Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Создание сердечной ткани, обеспечивающей механическую интеграцию сфероидов с использованием 3D-биопреобразования

doi: 10.3791/55438 Published: July 2, 2017

Summary

Этот протокол описывает трехмерную биотрансляцию сердечной ткани без использования биоматериалов. 3D-биотрансгированные сердечные патч демонстрируют механическую интеграцию компонентов сфероидов и являются многообещающими в регенерации сердечной ткани и в качестве трехмерных моделей сердечных заболеваний.

Abstract

Этот протокол описывает трехмерную биотрансляцию сердечной ткани без использования биоматериалов, используя только клетки. Кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты сначала выделяют, подсчитывают и смешивают при желательных соотношениях клеток. Они совместно культивируются в отдельных лунках в планшетах с ультра-низкой насадкой с 96 лунками. В течение 3 дней формируются бейбинг-сфероиды. Затем эти сфероиды подбирают с помощью вакуумного всасывания и собирают на игольчатой ​​матрице с использованием 3D-биопринтера. Затем сфероидам разрешается сливаться с иглой. Через три дня после трехмерного биотрансляции сфероиды удаляются как неповрежденный патч, который уже спонтанно избивается. 3D-биотрансгированные сердечные патч демонстрируют механическую интеграцию компонентов сфероидов и являются многообещающими в регенерации сердечной ткани и в качестве трехмерных моделей сердечных заболеваний.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Существует много разных методов 3D-биотрансляции 1 , 2 , 3 . 3D-биотрансляция часто классифицируется с помощью технологии печати 1 , например, с использованием биотрансформации для струйной печати, биопреобразования микроэкструзии, биопринтинга с использованием лазера, комбинации методов или более новых подходов. 3D-биотрансляция также может быть отнесена к незамерзающим или зависящим от леса методам 4 . Большинство методов 3D-биопринтинга являются зависимыми от лесов, где существует потребность в биоматериалах, например биоиндикаторах 5 или лесах 6 . Тем не менее, зависящий от лесов трехмерный биотрансляции сталкивается со многими проблемами и ограничениями 4 , 7 , такими как иммуногенность материала лесов, стоимость патентованных биоиндикаторов, низкая скорость и токсичность продуктов разложения.

ScafБыла предпринята попытка создания бессердечной кардиальной ткани с использованием сфероидов 8 с потенциалом преодоления этих недостатков инженерной инженерии, зависящей от лесов. Однако, как признали авторы в этой статье, было трудно надежно обрабатывать и позиционировать сфероиды в фиксированных местах в процессе биообработки. Сопутствующее использование 3D-биопреобразования и тканевой инженерии на основе сфероидов может преодолеть эти трудности. В этом протоколе мы описываем 3D-биотрансляцию сердечной ткани без других биоматериалов, используя только клетки в форме сфероидов.

3D-биопринтеры 9 на основе сфероидов, основанные на основах, имеют возможность подбирать отдельные сфероиды с помощью вакуумного отсоса и размещать их на игольчатой ​​матрице. Концепция позиционирующих сфероидов на игольчатой ​​матрице в 3D-биотрансляции основана на использовании игольчатых массивов (известных как « kenzan ») в древней ДжапеНежное искусство цветочной композиции, икебана. Эта система позволяет точно расположить сфероиды в любой конфигурации и приводит к тому, что отдельные сфероиды сплавляются вместе в течение короткого периода времени для создания трехмерной ткани с биотрансформацией. Таким образом, этот метод позволяет легко манипулировать сфероидами с потенциальными последствиями для будущего биообработки биомассы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Получение кардиомиоцитов

