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Developmental Biology

Protocolos para a visualização de esteroidogênicas Órgãos e seus órgãos interativa com imunocoloração na mosca da fruta Published: April 14, 2017 doi: 10.3791/55519
Automatic Translation
*1, *1, *2, 3
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
* These authors contributed equally

Summary

Nós descrevemos um protocolo para dissecação, fixação e imunocoloração de órgãos esteroidogênicas em Drosophila larvas e adultos do sexo feminino para estudar a biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação. Em adição aos órgãos esteroidogênicas, podemos visualizar a inervação dos órgãos esteroidogênicas, bem como células alvo esteroidogênicas, tais como células estaminais da linha germinal.

Abstract

Em organismos multicelulares, um pequeno grupo de células é dotado com uma função especializada na sua actividade biogénico, induzir uma resposta sistémica para o crescimento e reprodução. Em insetos, a glândula larval prothoracic (PG) e as fêmeas adultas de reprodução ovário papéis essenciais no biosynthesizing os principais hormônios esteróides chamados ecdisteroides. Estes órgãos ecdysteroidogenic são inervados do sistema nervoso, através do qual o momento da biossíntese é afetado por estímulos ambientais. Aqui nós descrevemos um protocolo para a visualização de órgãos ecdysteroidogenic e seus órgãos interativos em larvas e adultos de mosca da fruta Drosophila melanogaster, que fornece um sistema modelo adequado para estudar a biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação. dissecção Hábil nos permite manter as posições dos órgãos ecdysteroidogenic e seus órgãos interativas, incluindo o cérebro, a medula nervosa ventral, e outros tecidos. Imunomarcação com umntibodies contra enzimas ecdysteroidogenic, juntamente com proteínas de fluorescência transgénicos accionados por promotores específicos de tecido, estão disponíveis para marcar células ecdysteroidogenic. Além disso, os inervação dos órgãos ecdysteroidogenic podem também ser marcados por anticorpos específicos ou um conjunto de controladores de GAL4 em vários tipos de neurónios. Portanto, os órgãos ecdysteroidogenic e as suas ligações neuronais possa ser visualizado simultaneamente por imunocoloração e técnicas transgénicas. Finalmente, descrevemos como visualizar as células-tronco germinativas, cuja proliferação e manutenção são controlados por ecdisteroides. Este método contribui para a compreensão abrangente da biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação neuronal.

Introduction

Em organismos multicelulares, um grupo de células é dotado com uma função especializada na sua actividade biogénico que é essencial para o corpo inteiro. Para desempenhar a sua missão, cada tecido ou órgão expressa uma série de genes relacionados com as suas funções e comunica com outros tecidos para orquestrar a sua actividade no âmbito do desenvolvimento. Para caracterizar tais funções celulares especializadas e interacções inter-órgãos, é preciso especificar um grupo de células, juntamente com outros tipos de células a ser mantida intacta na arquitectura multicelular.

Um exemplo de tais órgãos especializados é um órgão esteroidogénica, onde muitas enzimas biossintéticas mediar as etapas de conversão de colesterol para hormonas esteróides activas 1. A maioria destes genes da enzima são especificamente expressos em órgãos esteroidogênicas, e a via de biossíntese é fortemente regulada por diversos estímulos externos através de entradas humorais e entradas neuronais. Uma vezsintetizados, hormonas esteróides são segregados para o hemolinfa e são direccionadas para vários tecidos e órgãos para a regulação da expressão de uma variedade de genes 2. Portanto, a acção de uma hormona esteróide induz uma resposta sistémica para manter a homeostase, crescimento e reprodução.

