Summary
Nous décrivons un protocole pour la dissection, la fixation et immunomarquage des organes stéroïdogenèse chez les larves de drosophile et les femelles adultes pour étudier la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation. En plus des organes stéroïdogenèse, nous visualisons l'innervation des organes stéroïdogenèse ainsi que les cellules cibles stéroïdogenèse telles que les cellules souches germinales.
Abstract
Dans les organismes multicellulaires, un petit groupe de cellules est doté d'une fonction spécialisée dans leur activité biogénique, ce qui induit une réponse systémique à la croissance et la reproduction. Chez les insectes, la glande prothoracique des larves (PG) et les femmes jouent un rôle essentiel de l'ovaire adulte dans les hormones stéroïdes biosynthèse principales appelées ecdysteroids. Ces organes sont innervés ecdysteroidogenic du système nerveux, à travers lequel le moment de la biosynthèse est affectée par des facteurs environnementaux. Nous décrivons ici un protocole pour visualiser les organes ecdysteroidogenic et leurs organes interactifs chez les larves et les adultes de la mouche Drosophila melanogaster, qui fournit un système modèle approprié pour étudier la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation. dissection adroite nous permet de maintenir les positions des organes ecdysteroidogenic et leurs organes interactifs, y compris le cerveau, le cordon nerveux ventral, et d'autres tissus. Immunocoloration avec unntibodies contre enzymes ecdysteroidogenic, ainsi que des protéines de fluorescence transgéniques commandés par des promoteurs spécifiques d'un tissu, sont disponibles pour marquer des cellules ecdysteroidogenic. De plus, l'innervation des organes ecdysteroidogenic peuvent également être marqués par des anticorps spécifiques ou une collection de pilotes GAL4 dans divers types de neurones. Par conséquent, les organes ecdysteroidogenic et leurs connexions neuronales peuvent être visualisées simultanément par immunocoloration et techniques transgéniques. Enfin, nous décrivons comment visualiser les cellules souches de la lignée germinale, dont la prolifération et de maintenance sont contrôlés par ecdysteroids. Cette méthode contribue à la compréhension globale de la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation neuronale.
Introduction
Dans les organismes multicellulaires, un groupe de cellules est doté d'une fonction spécialisée dans leur activité biogénique qui est essentiel pour le corps entier. Pour remplir leurs missions, chaque tissu ou organe exprime une série de gènes liés à leurs fonctions et communique avec d'autres tissus pour orchestrer leurs activités dans le cadre du développement. Pour caractériser ces fonctions cellulaires spécialisées et les interactions entre les organes, nous avons besoin de spécifier un groupe de cellules ainsi que d'autres types de cellules étant conservées intactes dans l'architecture multicellulaire.
Un exemple de ces organes spécialisés est un organe stéroïdogénique, où de nombreuses enzymes biosynthétiques les étapes de médiatisent conversion du cholestérol aux hormones stéroïdes actifs 1. La plupart de ces gènes d'enzymes sont exprimés spécifiquement dans les organes stéroïdogenèse, et la voie de biosynthèse est étroitement régulée par de nombreux stimuli externes via des entrées humorale et entrées neuronales. Une fois quesynthétisés, les hormones stéroïdes sont sécrétés dans l'hémolymphe et sont destinés à de nombreux tissus et organes de régulation de l'expression d'une variété de gènes 2. Par conséquent, l'action d'une hormone stéroïde induit une réponse systémique à maintenir l'homéostasie, la croissance et la reproduction.
Pour étudier les fonctions de la biosynthèse des hormones stéroïdes et les actions pléiotropiques des hormones stéroïdes, Drosophila melanogaster peut être utilisé comme système modèle approprié. Au cours des stades larvaires, dans un organe endocrine spécialisé l'hormone stéroïde insecte, ecdystéroïde, biosynthesized appelée la glande prothoracique (PG) 3. Dans le PG, plusieurs enzymes catalysent spécifiquement ecdysteroidogenic les multiples étapes de conversion du cholestérol à l' ecdysone, qui contrôle la mue et de la métamorphose à des stades de développement appropriés 4. Par conséquent, un changement dynamique du titre ecdystéroïde est réglementépar de nombreuses voies de signalisation en réponse aux signaux environnementaux. D'autre part, dans le stade adulte, ecdystéroïde joue un rôle essentiel dans la physiologie, y compris la reproduction, le sommeil, la mémoire et la durée de vie 5, 6, 7, 8. Il est connu que ecdystéroïde est synthétisée activement dans l'ovaire, la régulation de la progression de l' ovogenèse 6, 7, 8, 9, 10, 11. Récemment , nous avons rapporté que le nombre de cellules souches germinales (CSS) est affectée par ecdystéroïde et le sexe de signalisation peptidique en réponse à l' accouplement des stimuli 12.
