabilt uttrykk for metastasering forbundet kolon kreft genet 1 (MACC1) i glioma celler ble assosiert med økt spredning og påfølgende invasjon40. Forbigående endring av cellen stivhet i glioblastom linjer ble direkte korrelert med invasiv egenskapene til den celle linjer41. OHSC og svulst celle co kulturer kan dermed potensielt brukes for narkotika testing, reproduksjon av kliniske observasjoner og modell og bilde svulst invasjonen under svært kontrollert og standardisert forhold.
Etter studier i primært cellekulturer, OHSC er det logiske neste valget for å utføre eksperimenter i et mer komplekst system omtrent i vivo betingelsene. Et annet område av interesse i hjernen skiver er screening av potensielle terapeutiske narkotika før testing i vivo. Hjernen skiver tillate overvåking og etterligne skader under observatør kontroll og uten dyr kirurgi. Opptil 8 OHSC kan fås og antall nødvendige dyr er betydelig redusert. Det er mulig å oppnå resultater i samme dyret under lignende innstillinger, men med forskjellige eller flere betingelser. Dermed er OHSC et kraftig verktøy for å observere blant andre morfologiske, mobilnettet, molekylær endringer under lesjon periode, utvikling av sekundær skade og svulst spredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Christine Auste for hennes støtte med video-opptak og Chalid Ghadban for hans utmerket kundestøtte. Urszula Grabiec ble støttet av Roux programmerbar FKZ 29/18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
- Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
- Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
- Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
- Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
- Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , BioValley Karger. Basel, Switzerland. (2005).
- Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
- Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
- Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
- Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
- Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
- Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
- He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
- Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
- Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
- Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
- Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
- Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
- Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
- Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
- Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ' unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
- Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).