Para investigar as funções de esteróide biossíntese hormônio e as ações pleiotrópicas de hormônios esteróides, Drosophila melanogaster pode ser utilizado como um sistema modelo adequado. Durante os estágios larvais, a hormona esteróide de insectos, ecdiesteróide, é biossintetizado em um órgão endócrino especializada chamada a glândula prothoracic (PG) 3. Nas PG, várias enzimas ecdysteroidogenic catalisar especificamente os passos de conversão múltiplos a partir do colesterol para ecdisona, que controla a muda e metamorfose nas fases de desenvolvimento apropriadas 4. Portanto, uma mudança dinâmica no título ecdiesteróide é reguladapor muitas vias de sinalização em resposta a estímulos ambientais. Por outro lado, na fase adulta, ecdiesteróide desempenha papéis essenciais na fisiologia, incluindo reprodução, sono, memória, e tempo de vida 5, 6, 7, 8. Sabe-se que ecdiesteróide é biosintetizada activamente no ovário, regulando a progressão da oogese 6, 7, 8, 9, 10, 11. Recentemente, relataram que o número de células estaminais da linha germinal (GSCS) é afectada pela sinalização péptido ecdiesteróide e sexo em resposta a estímulos de acoplamento 12.

Poderosas ferramentas de D. melanogaster genética e biologia celular, incluindo a informação do genoma bem anotada, gene binárioOs sistemas de express, e as técnicas de ARNi transgénicos, permitiram-nos identificar os genes essenciais para a biossíntese de ecdiesteróide no PG e do ovário 13, 14, 15. Uma vez que os genes ecdysteroidogenic são identificadas, a regulação da transcrição destes genes e as localizações dinâmicas de produtos de genes pode ser examinado na via de biossíntese de 16. Para esta finalidade, quantitativa-transcrição reversa-PCR, o RNA de hibridação in situ e a análise imuno-histológica são conduzidos. A aplicação destas técnicas inclui uma tarefa difícil; a dissecção elaborada do PG ou do ovário. Em particular, a PG da mosca da fruta é relativamente mais pequena do que a de outros insectos (por exemplo, o bicho da seda e a mosca varejeira), de modo que é necessário para praticar a habilidade vital da mosca da fruta dissecção para amostragem. Além disso, ambos os órgãos ecdysteroidogenic recebem inervaçãos a partir do sistema nervoso central (SNC), 17, 18, 19, 20. Assim, para análises anatômicas precisas, os órgãos ecdysteroidogenic deve ser mantida intacta, juntamente com o sistema nervoso central e outros órgãos, para não perturbar as suas conexões neuronais.

Aqui nós fornecemos protocolos para a dissecção e visualização de órgãos esteroidogênicas em D. melanogaster. Aprender a técnica de dissecção é o ponto de partida fundamental para essas experiências. Além disso, pode-se com sucesso rotular os órgãos esteroidogênicas, bem como seus órgãos interativos com vários anticorpos e linhas de driver GAL4. Aproveitando estas técnicas, materiais e genética, pode-se estudar os mecanismos abrangentes de esteróide biossíntese da hormona.

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Protocol

NOTA: O esquema geral de protocolos é mostrado na Figura 1.

1. A dissecção do Anel Glândula larval (RG)

NOTA: Em D. melanogaster, que pertence ao Diptera cyclorrhaphous, por o PG estar dentro de um órgão endócrino composto chamado a glândula anel (RG, Figura 2D). Uma vez que é inviável que o PG é cirurgicamente separado a partir de outros tipos de células (discutido mais tarde), um alvo é prático para isolar, um de RG não danificado intacta por dissecção.