Des outils puissants de D. melanogaster la génétique et la biologie cellulaire, y compris l' information du génome bien annoté, gène binairesystèmes d'expression, et des techniques transgéniques ARNi, nous ont permis d'identifier des gènes essentiels à la biosynthèse ecdystéroïde dans la PG et l'ovaire 13, 14, 15. Une fois que les gènes ecdysteroidogenic sont identifiés, la régulation de la transcription de ces gènes et les dynamiques de produits Localisations de gènes peuvent être examinés dans la voie de biosynthèse 16. A cet effet, la transcription-PCR quantitative en sens inverse, l' ARN par hybridation in situ, et l' analyse immunohistologique sont effectuées. L'application de ces techniques comprend une tâche difficile; la dissection élaborée du PG ou de l'ovaire. En particulier, le PG de la mouche des fruits est relativement plus faible que celle d'autres insectes (par exemple , le ver à soie et la mouche de coup), donc on a besoin de pratiquer la compétence essentielle de la mouche des fruits dissection pour l' échantillonnage. En outre, les deux organes ecdysteroidogenic reçoivent innervations du système nerveux central (SNC) 17, 18, 19, 20. Ainsi, pour les analyses anatomiques précises, les organes ecdysteroidogenic doivent être conservés intacts ainsi que le système nerveux central et d'autres organes, de ne pas perturber leurs connexions neuronales.
Ici , nous fournissons des protocoles pour la dissection et la visualisation des organes stéroïdogenèse dans D. melanogaster. L'apprentissage de la technique de dissection est la clé point de départ de ces expériences. De plus, on peut étiqueter avec succès les organes stéroïdogenèse ainsi que leurs organes interactifs avec plusieurs anticorps et des lignes de pilote GAL4. Profitant de ces techniques, les matériaux et la génétique, on peut étudier les mécanismes complets de biosynthèse des hormones stéroïdes.
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Protocol
NOTE: Le schéma d' ensemble des protocoles est illustré à la figure 1.
1. La Dissection du larvaire Anneau Gland (RG)
NOTE: Dans D. melanogaster, qui appartient à cyclorrhaphous Diptera, le PG est dans un organe endocrine composite appelé le presse - étoupe annulaire (RG, figure 2D). Comme il est impossible que le PG est chirurgicalement séparé des autres types de cellules (voir plus loin), une cible pratique est d'isoler un RG par dissection intact et non endommagé.
- Préparation des larves aux stades de développement appropriés
REMARQUE: Pour synchroniser les stades de développement des larves de D. melanogaster, il est nécessaire de ramasser les œufs dans une étroite fenêtre de temps et de recueillir les larves au moment opportun.- Ramassez les œufs pendant 2 h sur une plaque d'agar-jus de raisin à 25 ° C.
- Recueillir nouvellement éclos 1
- Au point de temps approprié, recueillir les larves mis en scène avec une boucle en plastique jetable pour éviter les blessures indésirables. Afin de minimiser une différence dans la progression du développement des larves de dernier stade 3 ème, recueillir les larves du 2 ème à 70 HAEL (48 HAD) et leur permettre de muent dans des intervalles de 2 h. Ensuite, recueillir les 3 e stade larvaire dans les 2 heures après la L3 exuviation; cette procédure donne 0-2 larves hAL3E.
- Transférer les larves par étapes dans une boîte remplie de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Rincer les larves avec du PBS pour enlever la nourriture résiduelle du corps.
- Dissection grossière des larves sousmicroscope disséquant
- Tenez le crochet de la bouche d'une larve avec une pince. Séparer le corps de la larve au tiers antérieur de la longueur du corps en utilisant des micro ciseaux.
- Maintenir l'extrémité de coupe du corps de la larve antérieure avec une paire de forceps. Utilisation de l'autre paire de forceps, pousser doucement le bout de la tête vers l'intérieur du corps; cette procédure transforme le corps de la larve intérieur.
REMARQUE: Cette étape peut être ignorée pour la dissection du 1 er stade larvaire. - Répétez les étapes 1.2.1-1.2.2 avec des larves supplémentaires pendant 5-10 min.
NOTE: Le nombre de larves doit être égale ou inférieure à 20 pour gagner du temps pour la dissection.
- Dissection Fillet des larves
REMARQUE: Cette méthode permet de maintenir la position des tissus reste intacte.- Laisser les larves dans l'eau seulement pendant 1 h. Les larves sont immobilisées en raison de l'asphyxie.
