Summary
이 프로토콜은 생체 재료를 사용하지 않고 심장 조직의 3D bioprinting을 설명합니다. 3D bioprinted 심장 패치는 구성 요소 spheroids의 기계적 통합을 나타내며 심장 조직 재생 및 심장병의 3D 모델로서 매우 유망합니다.
Abstract
이 프로토콜은 세포만을 사용하여 생체 재료를 사용하지 않고 심장 조직의 3D 생체 인쇄를 설명합니다. Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아 세포를 먼저 분리하고, 원하는 세포 비율로 세고 혼합합니다. 그들은 초저 부착 96- 웰 플레이트에서 개별 웰에서 공동 배양됩니다. 3 일 이내에, 회전 타원체 형태가됩니다. 이 회전 타원체는 진공 흡인을 사용하여 노즐로 집어 들고 3D 바이오 프린터를 사용하여 니들 어레이에 조립됩니다. 회전 타원체는 바늘 어레이에서 융합됩니다. 3 차원 바이오 프린팅한지 3 일 후, 스페 로이드는 손상되지 않은 채로 제거되어 이미 자발적으로 박동하고 있습니다. 3D bioprinted 심장 패치는 구성 요소 spheroids의 기계적 통합을 나타내며 심장 조직 재생 및 심장병의 3D 모델로서 매우 유망합니다.
Introduction
3D bioprinting 1 , 2 , 3 에는 여러 가지 방법이 있습니다. 3D 바이오 프린팅은 잉크젯 바이오 프린팅, 마이크로 압출 바이오 프린팅, 레이저 보조 바이오 프린팅, 방법 조합 또는 새로운 접근법과 같은 예를 사용하여 인쇄 기술 1로 분류됩니다. 3D bioprinting은 scaffold-free 또는 scaffold-dependent 방법으로 분류 할 수 있습니다 4 . 3D bioprinting의 대부분의 방법은 scaffold에 의존합니다. 여기에는 bioinks 5 또는 scaffolds 6 과 같은 생체 재료가 필요합니다. 그러나 발판 의존적 인 3D 바이오 프린팅은 스캐 폴딩 재료의 면역 원성, 독점적 바이오 인크의 비용, 분해 속도가 느린 독성 및 분해 제품의 독성과 같은 많은 문제점과 한계에 직면합니다.
Scafspheroids를 사용하는 fold-free cardiac tissue engineering이 시도되고 있으며, 스캐 폴드 의존 조직 공학의 단점을 극복 할 수있는 가능성이있다. 그러나이 논문의 저자들에 의해 인정 된 것처럼, 생물 공정의 과정에서 고정 된 위치에서 회전 타원체를 견고하게 다루고 위치시키는 것은 어려웠다. 3D bioprinting과 회전 타원체 기반 조직 공학을 함께 사용하면 이러한 어려움을 극복 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 다른 생체 물질을 사용하지 않고 심장 조직의 3D 생체 프린팅을 설명합니다. 단, 회전 타원체 형태의 세포 만 사용하십시오.
스캐 폴드가 필요없는 회전 타원체 기반의 3D 생체 인식 장치 9 는 진공 흡입을 사용하여 개별 회전 타원체를 집어 들고 바늘 배열에 배치 할 수 있습니다. 3D bioprinting에서 바늘 어레이에 회전 타원체를 배치하는 개념은 고대 Japa에서 바늘 배열 ( " kenzan "으로 알려짐)의 사용에서 영감을 얻었습니다.꽃꽂이 , 꽃꽂이의 예술 . 이 시스템은 회전 타원체를 어떤 구성으로도 정확하게 위치시킬 수 있으며 짧은 시간에 개별 회전 타원체가 융합되어 3D 생체 조직을 생성합니다. 따라서이 방법은 회전 타원체를 쉽게 조작 할 수있게 해주 며, 미래의 발판없는 기관 생물 공학에 잠재적 인 영향을 미친다.