  1. Preparação de larvas nos estádios de desenvolvimento apropriadas
    NOTA: Para sincronizar os estágios de desenvolvimento de larvas de D. melanogaster, é necessário recolher os ovos dentro de uma janela de tempo estreita e para coletar larvas nos momentos adequados.
    1. Recolher ovos durante 2 h sobre uma placa de agar de uva-suco, a 25 ° C.
    2. Recolhe-recém eclodidos 1 NOTA: A idade das larvas é representado por "horas após a postura de ovos (HAEL)", "horas após o nascimento (HAH)", ou "horas após L3 ecdise (hAL3E)".
    3. No ponto de tempo adequado, recolher as larvas encenado com uma ansa de plástico descartável para evitar ferimentos indesejáveis. Para minimizar a diferença na progressão do desenvolvimento das larvas instar 3 rd, recolher o instar de larvas 2 nd a 70 Hael (48 HAH) e permitir-lhes a muda em intervalos de 2 horas. Em seguida, recolher as larvas instar 3 rd dentro de 2 h depois da ecdise L3; este procedimento dá 0-2 hAL3E larvas.
    4. Transferir as larvas encenado para um prato cheio com salina tamponada com fosfato (PBS).
    5. Lavar as larvas com PBS para remover alimentos residual a partir do corpo.
  2. Dissecção grosseira de larvas sob umdissecando microscópio
    1. Segure o gancho de boca de uma larva com uma pinça. Cortar o corpo larval no anterior de um terço do comprimento do corpo utilizando micro tesouras.
    2. Segurar a extremidade cortada do corpo das larvas anterior, com um par de pinças. Usando o outro par de fórceps, suavemente empurrar a ponta da cabeça para o interior do corpo; este procedimento transforma o corpo larval dentro para fora.
      NOTA: Esta etapa pode ser ignorada para a dissecação de 1 larvas st.
    3. Repetir os passos 1.2.1-1.2.2 com larvas adicional durante 5-10 min.
      NOTA: O número de larvas deve ser igual ou inferior a 20 a economizar tempo para dissecção.
  3. Dissecção filé de larvas
    NOTA: Este método permite manter a posição de tecidos para permanecer intacta.
    1. Deixar larvas na água apenas para 1 h. As larvas são imobilizados devido a asfixia.
    2. Coloque um lado dorsal larva-se numa gota de PBS numa revestido de silício-prato, com o seu lado dorsal para cima.
      NOTA: O lado dorsal tem 2 tubos traqueais todo o comprimento.
    3. Sob um microscópio de dissecação, inserir um pino de insectos para a ponta anterior da larva usando uma pinça. Esticar o corpo das larvas para o lado posterior e colocar uma segunda pin para a extremidade posterior da larva.
      NOTA: Para além dos pinos de insecto, uma agulha feito de um fio de tungsténio 21 pode ser útil. A agulha pode ser incorporado em uma ponta de pipeta através de aquecimento para uso como uma agulha de dissecação.
    4. Sob um microscópio de dissecação, fazer uma pequena incisão perto da cauda com micro tesoura. A partir da incisão, cortar a cutícula dorsal longitudinalmente ao longo da linha média dorsal, na direcção da cabeça. Tenha cuidado para não danificar os tecidos sob a cutícula.
    5. Esticar a cutícula bodywall em cada lado e colocar 4 pinos em cada canto do bodywall dissecados.
    6. Remover uma porção de corpo gordo anterior com uma pinça, para expor o cérebro-RG complex ser expostos na superfície. Remover um par de glândulas salivares, se necessário.
  4. A fixação e a coloração do tecido com imuno-histoquímica
    1. Coloque a anterior um terço dos corpos larvares (passo 1.2.2) num microtubo de 1,5 mL cheio com 500 uL da solução de correcção (4% de paraformaldeído em PBS). Fix menos do que 20 amostras de uma só vez, de outra forma PBS ligados às amostras fixas pode causar uma diluição desfavorável do fixador. Para dissecção filé, remover uma gota de PBS e, em seguida, adicione uma gota de solução de correção.
      NOTA: Para a solução correcção, podem ser usados ​​quer 3,7% de formaldeído ou paraformaldeído a 4%.
    2. Incubar os tecidos dissecados na solução de correcção para 30 min à temperatura ambiente (TA) ou alternativamente durante 2 horas a 4 ° C.