- Mettre un côté dorsal des larves dans une goutte de PBS sur un enduit de siliciumplat, avec sa face dorsale vers le haut.
REMARQUE: La face dorsale a 2 tubes trachéaux étendant longitudinalement. - Sous un microscope à dissection, insérer une broche d'insectes dans l'extrémité antérieure de la chenille en utilisant une pince. Étirer le corps de la larve de la face postérieure et mettre une deuxième broche dans l'extrémité postérieure de la larve.
NOTE: En plus des broches d' insectes, une aiguille faite d'un fil de tungstène peut être utile 21. Une aiguille peut être incorporée dans une pointe de pipette par chauffage destiné à être utilisé comme une aiguille de dissection. - Sous un microscope de dissection, faire une petite incision près de la queue avec des micro ciseaux. De l'incision, couper la cuticule dorsale longitudinalement le long de la ligne médiane dorsale vers la tête. Veillez à ne pas endommager les tissus sous la cuticule.
- Étirer la cuticule de paroi corporelle de chaque côté et placer 4 broches à chaque coin de la paroi de corps disséqué.
- Retirer une partie de corps antérieure en matière grasse avec une pince, afin d'exposer le cerveau-RG complex être exposé à la surface. Retirer une paire de glandes salivaires, le cas échéant.
- Fixation et coloration des tissus avec immunohistochimie
- Mettre le tiers antérieur du corps de larves (étape 1.2.2) dans un microtube de 1,5 ml rempli avec 500 ul de la solution de correction (4% de paraformaldehyde dans du PBS). Fixer moins de 20 échantillons en même temps, sinon PBS jointe aux échantillons fixes peuvent provoquer une dilution défavorable du fixateur. Pour la dissection de filet, retirer une goutte de PBS, puis ajouter une goutte de solution de solution.
REMARQUE: Pour une solution de solution, soit 3,7% de formaldéhyde ou 4% paraformaldéhyde peuvent être utilisés. - Incuber les tissus disséqués dans la solution de solution pendant 30 min à température ambiante (RT) ou aussi pendant 2 h à 4 ° C.
- Remplacer la solution de solution avec 500 ul de PBS et rincer rapidement les échantillons 3 fois. Laver pendant 15 min sur une bascule à R échantillons avec 500 uL de 0,3% PBT (PBS + 0,3% d'éthoxylate d'octylphénol)T. Pour la dissection de filet, enlever les broches d'insectes et de transférer les échantillons dans un microtube de 1,5 ml.
NOTE: Pour augmenter la perméabilité des anticorps dans les tissus, les échantillons sont traités avec 500 ul de 2,0% PBT pendant 1-2 h sur une bascule à la température ambiante. - Remplacer PBT avec 500 ul de solution de blocage (2% d'albumine de sérum bovin en PBT). Incuber les échantillons pendant 1,5 h sur une bascule à la température ambiante.
- Remplacer la solution de blocage avec 50 ul de la solution d'anticorps primaire, anticorps -à- dire dilué dans la solution de blocage.
- Incuber les échantillons pendant une nuit sur une bascule à 4 ° C.
- Remplacer la solution d'anticorps primaire avec 500 uL de 0,3% PBT et rincer rapidement les échantillons 5 fois. Laver les échantillons 3 fois avec 500 uL de 0,3% PBT pendant 15 minutes à chaque fois sur une bascule à la température ambiante.
- Remplacer PBT 0,3% avec 50 ul de la solution d'anticorps secondaire (anticorps conjugué à un colorant dilué dans la solution de blocage). Pour la coloration nucléaire, 0,5 pi 4' , 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, solution mère 0,1 mg / ml) est ajouté à une solution de 50 ul. Incuber les échantillons sur un balancier pendant 2 h à la température ambiante ou bien à 4 ° C pendant une nuit.
REMARQUE: Conservez les échantillons dans l'obscurité. - Remplacer la solution d'anticorps avec 500 ul de 0,3% PBT et rincer 5 fois. Laver les échantillons 3 fois avec 500 uL de 0,3% PBT pendant 15 minutes à chaque fois à la température ambiante.
- Mettre le tiers antérieur du corps de larves (étape 1.2.2) dans un microtube de 1,5 ml rempli avec 500 ul de la solution de correction (4% de paraformaldehyde dans du PBS). Fixer moins de 20 échantillons en même temps, sinon PBS jointe aux échantillons fixes peuvent provoquer une dilution défavorable du fixateur. Pour la dissection de filet, retirer une goutte de PBS, puis ajouter une goutte de solution de solution.
