Summary
切片海馬スライス培養 (一部は、OHSC) は、体内の状況を非常によくシミュレートする生体外モデルを表します。ここで述べる vibratome ベース新規物質の神経電位または腫瘍細胞の生物学的挙動の評価で使用するための高品質のスライスを取得するためのプロトコルをスライスを改善します。
Abstract
切片海馬スライスの文化 (一部は、OHSC) でニューロンとグリア細胞の形態学的および機能的な特性がよく保存されています。このモデルは、神経保護に関する研究、神経細胞、神経回路、または浸潤に関する電気生理学的実験を伴う研究問い合わせへの対応に適しています。海馬のアーキテクチャと海馬回路における神経細胞の活動がよく保存されている一部は、OHSC、にもかかわらずスライス手順自体初期病変とグリア瘢痕の形成につながる。など、小さな分子の拡散挙動と機械的性質、瘢痕形成はおそらく変更します。スライスは、動物の外科手術、各種脳由来細胞、アストロ サイト、ミクログリア、神経生理学的および病理学的下すなわち間相互作用の脳損傷後の時間依存プロセスの監視を許可します。条件。このモデルの相反する側面血流および血液の免疫細胞の不在であります。神経障害の進行、中に血液が重要な役割を果たすから免疫細胞の移行。それらの細胞はスライスで行方不明、文化の本質的なプロセスが外部に干渉しないで観察可能性があります。また、一部は、OHSC 媒体外部環境の組成物は、正確に制御されます。このメソッドのさらなる利点は、標準製剤と比較して犠牲にされた動物の数が少ないです。いくつか一部は、OHSC は 1 頭の動物に複数の治療法を同時研究を可能 1 つの動物から入手できます。これらの理由の一部は、OHSC は組織の損傷後や腫瘍の侵入の間に新しい保護治療の効果を分析する適しています。
提示プロトコルの一部は、OHSC 再現性の高い生成することができます準備方法を記述するここで、神経保護や腫瘍浸潤の研究のような実験的研究のさまざまな使用することができますスライスをよく保存します。
Introduction
一部は、OHSC 神経細胞、アストロ サイト、ミクログリア1の生理学的および病理学的性質の研究によ特徴付けられた生体外モデルであります。細胞外の環境をコントロールし、様々 な刺激の後細胞と形態学的変化を監視する簡単です。後準備2,3海馬ニューロンの組織とその接続がよく保存されています。いくつかの利点の一部は、OHSC は、動物の外科手術することがなく脳損傷およびがんの浸潤の監視を許可します。一部は、OHSC 6 〜 8 は、単一の齧歯動物の脳から入手できます。一部は、OHSC したがって大幅動物の数を減らすし、同じ動物では複数の薬物濃度、遺伝子操作または異なる病変モデルをテストできるようにするのに役立ちます。スライス ベースのアッセイでは、実験条件を正確に制御できます。また、二次被害のような病理学の条件の時間依存の開発はタイムラプス イメージングによる簡単に監視できます。
Stoppiniらによって最初に確立された特定のプロトコルに4、準備手順が記載されている、適切なスライスの選択の重要な形態学的なランドマークが強調表示されます。生後 7-9 ラットやマウス生後 4-5 の準備をお勧めします。これらの期間は、一部は、OHSC は、機械的外傷、神経回路の再編成の可能性が高い堅牢な抵抗性を示します。対照的に、萌芽期または成人ラットから準備急速に構造変更し栽培中の脊髄の形態を失う、したがって基礎研究5,6で長期的なプロセスを学ぶには適して,7,8,9,10,11. 一部は、OHSC の生存率のもう一つの重要なポイントは、拡散およびこうして栄養供給が限られた12,13,14スライス自体の厚さ。
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Protocol
によってヨーロッパ コミュニティ評議会指令 2010年/63/EU 欧州議会を承認済みとして倫理ポリシーおよび神経科学研究の動物の使用に関する方針に従って動物実験を行ったと科学的な目的に使用される動物の保護に関する欧州連合理事会の
。1 器具文化メディア準備
- の一部は、OHSC 準備のため楽器の次のセットを使用して、: 2 つの小さなはさみ、2 つピンセット、繊細なティップを持つ 1 つのピンセット (サイズ 11、15 のサイズの 1 つの 2 つ)、3 つのブレード。3 メス ホルダー、ラウンド フィルター ペーパー (直径: 35 mm)、寒天、1 つのかみそりの刃、パスツール ピペット、未変更の状態の 1 つであり、1 つ変更パスツール ピペット チップなし。( 図 1) 使用前にオートクレーブのすべての材料を滅菌します 。