    3. Substituir a solução correcção com 500 uL de PBS e rapidamente enxaguar as amostras 3 vezes. Lavam-se as amostras com 500 uL de 0,3% de PBT (PBS + 0,3% de etoxilato de octilfenol) durante 15 min num agitador rotativo a RT. Por dissecção filete, remover os pinos de insectos e de transferir as amostras num microtubo de 1,5 mL.
      NOTA: Para aumentar a permeabilidade de anticorpos para os tecidos, as amostras são tratadas com 500 uL de 2,0% de PBT durante 1-2 h num agitador rotativo à temperatura ambiente.
    4. Substituir PBT com 500 ul de solução (2% de albumina de soro bovino em PBT) de bloqueio. Incubar as amostras durante 1,5 horas num agitador à temperatura ambiente.
    5. Substituir a solução de bloqueio com 50 uL da solução de anticorpo primário, ou seja, anticorpos diluídos em solução de bloqueio.
    6. Incubar as amostras durante a noite num agitador rotativo a 4 ° C.
    7. Substituir a solução de anticorpo principal com 500 uL de 0,3% de PBT e rapidamente enxaguar as amostras 5 vezes. Lavam-se as amostras 3 vezes com 500 uL de 0,3% de PBT durante 15 min cada em um balanceiro, à TA.
    8. Substituir 0,3% de PBT com 50 uL da solução de anticorpo secundário (conjugado com corante anticorpos diluídos em solução de bloqueio). Para coloração nuclear, 0,5 mL de 4' , 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, 0,1 mg / mL de soluo stock) é adicionado à solução de 50 mL. Incubar as amostras num agitador rotativo durante 2 h à TA ou, alternativamente, a 4 ° C durante a noite.
      Nota: Mantenha as amostras no escuro.
    9. Substituir a solução de anticorpo com 500 uL de 0,3% de PBT e lavar 5 vezes. Lavam-se as amostras 3 vezes com 500 uL de 0,3% de PBT durante 15 minutos cada à temperatura ambiente.
  5. Dissecção fina do complexo cérebro-RG contendo o PG e de montagem
    1. Usar uma pipeta descartável para transferir as amostras imunocoradas para um prato cheio com 0,3% de PBT.
      NOTA: Para evitar bolhas inconvenientes durante a dissecção e montagem, 0,3% de PBT pode ser substituído com PBS.
    2. Sob um microscópio de dissecação, segurar a cutícula ou boca de gancho com um par de pinças. Usando uma agulha de 27 G ligada a uma seringa de 1 mL como uma "faca", corte a ponta anterior dos discos do esófago e do olho para remover o complexo disco-RG-olho cérebro de cutícula corpo.
    3. Sepaclassificar o esófago e do intestino do complexo disco-RG-olho cérebro com uma pinça. Uma vez que o esófago passa através do cérebro de cima do cordão nervoso ventral (VNC), retirar o intestino para o lado posterior.
      NOTA: Para remover discos imaginais extras das amostras, cortar as ligações entre o cérebro, os discos oculares, e discos de perna com uma faca de agulha.
    4. Repetir os passos 1.5.1-1.5.4 para outras amostras.
      NOTA: Para evitar restos de tecido adira às amostras, transferir cada amostra completada para um prato limpo diferente cheio com 0,3% de PBT ou PBS.
    5. Transferir as amostras para o centro de uma lâmina de vidro limpa com uma micropipeta.
      NOTA: Para o 2º ou 3º larvas instar, no final de uma ponta de micropipeta deve ser truncado com uma lâmina de barbear.
    6. Sob um microscópio de dissecação, alinhar amostras individuais com o seu lado dorsal para cima, utilizando fórceps.
      NOTA: O RG está localizado no lado dorsal do cérebro (Figura 2A). Este alinhamento facilita a especificação de amostras individuais durante a imagiologia.
    7. Incline uma lâmina de vidro e limpe tanto o excesso de PBT possível. Colocar uma gota de reagente de montagem sobre um lado da lâmina. Coloque a extremidade de uma lamela de cobertura a partir do outro lado da gota e colocar a lâmina de cobertura sobre as amostras lentamente com uma pinça.
      NOTA: Este procedimento evita que as amostras de mover-se fora da lamínula.
    8. Armazenar as amostras a 4 ° C. Mantenha as amostras no escuro.