- Dissection fine du complexe cerveau-RG contenant le PG et le montage
- Utiliser une pipette jetable pour transférer les échantillons immunocolorées à un plat rempli avec 0,3% de PBT.
REMARQUE: Pour éviter des bulles gênantes lors de la dissection et de montage, 0,3% PBT peut être remplacé par du PBS. - Sous un microscope à dissection, maintenir le crochet de cuticule ou de la bouche avec une paire de forceps. En utilisant une aiguille 27 G attachée à une seringue de 1 ml comme un « couteau », couper l'extrémité antérieure de l'œsophage et des disques oculaires pour éliminer le complexe de disque cerveau-RG-oeil de la cuticule du corps.
- Sepaévaluer l'oesophage et de l'intestin du complexe disque cerveau-RG yeux avec des pinces. Depuis l'œsophage passe à travers le cerveau au-dessus du cordon nerveux ventral (VNC), retirer l'intestin du côté postérieur.
REMARQUE: Pour retirer les disques imaginaux supplémentaires à partir des échantillons, couper les liens entre le cerveau, les disques des yeux et des disques de la jambe avec un couteau à aiguille. - Répétez les étapes 1.5.1-1.5.4 pour d'autres échantillons.
Remarque: Pour éviter les débris de tissu de coller aux échantillons, transférer chaque échantillon rempli à un plat propre différent rempli avec 0,3% de PBT ou de PBS. - Transférer les échantillons au centre d'une lame de verre propre avec une micropipette.
NOTE: Pour 2 ème ou 3 ème stade larvaire, devrait être tronqué la fin d'une pointe de micropipette avec une lame de rasoir. - Sous un microscope à dissection, aligner des échantillons individuels avec leur face dorsale par l'aide de pinces.
NOTE: Le RG est situé sur la face dorsale du cerveau (figure 2A). Cet alignement facilite la spécification des échantillons individuels au cours de l'imagerie. - Inclinaison vers une lame de verre et essuyer autant que possible l'excès de PBT. Mettre une goutte de réactif de montage sur un côté de la glissière. Placez le bord d'un glissement de couverture de l'autre côté de la goutte et mettre la lamelle sur les échantillons lentement avec des pinces.
NOTE: Cette procédure empêche les échantillons de se déplacer à l'extérieur du glissement de couverture. - Stocker les échantillons à 4 ° C. Gardez les échantillons dans l'obscurité.
- Utiliser une pipette jetable pour transférer les échantillons immunocolorées à un plat rempli avec 0,3% de PBT.
2. Le Dissection du Ovaire en Femmes adultes
- Préparation des femelles adultes
- Alimentation mouches femelles avec de la nourriture à la mouche levure / semoule de maïs standard pour 3-4 jours pour engraisser l'ovaire. Maintenir à 25 ° C.
- Dissection de l'ovaire chez les femmes adultes
- Anesthésier mouches femelles avec du gaz CO 2 et de couper la tête.
- Transfert des corps de mouche à un plat de 3 cmrempli de PBS.
- Sous un microscope à dissection, tenir le thorax du côté dorsal en utilisant une pince. Saisir le segment abdominal A5 ou A6 avec les autres pinces et décoller la cuticule abdominale vers le côté postérieur. Essuyez la cuticule collante de la pointe de la pince.
- Pincez un oviducte et prendre l'ovaire du corps.
- Peigne et diffuser les conseils de l'ovaire avec une pince.
REMARQUE: Cette opération améliore l'efficacité de l'immunocoloration.
- Dissection du cerveau des femmes adultes, VNC et les organes reproducteurs.
NOTE: Cette méthode permet l'innervation de l'ovaire à conserver intacte.- Anesthésier mouches femelles avec du gaz CO 2 et de les transférer à un plat siliconé rempli avec du PBS.
- Sous un microscope de dissection, tenir les rostre et éplucher la cuticule de la tête pour exposer le cerveau avec une pince. Retirer la trachée attachée au cerveau.
NOTE: Le Brain est une structure blanche et arrondie. Le cerveau se connecte à VNC dans le thorax. - Tenir le thorax sur la face dorsale et couper les pattes et les ailes avec une paire de forceps. Utilisation de l'autre paire de forceps, décoller le thorax ventral cuticule de la base des jambes. Une fois que le VNC est exposé, enlever la cuticule dorsale résiduelle et les muscles attachés à la pince à l'aide de VNC. Veillez à ne pas endommager la connexion entre le cerveau et le VNC.
- Utilisez une pince pour peler la cuticule abdominale et d'exposer l'ovaire et de leurs organes interactifs, y compris les neurones, la culture, l'intestin, l'oviducte, l'utérus et la glande accessary.