  1. Генерировать и культивировать индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) на 6-луночных планшетах, покрытых матрицей подвальной мембраны, как описано 10 .
  2. Различают hiPSC в hiPSC-производные кардиомиоциты (hiPSC-CMs) с использованием ранее описанных методов 11 , 12 .
  3. На 19-й день после дифференцировки выделите кардиомиоциты, используя 2 мл трипсина / EDTA 0,05% в каждой лунке в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Контролируйте кардиомиоциты под оптическим микроскопом для наблюдения за диссоциацией клеток.
  5. Нейтрализуйте трипсин, используя 2 мл ингибитора трипсина 0,0125%.
  6. Слейте изолированные кардиомиоциты и перенесите их в одну коническую трубку объемом 50 мл с помощью моторизированного наполнителя для пипетки.
  7. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 5 мин при 250 × g при комнатной температуре, чтобы получить гранулу.
  8. Ресуспендируют гранулу в 5 мл Roswell ParkMemorial Institute (RPMI), дополненную B-27 (ячейками среды RPMI / B-27).
  9. Пипетируют 20 мкл клеток в клеточных средах и окрашивают равным количеством 0,4% раствора Trypan Blue.
  10. Используйте счетчик автоматических клеток или ручной гемоцитометр для подсчета и получения концентрации и жизнеспособности клеток суспензии клеток.

2. Получение фибробластов

  1. Инициировать клеточную линию 13 кардиального фибробласта (HCF) (взрослого желудочкового типа).
  2. Пройдите и изолируйте их в соответствии с протоколами культивирования HCF 13 .
  3. Пипетируют 20 мкл клеток в клеточной среде и окрашивают равным количеством раствора Trypan Blue 0,4%.
  4. Используйте счетчик автоматических клеток или ручной гемоцитометр для подсчета и получения концентрации и жизнеспособности клеток новой клеточной суспензии.

3. Получение эндотелиальных клеток

  1. Инициировать человекаЛинией эндотелиальных клеток лилии (HUVEC), как описано 14 . Пройдите и изолируйте их в соответствии с протоколами культивирования HUVEC, как описано 14 .
  2. Пипетируют 20 мкл клеток в клеточных средах и окрашивают равным количеством 0,4% раствора Trypan Blue.
  3. Используйте счетчик автоматических клеток или ручной гемоцитометр для подсчета и получения концентрации и жизнеспособности клеток суспензии клеток.

4. Совместная культура:

  1. Смешайте три типа клеток (hiPSC-CM, HCFs и HUVEC) в средах с ячейками RPMI / B-27, чтобы создать запас раствора смешанных клеток в конической трубке объемом 50 мл при соотношении клеток hiPSC-CM: HCF: HUVEC 70:15:15 и концентрации 165 000 клеток на мл.
  2. Распределите раствор смешанных клеток в планшеты с ультра-низким прилипанием с 96 лунками на 200 мкл на лунку или 33 000 клеток на лунку с использованием многоканальной пипетки.
  3. Инкубируйте 96-луночные планшеты в течение 3 дней (37 ° С, 5% диоксида углерода, Влажность 95%).
  4. Осмотрите наличие смешанных клеточных многоклеточных сфероидов в центре и в нижней части отдельных лунок под световой микроскопией.
    ПРИМЕЧАНИЕ. В двумерной микроскопической проекции эти сфероиды окажутся круглыми по форме ( рис. 1 ). Сфероиды должны образовываться в течение 24 ч, после посева клеток в пластинки с 96 лунками с ультранизким наложением. Сфероиды должны начинать избивать в течение 48 часов, после посева клеток в 96-луночные планшеты. Сфероиды, которые не избивают, не должны использоваться для 3D-биотрансляции, чтобы гарантировать, что конечный трехмерный биотрансферный пластырь функционирует. Иммунофлуоресценцию сфероидов для коннексина 43 (Cx43) и тропонина можно использовать для оценки состава и качества сфероида.