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Protocol
1. 심근 세포의 제조
- 생성 및 인간이 유도 한 pluripotent 줄기 세포 (hiPSCs) 10 설명대로 기저막 매트릭스로 코팅 6 잘 접시에.
- 이전에 설명한 방법 11 , 12를 사용하여 hiPSCs를 hiPSC 유래 cardiomyocytes (hiPSC - CMs)로 구분하십시오.
- 분화 후 19 일에, 실온에서 5 분 동안 각 웰에서 0.05 % 트립신 / EDTA 2 mL를 사용하여 심근 세포를 분리한다.
- 세포 해리를 관찰하기 위해 광학 현미경으로 cardiomyocytes를 모니터링합니다.
- 트립신 억제제 0.0125 % 2 mL를 사용하여 트립신을 중화시킨다.
- 분리 된 cardiomyocytes를 풀어 동력 된 피펫 필러를 사용하여 하나의 50 ML 원뿔 튜브로 전송하십시오.
- 펠렛을 얻기 위해 실온에서 250 xg로 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리하십시오.
- Roswell Park 5 mL에 펠렛을 ResuspendB-27 (RPMI / B-27 세포 배지)가 보충 된 Memorial Institute (RPMI) 세포 배지.
- 세포 배지에 세포 20 μL를 피펫과 0.4 % Trypan 블루 솔루션의 동등한 금액으로 얼룩.
- 자동화 된 세포 카운터 또는 수동 hemocytometer를 사용하여 세포 현탁액의 농도와 세포 생존력을 세고 얻습니다.
2. 섬유 아세포의 제조
- 인간의 심장 섬유 아세포 (HCF) (성인 심실 유형) 세포주를 시작하십시오 13 .
- HCF 배양 프로토콜 13 에 따라 항체를 분리한다.
- 세포 배지에 20 μL의 세포를 피펫 팅하고 같은 양의 Trypan Blue 용액 0.4 %로 염색합니다.
- 자동 세포 카운터 또는 수동 hemocytometer를 사용하여 새로운 세포 현탁액의 농도와 세포 생존력을 세고 얻습니다.
3. 내피 세포의 제조
- 인간 umb을 시작하십시오.15. 설명 된대로 정맥 내피 세포 (HUVEC) 라인. HUVEC 배양 규약에 따라 항체를 분리하고 분리한다.
- 세포 배지에 세포 20 μL를 피펫과 0.4 % Trypan 블루 솔루션의 동등한 금액으로 얼룩.
- 자동화 된 세포 카운터 또는 수동 hemocytometer를 사용하여 세포 현탁액의 농도와 세포 생존력을 세고 얻습니다.
4. 공동 배양 :
- RPMI / B - 27 세포 배지에서 3 가지 세포 유형 (hiPSC - CM, HCF 및 HUVEC)을 혼합하여 50 ML 원뿔 튜브에 혼합 세포 솔루션의 재고를 생성, hiPSC - CM : HCF : HUVEC 세포 비율 70:15:15 및 mL 당 165,000 세포의 농도.
- 혼합 채널 솔루션을 다중 채널 피펫을 사용하여 웰 당 200 μL 또는 웰 당 33,000 세포의 초저 애착 96- 웰 U- 바닥 플레이트에 분배하십시오.
- 96 웰 플레이트를 3 일 동안 배양하고 (37 ℃, 5 %의 탄소 다이옥사이드습도 95 %).
- 광학 현미경으로 각 웰의 가운데와 바닥에 혼합 된 세포 다세포 회전 타원체가 있는지 검사합니다.
참고 : 2 차원 현미경 투영에서 이러한 회전 타원체는 원형 모양으로 나타납니다 ( 그림 1 ). Spheroids는 초저 부착 96- 웰 플레이트에 세포를 접종 한 후 24 시간 이내에 형성되어야합니다. 회전 타원체는 96- 웰 플레이트에 세포를 접종 한 후 48 시간 이내에 박동하기 시작해야합니다. 박동하지 않는 회전 타원체는 최종 3D 생체 보정 패치가 작동 할 수 있도록 3D 생체 인쇄에 사용하면 안됩니다. 연결 인자 43 (Cx43) 및 트로포 닌에 대한 회전 타원체의 면역 형광법을 사용하여 회전 타원체 세포 조성 및 품질을 평가할 수 있습니다 15 .
5. 스캐 폴드가없는 심장 조직의 3D Bioprinting
- 회전 타원체 기반의 3D 바이오 프 린터의 잡지에 회전 타원체가 들어있는 플레이트를 넣으십시오.
- 3D bioprinter를 켜고 3D bioprinting 소프트웨어를 실행하십시오.
- "Auxillary", "Operation Preparation", "Inspect Mode"그리고 "Home Return"을 클릭하십시오.
- "시작"아래의 초록색 아이콘을 클릭하여 회전 타원체 검사를 시작하십시오.
- 화면의 "(2) Dia (μm)"란에 회전 타원체 직경이 표시되는지 확인합니다.
- 평균 회전 타원체 직경을 가장 가까운 100 μm로 추정하려면 "초기 설정"을 클릭하고 Stack Z 피치 (μm)에 평균 회전 타원체 직경을 입력하십시오.
- "합계"를 클릭하면 "레이어"아래의 숫자가 자동으로 재조정됩니다. "적용"을 클릭하여 설정을 확인하십시오.
- "Needle Array Map"을 클릭하고 "Layer No."로 이동하여 3D Bioprinting을위한 원하는 레이어를 선택하고 개별 회전 타원체 위치를 선택하여 화면 왼쪽의 맵에 원하는 3D 생체 설계를 그립니다. 진부한k "적용"을 클릭하여 3D Bioprinting 디자인을 확인하십시오.
- Needle Array 검사를 시작하려면 "Needle Array Check"를 클릭하십시오. 바늘 배열에 초점이 맞지 않으면 0 ~ 500 μm 범위의 값을 "OffsetZ (μm)"에 입력하여 500 μm에서 시작하여 100 μm에서 0 μm까지 줄여서 카메라 초점을 조정합니다.
- "Inspection Parameters", "Type 1"을 클릭하고 "직경 (μm)"을 원하는 직경 범위로 설정하십시오. "진원도 (%)"및 "매끄러움 (%)"을 원하는 백분율로 설정하십시오. "적용"을 클릭하여 설정을 확인하십시오.
참고 : 여기 회전 타원체 직경은 450 μm에서 550 μm로 설정되었습니다. "진원도 (%)"및 "부드러움 (%)"은 각 회전 타원체에 대한 컴퓨터 계산 평가입니다. 여기서 "진원도 (%)"에 사용 된 설정은 60 %이고 "매끄러움 (%)"은 70 %입니다. - "Presence"를 클릭하고 "Diameter (μm)"를 동일한 설정으로 업데이트하십시오s를 선택하십시오. "적용"을 클릭하여 설정을 확인하십시오.
- "Stack Mode"를 클릭 한 다음 "Start"아래의 초록색 아이콘을 클릭하면 진공 흡입 및 3D 바늘 어레이의 특정 위치에 회전 타원체를 배치하여 3D 바이오 프린터의 노즐을 사용하여 회전 타원체 픽업을 시작할 수 있습니다.
참고 : 81 개의 회전 타원체 (9 개의 회전 타원체와 9 개의 회전 타원체)로 구성된 심장 패치의 경우 3D 바이오 프린팅은 약 20 ~ 30 분이 소요됩니다. - bioprinting 후, 무균 포셉을 사용하여 3D bioprinted 패치가 들어있는 바늘 어레이를 들고 RPMI / B-27 세포 배지 150 mL가 들어있는 250 mL 멸균 비이커로 옮깁니다.
- 3 일 (37 ° C, 5 % 이산화탄소, 95 % 습도) 동안 바늘 어레이와 3D bioprinted 패치를 품어.