- 寒天 5 g の重量を量るし、100 ml の蒸留水に溶かします。滅菌オートクレーブ 210.8 kPa 121.7 ° C で 20 分のためのソリューション。滅菌ガラス ピペットを使用して 60 mm ペトリ皿で 3 mL 液体寒天液を配布、5 h を固めるは、汚染を避けるため、さらに使用するまで 4 ° C で保存しプラスチック パラフィン フィルムでカバーすること。寒天ブロックがスライスのプロシージャの間に脳を安定させるために必要な 。
- メディア
- 準備中 (pH 7.35)、200 mL で 198 mL 最小必須培地 (MEM)、2 mL L グルタミン ソリューション (最終濃度 2 mM)。メディアの準備の日にソリューションを準備し、4 で保存 ° C
- 準備 49 mL MEM、25 mL ・ ハンクスから成る培養液 100 mL ' バランスのとれた塩溶液 (HBSS)、25 mL (v/v) 通常の馬血清 (NHS)、L-グルタミンの解決の 1 mL (最終濃度 2 mM)、100 μ g インスリン、血糖値 120 mg 10 mg ストレプトマイシン、10,000 U ペニシリンと 800 μ g ビタミン C 既に報告されています。ミディアム (37 ° C) を暖かい、pH 7.4 で滅菌フィルター (0.2 μ m 孔サイズ) に pH 値を調整します。媒体を変更する前にすべての 2 日目 (ウォーミング アップ、pH 調整等) 手順を繰り返します。1 週間で最もメディアを使用 4 で保存する場合 ° C
- 脳を格納する準備の中で 1 つの 35 mm のペトリ皿を埋めます。作業領域の冷却パックに組織を収集するため 2 空のシャーレを配置します 。
2。準備と、Vibratome とスライス
- 使用脳 7-9 日古いラットからまたは 4-5 日 Stoppini ら によると一部は、OHSC 準備のため古いマウスします 。4 動物の斬首後、は、はさみで、頭蓋骨から皮膚を削除する。 。
- は後頭に導入して高級シザーの刃と尾側吻側 (奥) (フロント) 軸に沿って切断して頭蓋骨を開きます。2 つ作るは、それぞれ左と右耳に向かってハサミを指すので、最初の 1 つに垂直をカット (" T 切開 ").
- は、脳を傷つけないように注意を払って、高級ピンセットで慎重に頭蓋骨を開きます。前頭葉と小脳の最も吻側部をカットするメス (ブレード サイズ 11) を使用します 。
- はヘラの手段で脳を削除し、準備中 ( 図 2) でいっぱいペトリ皿に慎重に配置します。試料ホルダーに脳を置き、医療シアノアクリ レート系接着剤で固定します。機械的な安定を確保するために、寒天の部分を使用します 。
- 350 μ m で水平方向に組織を解剖スライド式 vibratome を使用して厚い一部は、OHSC 。
- は、光学双眼顕微鏡を使用してスライスを評価します。低品質の一部は、OHSC をすぐに破棄します。海馬の中央部から分離されたそのままの細胞構築とそれらのスライスのみを取ることが重要です (図 3 および図 4 を参照)、背側と腹側海馬と 。
- 別の海馬領域と (丸刃サイズ 15; メスによる嗅 図 3)。貫通経路と嗅皮質を保持する必要があります 。
- 一部は、OHSC 6 ~ 8 はそれぞれの脳から取得されます。2-3 スライスを 1 つのセルの文化挿入 (細孔サイズ 0.4 μ m) に転送し、ウェルあたり 1 mL の培養液を含む 6 ウェル培養皿の 1 つもです 。
- 5% (v/v) CO 2 と完全に加湿雰囲気で 35 ° C で 6 よく料理を孵化させなさい、細胞培養培地は 2 番目毎日変更します
。 注: は、6 日 体外 (div) にあなたの実験を行います。6 日目でスライスのプロシージャに関連付けられている炎症反応が消えてしまいます。再びミクログリア細胞の表示区分された形態をこの段階で、シナプスが成熟している 。
3。組織品質の評価
- 固定、ラベリングと可視化の一部は、OHSC 変性ニューロン
- 実験を実行した後で 5 μ G/ml propidium ヨウ化 (PI)、固定する前に 2 時間、一部は、OHSC を孵化させなさい。変性神経細胞の核を染色する順序
。 注意: PI は疑わしい発癌物質、常に手袋などの個人保護用具 (PPE) を着用します 。