2. A dissecção do Ovário em As fêmeas adultas

  1. Preparação de fêmeas adultas
    1. Alimentação fêmea moscas com comida padrão mosca levedura / farinha de milho por 3-4 dias para engordar o ovário. Manter a 25 ° C.
  2. Dissecção do ovário da fêmea adulta
    1. Anestesiar fêmea voa com CO2 gasoso e cortar suas cabeças.
    2. Transferir corpos de voar para a 3 cm de discocheio com PBS.
    3. Sob um microscópio de dissecação, mantenha o tórax no lado dorsal usando uma pinça. Agarrar a A5 segmento abdominal ou A6 com os outros fórceps e descascar a cutícula abdominal para o lado posterior. Limpe a cutícula pegajoso entre a ponta do fórceps.
    4. Beliscar um oviduto e tirar o ovário a partir do corpo.
    5. Pentear e espalhar as pontas do ovário com uma pinça.
      NOTA: Esta operação melhora a eficiência da imunocoloração.
  3. Dissecção de cérebro feminino adulto, VNC e órgãos reprodutivos.
    NOTA: Este método permite a inervação do ovário para ser mantida intacta.
    1. Anestesiar fêmea voa com CO2 gasoso e transferi-los para um prato revestido de silicone enchida com PBS.
    2. Sob um microscópio de dissecação, segure a tromba e descascar a cutícula cabeça para expor o cérebro com uma pinça. Remover a traquéia anexado ao cérebro.
      NOTA: O brain é uma estrutura branca e arredondada. O cérebro se conecta à VNC no tórax.
    3. Mantenha o tórax no lado dorsal e cortar as pernas e asas com um par de fórceps. Usando o outro par de fórceps, descascar a cutícula tórax ventral a partir das bases das pernas. Uma vez que o VNC é exposto, remover a cutícula dorsal residual e músculos ligados aos VNC utilizando fórceps. Tenha cuidado para não danificar a conexão entre o cérebro eo VNC.
    4. Use uma pinça para descascar a cutícula abdominal e expor o ovário e seus órgãos interativas, incluindo neurônios, a cultura, o intestino, o oviduto, o útero e glândula accessary.
    5. Remover os tecidos residuais incluindo a traqueia e o corpo gordo usando uma pinça.
  4. A fixação e a coloração do tecido com imuno-histoquímica
    1. Transferir cerca de 8-10 pares dos ovários para um microtubo de 1.5 ml, cheio com 250 uL da solução de correcção (4% paraformaldehyde em PBS) e incuba-se as amostras durante 30 min à TA.
    2. Substituir a solução correcção com 500 uL de PBS e rapidamente enxaguar as amostras 3 vezes.
    3. Lavam-se as amostras 2 vezes com 500 uL de 0,1% de PBT durante 5 minutos cada à temperatura ambiente.
    4. Substituir PBT com 50 ul de solução de bloqueio. Incubar as amostras durante 1 h num agitador rotativo à temperatura ambiente.
    5. Substituir a solução de bloqueio com 50 uL da solução de anticorpo primário.
    6. Incubar as amostras durante a noite num agitador rotativo a 4 ° C.
    7. Substituir a solução de anticorpo principal com 500 uL de 0,1% de PBT. Lavam-se as amostras 3 vezes com 500 uL de 0,1% de PBT durante 15 min cada em um balanceiro, à TA.
    8. Substituir 0,1% de PBT com 50 ul solução de anticorpo secundário. Para coloração nuclear, adiciona-se 0,5 mL de DAPI a 50 mL da solução. Incubar as amostras durante 2 horas num agitador à temperatura ambiente.
    9. Substituir a solução de anticorpo secundário com 500 uL de 0,1% de PBT. Lavam-se as amostras 3 vezes com 500 uL de 0,1% de PBT durante 15 min cada em um balanceiro, à TA.
      NOTA: O procedimento de lavagem pode ser realizado a 4 ° C durante a noite. Mantenha as amostras no escuro.
  5. Montagem das amostras em lâminas de vidro
    1. Transferir as amostras para uma placa de vidro com 0,1% de PBT utilizando uma micropipeta.
      NOTA: Para evitar bolhas inconvenientes durante a dissecção e montagem, 0,1% de PBT pode ser substituído com PBS.
    2. Para o ovário, separar as cadeias dos ovarioles um do outro com uma pinça sob um microscópio de dissecação. Não ferir as pontas dos ovarioles contendo os germaria. Para o complexo de órgãos-cérebro-VNC reprodutiva, remover a cutícula residual e providenciar a posição sobre uma lâmina de vidro.
    3. Limpe tanto PBT excesso quanto possível e colocar uma gota de reagente de montagem no centro das amostras. Coloque uma lamela lentamente usando uma pinça.
    4. Armazenar as amostras a 4 ° C. Mantenha as amostras no escuro.
"> 3. De imagem com uma digitalização microscópio confocal laser