- Retirez les tissus résiduels, y compris la trachée et le corps de graisse à l'aide des pinces.
- Fixation et coloration des tissus avec immunohistochimie
- Transférer environ 8-10 paires des ovaires dans un microtube de 1,5 ml rempli avec 250 ul de la solution de correction (4% paraformaldehyde dans du PBS) et incuber les échantillons pendant 30 min à température ambiante.
- Remplacer la solution de solution avec 500 ul de PBS et rincer rapidement les échantillons 3 fois.
- Laver les échantillons 2 fois avec 500 uL de 0,1% PBT pendant 5 min chacun à TA.
- Remplacer PBT avec une solution de blocage de 50 ul. Incuber les échantillons pendant 1 heure sur une bascule à la température ambiante.
- Remplacer la solution de blocage avec 50 ul de la solution d'anticorps primaire.
- Incuber les échantillons pendant une nuit sur une bascule à 4 ° C.
- Remplacer la solution d'anticorps primaire avec 500 uL de 0,1% PBT. Laver les échantillons 3 fois avec 500 uL PBT 0,1% pendant 15 minutes chacun sur une bascule à la température ambiante.
- Remplacer PBT de 0,1% avec une solution d'anticorps secondaire de 50 ul. Pour la coloration nucléaire, ajouter 0,5 ul DAPI à 50 ul de la solution. Incuber les échantillons pendant 2 heures sur une bascule à la température ambiante.
- Remplacer la solution d'anticorps secondaire avec 500 uL de 0,1% PBT. Laver les échantillons 3 fois avec 500 uL de 0,1% PBT pendant 15 min chacun sur une bascule à la température ambiante.
REMARQUE: La procédure de lavage peut se faire à 4 ° C pendant la nuit. Gardez les échantillons dans l'obscurité.
- Montage des échantillons sur des lames de verre
- Transférer les échantillons sur une lame de verre avec 0,1% de PBT en utilisant une micropipette.
Remarque: Pour éviter les bulles gênantes lors de la dissection et de montage, PBT 0,1% peut être remplacée par du PBS. - Pour l'ovaire, séparer les chaînes des ovarioles de l'autre avec des pinces au microscope de dissection. Ne pas blesser les conseils des ovarioles contenant les germaria. Pour l'organe reproducteur-VNC complexe du cerveau, enlever la cuticule résiduelle et organiser la position sur une lame de verre.
- Essuyez le plus excès PBT que possible et mettre une goutte de réactif de montage au centre des échantillons. Placez une lamelle lentement à l'aide des pinces.
- Stocker les échantillons à 4 ° C. Gardez les échantillons dans l'obscurité.
- Transférer les échantillons sur une lame de verre avec 0,1% de PBT en utilisant une micropipette.
- Observez les échantillons au microscope et amener les organes stéroïdogenèse dans le champ de vision. Une fois que le point de vue est fixe, changer le système d'imagerie dans le mode d'acquisition d'image.
REMARQUE: Les lentilles sont utilisées objectifs 10-20x pour obtenir les images du complexe cerveau-RG ou de l'ovaire entier. En variante, les lentilles d'objectif 40-63X (eau ou immersion dans l'huile) sont utilisés pour la visualisation de la localisation subcellulaire des protéines dans les CSS ou l'innervation des neurones du PG et de l'ovaire. - Mettre en place les paramètres d'acquisition d'image sur le logiciel ci-joint. Sélectionnez la combinaison de fluorescence (par exemple GFP et DP). En procédure de balayage rapide, régler la puissance du laser, la sensibilité des détecteurs (Gain / Offset), et la taille du trou d'épingle.
REMARQUE: Pour obtenir des images à haute qualité, doivent être optimisés la puissance du laser à balayage et la sensibilité du détecteur (gain) pour chaque échantillon. Pour définir la formedes tissus, une image de lumière transmise peut être prise en plus d'une image fluorescente. - Prenez des piles Z des images. Lors d'une analyse rapide continue, déplacer le plan focal avec le lecteur de mise au point du microscope et définir la position de départ et la position finale. Le nombre de tranches et la distance entre les tranches d'intervalle sont ajustées en conséquence.
- Sélectionnez la vitesse de balayage, la méthode de balayage et le mode de balayage bidirectionnel.
- « Démarrer les vrais scans » pour l'acquisition d'images.
- Enregistrez l'image avec le format du logiciel ci-joint.
REMARQUE: Les fichiers d'image d'origine contient les informations des paramètres d'acquisition d'image et échelles. Les images exportées peuvent être traitées à l' aide d' un logiciel de traitement d'images sur l'ordinateur 22.