5. 3D Bioprinting без каркасных сердечных тканей

  1. Загрузите пластины, содержащие сфероиды, в журналы бескаркасного сферического 3D-биопринтера.
  2. Включите 3D-биопринтер и выполните программное обеспечение для трехмерного биотрансляции.
    1. Нажмите «Вспомогательный», «Подготовка к операции», «Режим проверки», а затем «Возврат домой».
    2. Нажмите зеленую иконку в разделе «Старт», чтобы начать проверку сфероида.
    3. Следите за тем, чтобы диаметры сфероидов отображались под колонкой «(2) Dia (μm)» на экране.
  3. Чтобы оценить средний диаметр сфероида до ближайших 100 мкм, нажмите «Начальные настройки» и введите средний диаметр сфероида в шаг Stack Z (мкм).
  4. Нажмите «Всего», номер под «Слои» должен автоматически отрегулироваться. Нажмите «Применить», чтобы подтвердить настройки.
  5. Нажмите «Карта массивов игл», перейдите к «Layer No», выберите нужный слой для 3D-биотрансляции и нарисуйте желаемый 3D-проект bioprinting на карте слева от экрана, выбрав отдельные положения сфероида. ClicK «Применить», чтобы подтвердить дизайн 3D-биотрансляции.
  6. Нажмите «Проверка решетки игл», чтобы начать проверку игольной матрицы. Если игольчатая матрица находится вне фокуса, введите значения «OffsetZ (μm)» в диапазоне от 0 до 500 мкм, чтобы отрегулировать фокусировку камеры, начиная с 500 мкм и уменьшаясь на 100 мкм до 0 мкм.
  7. Нажмите «Параметры проверки», «Тип 1» и установите «Диаметр (мкм)» в нужный диапазон диаметров. Установите «Roundness (%)» и «Smoothness (%)» на желаемые проценты. Нажмите «Применить», чтобы подтвердить настройки.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь диаметры сфероида были установлены от 450 до 550 мкм. «Круглость (%)» и «Гладкость (%)» - это компьютерная расчетная оценка каждого отдельного сфероида. Здесь настройки, используемые для «Roundness (%)», составляют 60%, а «Гладкость (%)» - 70%.
  8. Нажмите «Присутствие» и обновите «Диаметр (мкм)» до той же настройкиС на предыдущем шаге. Нажмите «Применить», чтобы подтвердить настройки.
  9. Нажмите «Режим стека», затем зеленый значок «Старт», чтобы начать сфероид, забрать с помощью сопла 3D-биопринтера вакуумным всасыванием и разместить сфероиды в определенных местах в игольной решетке.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для сердечного патча, состоящего из 81 сфероида (9 сфероидов x 9 сфероидов), трехмерная биотрансляция должна занимать около 20-30 минут.
  10. После биотрансляции, используя стерильные щипцы, возьмите иглу, содержащую трехмерный биотрансмент, и перенесите его в 250 мл стерильный стакан, содержащий 150 мл среды RPMI / B-27.
  11. Инкубируйте трехмерный биотрансмент с игольной матрицей в течение 3 дней (37 ° C, 5% углекислого газа, влажность 95%).

6. Удаление 3D Bioprinted Patch из массива игл и паттерна

  1. После 3 дней инкубации, с одной стороны, у основания иглы, а другой на пластиковой крышке под tОн патч, осторожно сдвиньте пластиковую крышку вверх, чтобы удалить трехмерный биотрансмент из массива игл.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Смазывание забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) может быть применено к иглам непосредственно перед этим шагом, если необходимо, для более плавного и легкого удаления.
  2. Используя пару стерильных щипцов, поднимите пластиковую крышку с помощью трехмерного биотрансляционного патча поверх нее и перенесите патч и пластиковую крышку в 35-миллиметровое блюдо, содержащее среду с ячейками RPMI / B-27.
  3. Аккуратно встряхните пластиковую крышку с помощью патча в среде с ячейками RPMI / B-27, при этом щипцы все еще удерживаются на пластиковой крышке, чтобы выпустить патч в носитель.
  4. Осмотрите 3D-биотрансляционный патч под световой микроскопией, чтобы визуализировать, является ли это побочным эффектом, чтобы функционировать трехмерный биотрансмент.
  5. Инкубируйте трехмерный биотрансплантат в 35-миллиметровой тарелке в течение 3 дней или дольше (37 ° C, 5% углекислого газа, влажность 95%).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Через 3 дня сфероиды сливаются вместе, а отверстия вПатч, где игла была, больше не должна быть видимой.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В конце этапа 4.4 (совместная культура) клетки в каждой лунке должны собираться в нижней части пластин U-образного основания с ультра-низким прикреплением с 96 лунками для образования сфероидов под действием силы тяжести. Эти сфероиды содержат hiPSC-CM, HCF и HUVEC и могут быть визуально проверены под световой микроскопией, где они должны появляться круговыми по двумерной проекции ( рисунок 1 ). В конце шага 6.3, трехмерный биотрансферный пластырь должен содержать тканевые пустоты из-за отверстий иглы, создаваемых игольчатой ​​матрицей ( рис. 2 , слева). На этом этапе границы между сфероидами должны были стать нечеткими, и патч должен был начать спонтанно биться, демонстрируя механическую интеграцию сфероидов. В конце шага 6.5 тканевые пустоты должны быть заполнены окружающей тканью ( рис. 2 , справа), в то время как трехмерный биотрансферный пластырь должен продолжать бытьT спонтанно.