- 0.1 M リン酸緩衝液 (7.4) と、一部は、OHSC を洗う、パラホルムアルデヒド (PFA) 24 時間のための 4% (v/v) 溶液で固定
注意: PFA は有害と疑われる発がん性物質です。ヒューム フードの下で動作し、PPE を着用します 。
- 1 ml の PBS の挿入で、一部は、OHSC を洗うし、リガー ブラシを使用して、スライスを細胞膜から分離します 。
- 染付 IB 4 24 ウェル プレート ( 図 5) で、一部は、OHSC のラベルします 。
- 実験を実行した後で 5 μ G/ml propidium ヨウ化 (PI)、固定する前に 2 時間、一部は、OHSC を孵化させなさい。変性神経細胞の核を染色する順序
- 蛍光を用いた腫瘍侵入実験の伝導標識単一細胞
- の実験開始前に 24 h 蛍光色素 Carboxyfluorescein アセテート染色による腫瘍細胞にラベルを付けるエステル (CFDA SE).
- デタッチ ノイバウアー チャンバーを用いた腫瘍細胞を数えると 。
- 懸濁液の 10 μ L が目的のセル数 (通常 50,000 または 100,000 細胞) を含むような培地で細胞を再懸濁します 。
- 3 日間侵入する細胞ができ、スライス培養に細胞懸濁液の 10 μ L を適用します 。
- 実験の最後に、4% (v/v) PFA、24 時間を使用してスライス培養を修正し、細胞構築を可視化する別の 24 h の PI と共培養のラベルします
。 注意: PFA は有害と疑われる発がん性物質です。ヒューム フードの下で動作し、PPE を着用します 。
- メディアをマウントを使用してさらに分析のカバー スリップの上に共培養をマウントします 。
4。一部は、OHSC 実験の評価
共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) で、一部は、OHSC を分析します。円周率の検出ラベル、ニューロンの変性または細胞構築をラベル PI 使用波長 λ の単色光 = 543 nm、発光帯の波長 λ のためのフィルターを渡す = 585 615 nm。腫瘍細胞または IB 4 ミクログリアというラベルの付いた、CFDA、励起波長 λ を使用して = 488 nm。両方の実験の種類は、2 μ m の光学的スライス厚と z スタックを記録し、評価に使用します
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Representative Results
神経保護の研究:神経損傷、PI 肯定的な核と IB4 (DG) 歯状回の顆粒細胞層 (GCL) のすべての 3 番目の光学セクションにおけるミクログリアに数えられた正の数を確認します。腫瘍の侵入実験のためスタックの最大強度 z 投影は侵略と異なる侵入パターン (図 6) を視覚化する手段として腫瘍細胞によって覆われる領域を計算するため使用されました。
未処理のコントロールの一部は、OHSC (CTL) ニューロンに色濃く残った。DG の GCL のほとんどない PI 肯定的な神経核 (図 5 a) が観察された.分子層におけるミクログリア細胞の大半が分岐しました。DG、のみの GCL の非常に少数の IB4陽性ミクログリア細胞 (図 5 a) が検出されました。50 μ M N メチル D アスパラギン酸 (NMDA) 強いと孵化後 PI 肯定的な神経核 (図 5 b) の数が増えるし、制御の一部は、OHSC と比較した場合、IB4陽性ミクログリア細胞 (図 5 b) が検出されました。低品質の事前破損した一部は、OHSC は高いミトイル PI 制御条件下で DG (図 5) で陽性細胞数で識別できます。DG 細胞構築と肺門と CA3 領域 (図 5) に広がっている PI 正死細胞数が非常に高い破壊をもたらした NMDA とスライスを予損傷を治療します。
腫瘍浸潤の研究:スライスを施した 2 つの神経膠芽腫細胞株 U138 50,000 細胞 (図 6 a) と LN229 (図 6 b) の 3 日間。どちらの場合もスライス培養の細胞構築をそのまま残ったし、コルニュ ammonis、DG は残され。さらに、両方の細胞の侵入挙動を示した線。U138 セルは、ラウンドは、明らかに異なる腫瘍 (図 6 a) を形作った、LN229 細胞スフェロイド単一腫瘍内腫瘍ネットワークを構築、多かったを区別するは難しかった。U138 細胞と比較してのスライス培養における腫瘍塊の量を見ると、LN229 細胞の高い侵襲性の内容が見つかりました。
図 1: 解剖用具および材料。スライス培養の準備、一連の適切な解剖用具および材料が必要のようです。小さい刃を交換可能な 1 つへら、2 つ高級はさみ、3 つの鉗子、1 つ通常パスツール ピペット、ヒントなしの 1 つのパスツール ピペット、寒天、ペトリ皿、ろ紙、冷却パック、準備中、医療の 3 つのメスが含まれますシアノアクリ レート系接着剤。解剖ツール使用前にオートクレーブ養生する必要があり、滅菌雰囲気の中でそれを保つためにプラスチック パッケージに配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ラット脳海馬の位置。黒の点線で示すように、海馬、大脳皮質と視床に囲まれた二国間構造です。側脳室の一時的なホーンに海馬の膨らみ。海馬はコルニュ ammonis (適切な海馬) と歯状回 (または歯状の筋膜)、1 つ薄板重ねから成る、bilaminar 他。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 可視化ラットの一部は、OHSC 。一部は、OHSC を含む全脳スライスは組織の品質を評価するために双眼鏡で可視化しました。スライスは、冷却準備中 (A, B) でいっぱいペトリ皿に保持されます。脳スライスの拡大します。そのまま海馬 (HC) と嗅 (C) 画像の左右に表示されます。一部は、OHSC は、脳の残りの部分から分離されています。DG、CA1、CA3, 肺門領域 (HI) 内嗅野 (EC) と分子層 (ML) ・ コルニュ ammonis サブフィールドの顆粒細胞層 (GCL) は、明確に区別できる (D) です。C, D: スケール バー = 4 mm。
図 4: 経時的変化の一部は、OHSC。
直接、準備の後に、グリア瘢痕を形成するミクログリアやアストロ サイトが開始します。1-3 日の in vitro (div) 神経膠症および浮腫形成が観察されます。海馬と DG の階層は表示されなくなります。細胞レベルで 5 部の一部は、OHSC は活性化細胞の数の減少を表示します。6 div でほとんどない浮腫が存在、スライスは薄く、および組み込みの神経回路に含まれるエリアが生存しています。一部は、OHSC は、実験のための今すぐ使用ことができます。スケール バー = 1 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 共焦点レーザー顕微鏡による組織品質評価します。共焦点レーザー顕微鏡によって明らかにされた良い神経保存は無処置のコントロールの一部は、OHSC (CTL) で観察されます。事実上ない PI 肯定的な神経核 (赤) とだけいくつか IB4陽性ミクログリア細胞 (緑) は、(A) DG の顆粒細胞層 (GCL) で発見されます。無処置一部は、OHSC と対照をなして PI と IB4陽性細胞の数の強い増加は GCL の一部は、OHSC NMDA を破壊 (B) に表示されます。DG、活性化ミクログリア細胞と多数 PI 事前破損した一部は、OHSC (C, D) で肯定的な核の形態に注意してください。バー = 50 μ M.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: CLSM で浸潤の可視化します。PI (赤) の固定ラベルの後の一部は、OHSC 研究中適用 CFDA (緑) でスライスを侵略して腫瘍細胞を示しています。U138 細胞浸潤過程を視覚化して、侵入時間の 3 日後。単一の腫瘍回転楕円体明確に区別できる (A) はします。対照的に、神経膠芽腫細胞株 LN229 は腫瘍ネットワーク (B) を形成しました。バー = 400 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この議定書では、一部は、OHSC の準備について説明します。このモデルは、組み込み機能と脳の反応の生理学的および病理学的刺激の適用後テストできます。ほかに電気生理学的パラメーターの解析では、一部は、OHSC は破壊することができます、あらゆる細胞に損傷の影響を決定できます。さまざまな物質と示したプロセスやマクロファージとリンパ球の不在で癒しの詳細な説明と治療が可能です。
The most 成功の準備と培養が重要なステップ: 1) 無菌条件下での作業、2) メディアの準備、正しく温度と pH を考慮した、3) の一部は、OHSC 処理中に必要な手先の器用さを開発します。
一部は、OHSC の特性
神経細胞の不変の形態のための体内の組織のようなスライス切片と呼びます。一部は、OHSC は錐体・ コルニュ ammonis (CA2、CA1、CA3) と DG 顆粒細胞から成る地層属三角骨と地層顆粒から成っています。海馬の部分に並べ高と求心性線維の投射は非重複の方法で異なる層で終了します。内嗅野 (貫通通路)、DG、間 efferences CA1、CA3 ニューロン準備の後そのままで、これらの生体内と同様に動作します。先ほど、樹状の開発の一部は、OHSC 顆粒細胞のシナプス形成とネットワーク活動が一致するコントロール14,15,16から得られた急性スライスに匹敵します。
アストロ サイト、オリゴデンドロ サイトは、光と電子顕微鏡の一部は、OHSC 研究されている.オリゴデンドロ サイトは、形態学的サブタイプが異なる17,18を含む切片空間分布を表示します。また、軸索は最初の 2 週間の培養中に有髄になります。何人かの著者は、アストロ サイトのレイヤーの特定のローカリゼーションである仮定されるスライスの文化には存在しないし、成熟培養アストロ サイトに到達しないことを信じる。この側面はアストロ サイトのすべてのライセンス認証の手順の特定のマーカーはまだ1,19,20を欠けているので完全に答えられることはできません。
準備の後の最初の 3 日、ミクログリア細胞の移行と増殖に対応し、アストロ サイトとともにグリア瘢痕を形成するスライス表面に蓄積します。すべてのセルは、高活性化状態にあるようです。ただし、内側の層の一部は、OHSC と 3 と 6 の div の間、ミクログリア細胞に小さな細胞体と長い分岐細胞質突起21 すべての方向に拡張によって特徴付けられる区分されたフォームの方のアメーバの形態を変化します。 ,22。
グルタミン酸受容体の分布と同様の発現は、成体組織の一部は、OHSC2,23報告されています。シナプス電流、ミニチュア性シナプス電流と gaba 作動性電流の一部は、OHSC (7, 14, 21 div)、それぞれ生後 14 か 15 に急性の準備に比較して大幅に異なる回数の頻度。対照的に、グルタミン酸信号の周波数は急性スライス15の一部は、OHSC よりも高いです。
異なった作製法の比較
ために良い細胞生存率体外胚および早期の生後組織の準備は非常に簡単です。この初期段階では、神経細胞がまだ渡り鳥や脊髄組織スライス1の損失につながるアクティブと見なします。7-9 生後日後ラットのいくつかのシナプスの接続が確立されます。体外次 2 〜 3 週間の間にシナプス成熟13です。提示されたモデルの利点の 1 つは、準備をし、その高い可塑性動物 (7-9 日)1,14,24の年齢のために機械的外傷への抵抗です。それする必要があります言及するスライスは機械操作に非常に敏感楽器によって。スライスの間違った角度も前向性や逆行性神経崩壊の責任神経繊維の傾斜切断があります。長期的な目的のための大人動物からスライス培養の準備は挑戦的で、まだ確立されていません。このような一部は、OHSC 可塑性1の損失のためにおそらく調製後まもなく大規模な変性を示します。それにもかかわらず、ある強い大人のスライス作業を可能にする製法のため必要があります。
いくつかの準備方法のため新鮮な摘出組織を分離海馬をカットする組織チョッパーを使用して 300 400 μ m の厚さにスライスします。この簡易メソッドは広範な組織の損傷でよくあります。一部は、OHSC の品質にとって重要な要素は、最終的な厚さと体外に保持されている時間。300-400 μ m の厚さのスライスの最も高い生存率で最高の結果を実現しています。厚いスライスで上位層は拡散の制限1のための培養時間の間に退化します。科学的な質問によっては、一部は、OHSC は、準備の後に直接、または文化で、数日後に使用されます。したがって、長年にわたっていくつかの栽培技術確立された、ローラ チューブ技術1,13または静的スライス技術4のような。
作製法の違いから我々 は一緒に、vibratome インターフェイス技術を使用して日付の一部は、OHSC を準備の最も正確な少なくとも有害な処理であることを確信しています。このメソッドは、多孔質膜を使用して、さらに改善します。一部は、OHSC に 3次元構造を保つ、ヶ月、形態学的、機能的にそのまま滞在、栽培期間25時に視覚的に評価することができます。
アプリケーション
一部は、OHSC は野生型およびトランスジェニック動物14,26から用意できます。彼らはヶ月生き残るし、長期実験12,13のオプションを提供します。一部は、OHSC が生理学的、薬理学的、形態学的、発達質問14,27下のアドレスに使用される高い標準的な化された神経または幹細胞療法26,27,28の慢性的なアプリケーション等に。神経接続またはプロセスの発達的側面の検討に関連するシナプス伝達、シナプス可塑性、錐体細胞の樹状突起スパインの慢性てんかんの影響や神経新生のすべてを表す追加のフィールド29,30,31,32。
グルタミン酸、主要な興奮性神経伝達物質、グルタミン酸は、応需型で中心的な役割を再生します。顎の病変は、脳卒中、アルツハイマー病、HIV 神経毒性、外傷性脳損傷と修復機構14,24のような神経学的な病気の間に発生します。選択の一部は、OHSC 模倣し地域特定の神経細胞死26,28,33 カイニン酸や α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic 酸 (AMPA) NMDA グルタミン酸受容体アゴニストのアプリケーション ,34。さらに、神経細胞傷害を例えばミクログリアの移行、一部は、OHSC 貪食するグリア細胞応答解析3,35されていた。ビスフォスフォネート局所36によってこれらの細胞の薬理学的枯渇によって病変中にミクログリアの影響を予測できます。
それ以上の重要な適用浸潤の一部は、OHSC を使用しての調査のためのものまね体内の条件が発生します。神経膠腫細胞株によって形成された回転楕円体重複37種であった現象、スライス培養に侵入が可能であった。使用細胞のびまん性浸潤パターンは、生体内で観察されたパターン37を似ています。さらに、膠芽腫の回転楕円体の一部は、OHSC 注入続けた彼らの侵略が潜在的な幹細胞の in vitroいくつか日38上の文字します。したがって、モデルは侵略パターンと神経組織と生体内で37,38を観察に対応している腫瘍細胞間の相互作用の観測を使用できます。コラーゲンやジェルと比較してベース モデル (は例えば)39, 一部は、OHSC の使用は脳の転移およびがんの浸潤の解析より有益です。神経細胞およびグリア細胞の種類、細胞外マトリックスを含む生理学的な環境はそのまま残ります。
また、一部は、OHSC は単一の腫瘍細胞と制御された条件の下の脳組織と直接相互作用を勉強できます。たとえば、侵略35の基本構造を形成することにより、脳を入力する腫瘍細胞の機能を強化するミクログリア細胞が見つかりました。
さらに、侵入過程の一時的および永久的な細胞変化の効果を分析できます。伴う転移大腸癌遺伝子 1 (MACC1) 神経膠腫細胞の安定した表現は、増殖の亢進とそれに続く侵入40と関連付けられました。神経膠芽腫細胞株における細胞の剛性の過渡変化直接セル行41の侵襲的な特性と相関を示した。一部は、OHSC と腫瘍細胞の共培養は、したがっては薬物検査、臨床的観察とモデルと画像の腫瘍浸潤制御と標準化された条件下での複製に使用可能性のあるできます。
一次電池文化の研究、一部は、OHSC が生体内で条件を近似するより複雑なシステムの実験を実行するための論理の次の選択。脳スライスの興味の別のフィールドは、 in vivoをテストする前に潜在的な治療薬のスクリーニングです。脳スライス許可を監視し、傷害オブザーバー制御の下で、動物の外科手術なしの模倣します。8 一部は、OHSC までを得ることができる、必要な動物の数を大幅に削減します。同じ動物同様の設定が異なる、または複数の条件の結果を取得することが可能です。したがって、一部は、OHSC、他の中で病変期間、二次被害と腫瘍の広がりの開発中に、細胞形態学的、分子の変化を観察する強力なツールです。
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Disclosures
著者がある何も開示するには
Acknowledgments
著者は、優れた技術的な援助のためのビデオ録画とハリッド Ghadban 彼女を扶養するクリスティン Auste を感謝したいです。ウルシュラ Grabiec は、ルーの Programm FKZ 29/18 によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
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