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Representative Results
Nous avons utilisé les protocoles ci - dessus pour visualiser les organes stéroïdogenèse et leurs organes interactifs larves de D. melanogaster et les femelles adultes. Le schéma d' ensemble des protocoles est illustré à la figure 1.
Le RG, y compris le PG (Figure 2D), est plus petit et plus transparent que le cerveau et est situé au niveau du côté antérieur-dorsale du cerveau (figure 2A-C et 3A-E). Pour marquer les cellules PG, plusieurs groupes ont produit divers types d'anticorps contre les enzymes ecdysteroidogenic (c. -à Neverland 23, spookier 24, carénage 20, 25 Phantom, Disembodied 25, et l' ombre 26). Parmi eux, l' anticorps anti-enveloppe (Sro) est utilisé pour marquer de manière fiable le PG par immunocoloration (Figure 2C, 2E et 3C). Sinon, le binary système d'expression de gène, le système GAL4 / UAS 27, peut être utilisé pour exprimer des gènes de protéines fluorescentes dans des cellules PG. Grâce à l'analyse du promoteur du gène de fantôme ecdysteroidogenic (phm), le promoteur spécifique de PG peut induire l' expression du gène exclusivement dans la PG 28. Par conséquent, les cellules PG peuvent être spécifiquement visualisées en exprimant la GFP ou DP sous le contrôle de phm-GAL4 # 22 (Figure 3D).
Pour visualiser la connexion neuronale entre le PG et le cerveau, un groupe de neurones peut être marqué avec mCD8 :: GFP sous le contrôle de divers conducteurs GAL4 et des anticorps (figure 2C, 2E, 3D et 3E). La base de données FlyLight des collections de ligne de GAL4 est optimisé pour les neurones d'étiquetage 29. Parmi eux, les étiquettes GMR45C06-GAL4 neurones PG-saillie (figure 2C et E). l'immunostaining des larves exprimant la GFP avec un anticorps anti-GFP est efficace pour améliorer des signaux de GFP. En outre, TRH-GAL4> mCD8 :: larves de GFP montrent le système nerveux stomatogastrique, dans lequel les neurones sérotoninergiques projet non seulement le PG, mais aussi à la proventricule (PV, foregut insectes) et les muscles pharyngés (PM) (Figure 3D et E) 20, 30. Il est donc essentiel de maintenir la position du RG, le cerveau et les autres tissus environnants lors de dissections de filet (figure 3).
Chez les femelles adultes, de l' ovaire ecdystéroïde affecte de nombreux aspects de l' ovogenèse, tels que la prolifération de la CGC, la différenciation des kystes, la croissance de la chambre d'œufs, et la réponse au stress 11. Comme dans le PG, les enzymes ecdysteroidogenic dans l'ovaire sont également visualisés avec des anticorps spécifiques décrits ci - dessus 12, 31.En tant qu'événement en aval sur lequel ecdysteroids acte, le nombre de GSCs dans germarium est notre objectif (Figure 4). Bien que le germarium est un assemblage de plusieurs types de cellules, les CSS sont spécifiés par immunocoloration avec deux anticorps marqueurs GSC, 1B1 et D 32 E-cadhérine. Pour visualiser l'innervation de l'ovaire, l'ovaire est disséqué avec le cerveau, VNC, intestin, culture, de l' utérus, et spermathèque (Figure 5). Les neurones sont visualisées par mCD8 :: GFP sous le contrôle du nSyb-GAL4, un conducteur pan-neuronal (figure 5B et D). Les muscles autour de l'ovaire, de l'utérus et l'intestin sont colorées avec un colorant phalloïdine conjugué.
Figure 1: Le schéma d' ensemble des protocoles. Deux méthodes de dissection distinctes sont appliccapable de larves et les femelles adultes, en fonction du but des expériences. Les procédés de montage sont également conçus en fonction des conditions échantillon. Fixation, coloration, et des techniques d'imagerie sont essentiellement commun à tous les échantillons. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Visualisation de la PG et des neurones se projetant PG. (A et B) La glande cerveau torique (RG) du complexe de type sauvage 3 ème stade larvaire. Dans (B), le PG est décrite par des lignes en pointillés. La structure filamenteuse entre le cerveau et le RG est la trachée. (C - E) L'innervation de la PG a été visualisée avec mCD8 ::GFP entraîné par GMR45C06-GAL4 dans la collection FlyLight. Les neurones de PG et GFP-positives ont été marquées avec un anticorps anti-Sro (magenta) et de l'anticorps anti-GFP (vert), respectivement. L'image fluorescente est fusionnée avec l'image transmise la lumière pour indiquer le contour des tissus. (D), le PG, le corpora allata (CA) et le cardiaca corpora (CC) sont illustrés. Les neurones se projetant PG sont plus importants dans l'image à haute puissance avec 40X lentille d'objectif (flèches E) que dans l'image de faible puissance avec 10X lentille d'objectif (C). Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Les projets du système nerveux stomatogastrique à la PG, PV, un e le PM. (A et B) La dissection de filet d'un type sauvage 3ème stade larvaire. Les positions du PG, du cerveau (Br), cordon nerveux ventral (VNC), disques oculaires (ED), disques aile (WD), le muscle pharyngé (PM), et glandulaire (PV) restent intacts. (C) Le PG a été exclusivement marqué avec un anticorps anti-Sro (magenta). (D) Le PG a été marqué avec turboRFP entraîné par phm-GAL4 # 22. les neurones sérotoninergiques ont été marquées avec un anticorps anti-5HT (vert). (E) Le système nerveux stomatogastrique a été visualisée avec mCD8 :: GFP entraîné par TRH-GAL4. neurones sérotoninergiques projet au PG, le PM et le PV (flèches). La barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 4: Le Germaria des Mouches de type sauvage contenant un, deux ou trois GSCs. (A) Vue d'ensemble de l'organe reproducteur femelle. Un ovaire est composé de 16-20 ovarioles qui sont des chaînes de chambres d'oeuf. Le germarium, où sont situés les CSS, est à l'extrémité de chaque ovariole. (B - D) une, deux, ou trois CSS sont situés dans chaque germarium (cercles en pointillés blancs) des femelles de type sauvage. CSS sont colorées avec l'anticorps 1B1 (vert), qui marque une structure sphérique appelé les spectrosome (flèches) et une structure du cytosquelette membranaire connu sous le nom fusome. Les limites des cellules sont visualisées avec un anticorps anti - D E-cadhérine (magenta). La barre d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Les organes reproducteurs féminins et leurs organes interactifs. (A) L'ovaire (Ov), de l' intestin (Gut), culture (Cr), le cerveau (Br), cordon nerveux ventral (VNC), et spermathèque (Sp) ont été disséqués sous le microscope. (B - D) L'innervation de l'ovaire a été visualisée avec mCD8 :: GFP entraîné par nSyb-GAL4. neurones GFP-positives étendent à partir du VNC (flèche), faisant saillie à la surface des ovaires (têtes de flèches). Les ovaires sont décrits par des lignes en pointillés. Les échantillons ont été colorés avec un anticorps anti-GFP (vert) et le colorant conjugué phalloïdine (magenta). associés phalloidin avec l'actine filamenteuse des muscles autour des ovaires (Ov) et de l'utérus (Ut). L'illustration est représentée en C. La barre d'échelle = 200 um.rge.jpg » target = « _ blank »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous avons étudié la biosynthèse ecdystéroïde et son mécanisme de réglementation D. melanogaster, et a élaboré un protocole de dissection et immunomarquage. Le moment de la biosynthèse ecdystéroïde est affectée par des facteurs environnementaux à travers les entrées de neurones 33, il est donc essentiel de maintenir l'innervation des organes ecdysteroidogenic ainsi que le cerveau, VNC, et d' autres tissus lors de la dissection.
Comme décrit ci - dessus, le D. melanogaster PG forme un organe endocrine complexe RG avec le corpora allata (CA) et le corpora cardiaca (CC) (figure 2D). Alors que le produit PG ecdysteroids, CA et CC produisent des hormones juvéniles et de l'hormone adipocinétique, respectivement. Cette propriété anatomique a été un obstacle pour les chercheurs qui étudient ecdysteroidogenesis dans D. melanogaster, par rapport à d' autres insectes. Cependant, au cours des dernières décennies, la mouche génétique has nous a permis d'identifier de nombreux gènes ecdysteroidogenic qui sont exprimés spécifiquement dans le PG 4. Ces gènes sont également exprimés dans les cellules nourricières ou cellules de follicules de l'ovaire 34, 35. Maintenant, on peut utiliser un ensemble unique de profils d'expression des gènes dans les organes ecdysteroidogenic, permettant de spécifier les cellules ecdysteroidogenic par immunocoloration et techniques transgéniques.
Au cours de la dissection, il est essentiel d'utiliser une pince fine avec des arêtes vives. Avant la dissection, les bords de la pince peuvent être affûtés avec une meule Arkansas pour amener les bords ensemble sans lacunes. Au cours de la dissection, les débris ou les tissus résiduels, tels que le corps gras, l'intestin, et les disques imaginales, doivent être enlevés, autant que possible. En particulier, des morceaux de corps gras collent facilement au tissu d'intérêt. De plus, le montage des échantillons sur des lames de verre doit également effectuered avec soin. Un complexe de tissus peut être dérangé quand une lamelle couvre-objet est placé sur les échantillons dans un milieu de montage collant. Par conséquent, un nombre suffisant d'échantillons doit être disséqué et des échantillons appropriés doivent être choisis pour l'imagerie, tels que ceux dans lesquels le RG ou l'ovaire est sur le côté supérieur et les connexions neuronales restent intacts.
Pour effectuer immunomarquage avec succès et d'obtenir les résultats reproductibles, il est essentiel de maintenir les mêmes conditions pour les procédures d'échantillonnage et de manutention. L'étendue de l'immunocoloration dépend fortement de la condition des animaux individuels au moment de l'échantillonnage et la fixation. Par exemple, l'âge des animaux, les températures d'élevage, l'état des éléments nutritifs, et le temps de dissection doit être examinée attentivement. Pour minimiser les erreurs de manipulation de fixation dans plusieurs expériences, nous gardons soigneusement presque le même nombre d'échantillons pour coordonner le temps de dissection et des temps de réaction de fixation. Pour la fixation de solution, 4% de paraformaldéhyde ou de 3,7% de formaldéhyde est utilisé. Parce que le paraformaldéhyde est rapidement dégradé au fil du temps, la poudre est généralement dissous pour faire une solution mère à 10% dans du PBS et des aliquotes sont stockées à -20 ° C. Les aliquotes sont dégelés pour rendre la solution de solution fraîche de 4% avant chaque dissection. De plus, les nombreuses étapes de lavage des échantillons réduisent l'arrière-plan coloration non spécifique.
Dans l'étape d'acquisition d'image, nous suivons le protocole du fabricant pour la microscopie confocale. Le système de microscopie offre une interface conviviale pour les chercheurs ou les étudiants, tels que les ensembles optimaux d'excitation / filtres d'émission sont sélectionnés automatiquement lorsque l'on précise les types de fluorophores. Bien que le système de microscopie est facile à utiliser, il faut optimiser les paramètres d'acquisition d'image sur chaque échantillon ou chaque plan focal, en changeant le gain du détecteur, la vitesse de balayage, les numéros de numérisation et la taille sténopé.
36. Pour surmonter ce problème, la technique knock-in peut être appliqué pour insérer une étiquette HA dans le locus du gène de ouija en utilisant le système CRISPR / cas9. En utilisant de telles techniques transgéniques en combinaison avec une immunocoloration, au moins 3-4 protéines peuvent être visualisées simultanément dans la PG ou de l'ovaire. Contrairement à la localisation des protéines, cependant, une méthode pour visualiser les ecdystéroïdes endogènes par immunocoloration n'a pas été établie. Une fois que l'anticorps anti-ecdystéroïde est disponible pour immunomarquage, les localisations subcellulaires de biosynthèse ecdystéroïde et le transport de ecdystéroïde peuvent être étudiés à l'avenir. Une autre limitation est que la dynamique temporelle de ecdysteroidogenesis ne peuvent pas être examinés dans les tissus fixes. Considérant que le titre ecdystéroïde fluctue le long des stades de développement, l'activité des organes ecdysteroidogenic et les neurones en saillie doit être temporellement régulée en réponse à divers stimuli environnementaux. Une étude récente a suivi le Ca2 + dynamique des cellules PG en utilisant des techniques d'imagerie en temps réel 37. Pour les applications futures, nous développons actuellement un protocole pour l'imagerie en direct de PG ou des ovaires de culture ainsi que leurs neurones en saillie. En ce qui concerne les méthodes existantes, ce nouveau protocole vise à visualiser l'activité des neurones et de leurs organes cibles simultanément. Une fois l'activité des neurones peut être contrôlée avec le Ca 2+ indicateur GCaMP ou 38 Cameleon, il peut être manipulé avec des approches optogénétiques ou thermogénique au moment opportuns 39. Ces méthodes contribuent à une compréhension globale de la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation neuronale.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions Reiko Kise et Tomotsune Ameku pour leur soutien technique pour ce travail. Nous sommes également reconnaissants envers Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko koto, Masayuki Miura, le Stock Center drosophile Bloomington, KYOTO Stock Center (DGRC), et les études de développement Hybridome Banque pour les stocks et réactifs. Ce travail a été soutenu par des subventions à YSN de JSPS KAKENHI Grant Numéro 16K20945, La Fondation Naito et Inoue Prix scientifique de la recherche; et par une subvention à RN de MEXT KAKENHI Grant Numéro 16H04792.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
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