Рисунок 1
Рисунок 1 : Создание многоклеточных сфероидов смешанных клеток. HiPSC-CM, HCFs и HUVEC были смешаны при соотношении клеток hiPSC-CM: HCF: HUVEC 70:15:15, и смесь клеток распределялась в ультра-низкорасположенные пластины с 96-луночными планшетами U-bottom. В течение 24 ч образовались смешанные клеточные многоклеточные сфероиды (слева, справа), по одному в каждой лунке. Шкала шкалы = 500 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2 : Создание сердечной ткани с механической интеграцией сфероидов . 3D-биографияОтпечатанный кардиальный пластырь сразу после удаления из игольного массива с видимыми отверстиями иглы (слева). В это время границы между сфероидами уже стали нечеткими, и патч уже начал спонтанно биться, поэтому сфероиды стали механически интегрированы. Через три дня после удаления из игольчатого массива тканевые пустоты, вызванные иглой, заполнялись окружающей тканью (справа), и патч продолжал избивать спонтанно. Шкала шкалы = 1 мм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы признают следующие источники финансирования: Фонд Magic That Matters для сердечно-сосудистых исследований и Фонд исследований стволовых клеток штата Мэриленд (2016-MSCRFI-2735).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Geltrex Invitrogen  A1413202
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher 15400054
Defined Trypsin inhibitor 0.0125% Thermo Fisher R007100
RPMI Cell Media Invitrogen 11875-093 RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
B-27 Supplement Thermo Fisher 17504044 RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) Sciencell 6310
Human umbilical vein endothelial cells Lonza CC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates  Akita Sumitomo Bakelite Co. MS-9096UZ
Regenova Bio 3D Printer Cyfuse Biomedical K.K. N/A www.cyfusebio.com/en/
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Troponin T Antibody Thermo Fisher 701620
Connexin 43 (Cx43) Antibody Chemicon MAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher P36935

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
  2. Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
  3. Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
  4. Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. (2017).
  5. Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
  6. Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
  7. Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
  8. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
  9. Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
  10. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
  11. Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
  12. Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
  13. ScienCell Research Laboratories. Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf (2017).
  14. Lonza Walkersville, Inc. Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,. http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
  15. Thermo Fisher Scientific, Inc. Immunofluorescence Method for IHC Detection. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html (2017).
  16. Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
  17. Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
  18. Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
  19. Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2, (2016), (2016).
Создание сердечной ткани, обеспечивающей механическую интеграцию сфероидов с использованием 3D-биопреобразования
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ong, C. S., Fukunishi, T., Nashed, A., Blazeski, A., Zhang, H., Hardy, S., DiSilvestre, D., Vricella, L., Conte, J., Tung, L., Tomaselli, G., Hibino, N. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (125), e55438, doi:10.3791/55438 (2017).More

Ong, C. S., Fukunishi, T., Nashed, A., Blazeski, A., Zhang, H., Hardy, S., DiSilvestre, D., Vricella, L., Conte, J., Tung, L., Tomaselli, G., Hibino, N. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (125), e55438, doi:10.3791/55438 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter