Summary
このプロトコルは、生体材料を使用せずに心臓組織の3Dバイオプリントを記述する。 3Dバイオプリントされた心臓パッチは、構成要素スフェロイドの機械的統合を示し、心臓組織の再生および心臓病の3Dモデルとして非常に有望である。
Abstract
このプロトコルは、細胞のみを使用して、生体材料を使用せずに心臓組織の3Dバイオプリントを記述する。心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞を最初に単離し、計数し、所望の細胞比で混合する。それらは、超低付着96ウェルプレート中の個々のウェルで共培養される。 3日以内にスフェロイドが鼓動する。これらの回転楕円体は、真空吸引を使用してノズルによってピックアップされ、3Dバイオプリンタを使用してニードルアレイ上に組み立てられる。スフェロイドは、次に、針アレイ上で融合することが可能となる。 3次元バイオプリンティングの3日後、スフェロイドは、すでに自発的に鼓動している無傷のパッチとして除去される。 3Dバイオプリントされた心臓パッチは、構成要素スフェロイドの機械的統合を示し、心臓組織の再生および心臓病の3Dモデルとして非常に有望である。
Introduction
3Dバイオプリント1,2,3の方法にはさまざまなものがあります。 3Dバイオプリントは、インクジェットバイオプリンティング、マイクロ押出バイオプリント、レーザーアシストバイオプリント、方法の組み合わせ、またはより新しいアプローチなどの例を用いて、印刷技術1によって分類されることが多い。 3Dバイオプリントは、スキャフォールドフリーまたはスキャフォールド依存法に分類することもできます4 。 3Dバイオプリントのほとんどの方法は、生体材料、 例えばバイオインキ5または足場6が必要な足場依存性である。しかしながら、足場依存性3Dバイオプリンティングは、足場材料の免疫原性、独自のバイオインキのコスト、分解産物の遅い速度および毒性など、多くの問題および限界に直面している4,7。
Scafスフェロイドを用いた無折返し心臓組織工学が試みられており、足場依存性組織工学のこれらの欠点を克服する可能性がある。しかし、この論文の著者が認めたように、生物工学の過程で、固定された場所でスフェロイドをしっかりと取り扱い、配置することは困難でした。 3Dバイオプリントと回転楕円体ベースの組織工学の併用は、これらの困難を克服する可能性を秘めています。このプロトコールでは、スフェロイドの形態の細胞のみを用いて、他の生体材料を用いずに心臓組織の3Dバイオプリントを説明する。
足場のない回転楕円体ベースの3Dバイオプリンタ9は、真空吸引を使用して個々の回転楕円体をピックアップし、それらを針アレイ上に配置する能力を有する。 3次元バイオプリンティングにおける針アレイ上のスフェロイドの位置づけの概念は、古代ジャパ（ Japa ）においてニードルアレイ（「 ケンザン （ kenzan ）」として知られている）花の配置、 生け花の nese芸術。このシステムは、スフェロイドを任意の構成に正確に配置することを可能にし、個々のスフェロイドを短時間で融合させて、3Dバイオプリント組織を作製する。したがって、この方法は、スフェロイドを容易に操作することを可能にし、足場を用いない器官のバイオファブリケーションの将来への潜在的な影響をもたらす。
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Protocol
1.心筋細胞の調製
- 記載されているように、基底膜マトリックスでコーティングされた6ウェルプレート上で、ヒト誘導性多能性幹細胞（hiPSC）を生成および培養する。10 。
- 以前に記載された方法11,12を用いてhiPSCをhiPSC由来心筋細胞（hiPSC-CM）に分化させる。
- 分化後19日目に、室温で5分間、各ウェルで2mLのトリプシン/ EDTA 0.05％を用いて心筋細胞を単離する。
- 心筋細胞を光学顕微鏡下でモニターし、細胞の解離を観察する。
- 2mLのトリプシンインヒビター0.0125％を用いてトリプシンを中和する。
- 単離された心筋細胞をプールし、モーター付きピペットフィラーを使用して1つの50mLコニカルチューブに移す。
- 室温で250xgで5分間細胞懸濁液を遠心分離してペレットを得る。
- ペレットをロズウェルパーク5mLに再懸濁するB-27（RPMI / B-27細胞培地）を補充したMemorial Institute（RPMI）細胞培地。
- 細胞培地に20μLの細胞をピペットで入れ、同量の0.4％Trypan Blue溶液で染色します。
- 自動細胞計数器または手動血球計算器を使用して、細胞懸濁液の濃度および細胞生存率を数え、得る。
繊維芽細胞の調製
- ヒト心臓線維芽細胞（HCF）（成人心室型）細胞系を開始する。
- 継代し、HCF培養プロトコールに従ってそれらを単離する。
- 細胞培地中の20μLの細胞をピペットで等量のTrypan Blue溶液0.4％で染色する。
- 新しい細胞懸濁液の濃度および細胞生存率を数え、得るために、自動細胞カウンターまたは手動血球計算機を使用する。
3.内皮細胞の調製
- 人間のumbを開始する記載されているように、静脈内皮細胞（HUVEC）系統14 。 HUVEC培養プロトコールに従い、それらを単離する（ 14） 。
- 細胞培地に20μLの細胞をピペットで入れ、同量の0.4％Trypan Blue溶液で染色します。
- 自動細胞計数器または手動血球計算器を使用して、細胞懸濁液の濃度および細胞生存率を数え、得る。
4.共培養：
- RPMI / B-27細胞培地中で3種類の細胞型（hiPSC-CM、HCF、およびHUVEC）を混合して、hiPSC-CM：HCF：HUVEC細胞比50mLコニカルチューブに混合細胞溶液のストックを生成する。 70:15:15およびmL当たり165,000細胞の濃度。
- 混合細胞溶液を、マルチチャネルピペットを使用してウェル当たり200μLまたは1ウェルあたり33,000細胞の超低付着96ウェルU底プレートに分配する。
- 96ウェルプレートを3日間インキュベートする（37℃、5％の炭素二酸化炭素湿度95％）。
- 光学顕微鏡下で個々のウェルの中央と底に混合細胞多細胞スフェロイドの存在を検査する。
注：2次元の顕微鏡投影では、これらの回転楕円体は円形に見えます （ 図1 ）。スフェロイドは、細胞播種後、24時間以内に極低温付着96ウェルプレートに形成されるべきである。スフェロイドは96ウェルプレートに細胞を播種した後、48時間以内に鼓動を開始するはずです。鼓動していないスフェロイドは、最終的な3Dバイオプリントされた心臓パッチが機能することを保証するために3Dバイオプリントに使用すべきではありません。コネキシン43（Cx43）およびトロポニンのスフェロイド免疫蛍光法を用いて、球状細胞の組成と品質を評価することができます15 。
5.足場のない心臓組織の3Dバイオプリント
- スフェロイドを含むプレートを、足場のない回転楕円体ベースの3Dバイオプリンタのマガジンにロードします。
- 3Dバイオプリンタの電源を入れ、3Dバイオプリントソフトウェアを実行します。
- 「補助」、「操作準備」、「検査モード」、「原点復帰」の順にクリックします。
- 「スタート」の下にある緑色のアイコンをクリックして回転楕円体検査を開始します。
- 画面上の "（2）Dia（μm）"欄の下に回転楕円体の直径が表示されていることを確認します。
- 平均回転楕円体の直径を100μmに近づけるには、「初期設定」をクリックし、平均回転楕円体直径をStack Zピッチ（μm）に入力します。
- 「合計」をクリックすると、「レイヤー」の下の数字が自動的に再調整されます。 [適用]をクリックして設定を確定します。
- 「ニードルアレイマップ」をクリックし、「レイヤー番号」に移動して、3Dバイオプリント用に必要なレイヤーを選択し、個々の回転楕円体の位置を選択して、画面の左側のマップに目的の3Dバイオプリントデザインを描画します。 Click「適用」をクリックして3Dバイオプリントデザインを確認します。
- 「ニードルアレイチェック」をクリックしてニードルアレイ検査を開始します。ニードルアレイにピントが合っていない場合は、0〜500μmの範囲の値を "OffsetZ（μm）"に入力して、500μmから100μmまで減少するようにカメラのフォーカスを調整します。
- 「検査パラメータ」、「タイプ1」をクリックし、「直径（μm）」を希望の直径範囲に設定します。 「真円度（％）」と「平滑度（％）」を希望のパーセンテージに設定します。 [適用]をクリックして設定を確定します。
注：ここで回転楕円体の直径は450μm〜550μmに設定されています。 「真円度（％）」および「滑らかさ（％）」は、個々の回転楕円体のコンピュータ計算による評価です。ここでは、「真円度（％）」は60％、「平滑度（％）」は70％です。 - 「存在」をクリックし、「直径（μm）」を同じ設定に更新します前の手順では、 [適用]をクリックして設定を確定します。
- 「Stack Mode」をクリックし、「Start」の下にある緑色のアイコンをクリックして、3Dバイオプリンタのノズルを真空吸引し、針アレイの特定の位置にスフェロイドを配置して、回転楕円体のピックアップを開始します。
注：81個の回転楕円体（9個の回転楕円体と9個の回転楕円体）からなる心臓パッチの場合、3Dバイオプリントには約20〜30分かかります。 - バイオプリント後、滅菌ピンセットを使用して、3Dバイオプリントパッチを含む針アレイをピックアップし、150mLのRPMI / B-27細胞培地を含む250mL滅菌ビーカーに移す。
- 3日間（37℃、5％二酸化炭素、95％湿度）、3Dバイオプリントパッチを針アレイとインキュベートする。
6.ニードルアレイからの3D Bioprintedパッチの除去とパッチ成熟
- 3日間のインキュベーションの後、一方の手は針アレイの基部に、他方のものはプラスチックカバー上のt貼付し、プラスチック製のカバーを静かにスライドさせて、3Dバイオプリントパッチをニードルアレイから外す。
注意：リン酸緩衝生理食塩水（PBS）による潤滑は、必要に応じて、このステップの直前のニードルに適用して、スムーズで簡単に取り外すことができます。 - 一対の無菌鉗子を使用して、その上に3Dバイオプリントパッチを入れたプラスチックカバーをピックアップし、パッチとプラスチックカバーをRPMI / B-27細胞培地を含む35mmディッシュに移す。
- ピンセットをプラスチックカバーに固定した状態で、RPMI / B-27細胞培地のパッチでプラスチックカバーを静かに振って、パッチを培地に放出させます。
- 3Dバイオプリントされたパッチが光学的に検査され、3Dバイオプリントされたパッチが機能しているかどうかを確認しているかどうかを視覚化する。
- 3日以上（37℃、5％二酸化炭素、95％湿度）、35mmディッシュ内の3Dバイオプリントパッチをインキュベートする。
注：3日後、回転楕円体が融合し、針があったパッチはもはや見えなくなるはずです。
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Representative Results
ステップ4.4（共培養）の終わりに、各ウェルの細胞は、超低付着96ウェルU底プレートの底に凝集して、重力によってスフェロイドを形成するはずである。これらのスフェロイドにはhiPSC-CM、HCFs、HUVECが含まれており、光学顕微鏡下で視覚的に検査することができ、2次元投影で円形に見えるはずです（ 図1 ）。ステップ6.3の終わりに、3Dバイオプリントされた心臓パッチは、ニードルアレイによって形成されたニードルホールのために、組織ボイドを含むべきである（ 図2 、左）。この時点で、スフェロイド間の境界は不明瞭になり、パッチは自発的に拍動し始め、スフェロイドの機械的統合を示していたはずです。ステップ6.5の終わりに、組織の空隙は周囲の組織によって埋められるべきであり（ 図2 、右）、3Dバイオプリントされた心臓パッチは継続しなければならない自発的に
図1 ：混合細胞多細胞スフェロイドの作製。 hiPSC-CM、HCFおよびHUVECを、hiPSC-CM：HCF：HUVEC細胞比70:15:15で混合し、細胞混合物を超低付着96ウェルU底プレートに分配した。 24時間以内に、混合細胞多細胞スフェロイド（左、右）が形成され、各ウェルに1つずつ形成された。スケールバー=500μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2 ：スフェロイドの機械的統合を示す心臓組織の創造 。 3Dバイオ目に見える針の穴（左側）を有する針のアレイから取り出した直後に、印刷された心臓パッチを除去する。この時点で、スフェロイド間の境界はすでに不明瞭になっており、パッチはすでに自発的に拍動し始めていたため、スフェロイドは機械的に統合されていました。針のアレイから取り出した3日後、針のアレイによって引き起こされた組織の空隙は周囲の組織によって埋められ（右）、パッチは自然に拍動を続けた。スケールバー= 1mm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
著者らは、心臓血管研究のための基金基金とメリーランド幹細胞研究基金（2016-MSCRFI-2735）という資金源を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
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