6. 바늘 어레이 및 패치 성숙에서 3D Bioprinted 패치 제거
- 배양 3 일 후, 바늘 어레이의베이스에서 한 손으로 다른 손으로 t 아래 플라스틱 커버에서 다른 손그는 바늘 어레이에서 3D 바이오 프린팅 된 패치를 제거하기 위해 플라스틱 커버를 위로 가볍게 밉니다.
참고 : 필요에 따라 인산염 완충 식염수 (PBS)를 사용한 윤활제를이 단계 직전에 바늘에 적용하여 부드럽고 쉽게 제거 할 수 있습니다. - 한 쌍의 무균 포셉을 사용하여 3D bioprinted patch가있는 플라스틱 덮개를 들어 올려 RPMI / B-27 세포 배지가 들어있는 35mm 접시에 패치와 플라스틱 덮개를 옮깁니다.
- 핀셋을 플라스틱 커버에 붙이고 RPMI / B-27 셀 미디어에있는 패치로 플라스틱 커버를 부드럽게 흔들어서 패치를 매체에 풀어 놓습니다.
- 광학 현미경으로 3D bioprinted 패치를 검사하여 3D bioprinted 패치가 작동하는지 확인하십시오.
- 3 일 이상 (37 ° C, 5 % 이산화탄소, 95 % 습도) 35mm 접시에 3D bioprinted 패치를 품어 놓습니다.
참고 : 3 일 후, 회전 타원체가 함께 융합되고 구멍이바늘이 있던 패치는 더 이상 보이지 않아야합니다.
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Representative Results
4.4 단계 (공동 배양)가 끝나면 각 웰의 세포는 초저 부착 96-well U-bottom plate의 바닥에 응집되어 중력에 의해 회전 타원체가 형성됩니다. 이러한 회전 타원체는 hiPSC-CM, HCF 및 HUVEC를 포함하며 광학 현미경으로 육안 검사가 가능하며 2 차원 투영으로 원형으로 나타나야합니다 ( 그림 1 ). 6.3 단계의 끝에서, 3D 생체 보정 심장 패치는 바늘 어레이 ( 그림 2 , 왼쪽)에 의해 생성 된 바늘 구멍 때문에 조직 공극을 포함해야합니다. 이 시점에서, 회전 타원체 사이의 경계는 불분명 해져야하고, 패치는 회전 타원체의 기계적 통합을 보여주는 자발적으로 치닫기 시작해야합니다. 단계 6.5가 끝나면 조직 공극은 주변 조직 ( 그림 2 , 오른쪽)에 의해 채워 져야하고 3D 생체 보정 심장 패치는 계속되어야합니다자발적으로.
그림 1 : 혼합 세포 다세포 회전 타원체의 생성. hiPSC-CM, HCF 및 HUVEC를 70:15:15의 hiPSC-CM : HCF : HUVEC 세포 비율에서 혼합하고, 세포 혼합물을 초저 부착 96- 웰 U- 바닥 플레이트에 분배시켰다. 24 시간 이내에 혼합 된 세포 다세포 spheroids (왼쪽, 오른쪽)가 형성되었다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 회전 타원체의 기계적 통합을 보여주는 심장 조직의 생성 . 3D 바이오눈에 보이는 바늘 구멍 (왼쪽)이있는 바늘 어레이에서 꺼내 자마자 즉시 인쇄 된 심장 패치. 이때 스 펠로이드 간의 경계는 이미 뚜렷하지 않았고 패치는 이미 자발적으로 뛰기 시작 했으므로 스 펠로이드가 기계적으로 통합되었습니다. 바늘 어레이에서 제거한 지 3 일 후, 바늘 어레이로 인한 조직 공극을 주변 조직 (오른쪽)으로 채우고 패치는 자발적으로 계속 뛰었다. 눈금 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 심장 혈관 연구에 대한 기금 모금 및 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 (2016-MSCRFI-2735)과 같은 기금 출처를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
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