  1. Observe as amostras sob o microscópio e trazer os órgãos esteroidogênicas no campo de visão. Uma vez que a visão é fixo, mude o sistema de imagem para o modo de aquisição de imagem.
    NOTA: Os 10-20x lentes objetivas são usados ​​para obter as imagens do complexo cérebro-RG ou todo o ovário. Alternativamente, as lentes objectivas 40-63X (água ou imersão em óleo) são utilizados para visualizar a localização subcelular de proteínas em GSCS ou os inervação neuronal do PG e do ovário.
  2. Configurar os parâmetros de aquisição de imagem no software anexado. Seleccionar a combinação de fluorescência (por exemplo, GFP e RFP). Pelo procedimento de digitalização rápido, ajustar a potência do laser, a sensibilidade dos detectores (Ganho / Offset), e o tamanho da pinhole.
    NOTA: Para obter imagens em alta qualidade, a potência do laser de varredura e da sensibilidade do detector (Gain) deve ser otimizado para cada amostra. Para delinear a formados tecidos, uma luz transmitida-imagem pode ser feita em adição a uma imagem fluorescente.
  3. Leve pilhas Z das imagens. Durante uma verificação rápida e contínua, mover-se no plano focal com a unidade de focagem do microscópio e definir a posição inicial e a posição final. O número de fatias e a distância do intervalo entre as fatias são ajustadas em conformidade.
  4. Seleccione a velocidade de digitalização, o método de verificação, e o modo de digitalização bidirecional.
  5. "Iniciar os exames real" para a aquisição de imagem.
  6. Salvar a imagem com o formato do software anexado.
    NOTA: Os arquivos de imagem originais contêm a informação de parâmetros de aquisição de imagem e escalas. Imagens exportadas podem ser processados usando um software de processamento de imagem no computador 22.

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Representative Results

Foram utilizados os protocolos acima para visualizar os órgãos esteroidogênicas e seus órgãos interativos em D. melanogaster larvas e adultos do sexo feminino. O esquema geral de protocolos é mostrado na Figura 1.

O RG, incluindo a PG (Figura 2D), é menor e mais transparente do que o cérebro e situa-se no lado dorsal anterior do cérebro (Figura 2A-C e 3A-E). Para marcar as células PG, vários grupos têm gerado vários tipos de anticorpos contra enzimas ecdysteroidogenic (isto é, Neverland 23, spookier 24, tampa 20, 25 Fantasma, Desencarnada 25, e 26 de sombra). Entre eles, anti-Mortalha (Sro) anticorpo é fiavelmente utilizado para marcar o PG por imunocoloração (Figura 2C, 2E, e 3C). Alternativamente, o binary sistema de expressão do gene, GAL4 sistema 27 / UAS, pode ser utilizado para expressar genes de proteínas fluorescentes em células PG. Através da análise do promotor do gene fantasma ecdysteroidogenic (PHM), o promotor específico de PG pode induzir a expressão do gene exclusivamente no PG 28. Portanto, as células de PG pode ser especificamente visualizado por expressando GFP ou RFP sob o controlo de PHM-GAL4 # 22 (Figura 3D).

Para visualizar a ligação neuronal entre o PG e o cérebro, um grupo de neurónios podem ser marcados com mCD8 :: GFP sob o controlo de vários controladores e anticorpos GAL4 (Figura 2C, 2E, 3D e 3E). A base de dados flylight de colecções de linha de GAL4 é optimizado para neurónios de etiquetagem 29. Entre eles, GMR45C06-GAL4 etiquetas neurónios (Figura 2C e E) PG-se projecta. o immunostaining de larvas -expressing GFP com anticorpo anti-GFP é eficaz na melhoria de sinais GFP. Além disso, TRH-GAL4> mCD8 :: larvas GFP mostrar o sistema nervoso stomatogastric, em que os neurônios serotoninérgicos projeto, não só para o PG, mas também para o proventrículo (PV, foregut inseto) e os músculos da faringe (PM) (Figura 3D e E) 20, 30. Portanto, é essencial para manter a posição do RG, o cérebro, e os outros tecidos circundantes durante a dissecção de filete (Figura 3).

Em fêmeas adultas, ecdiesteróide ovário afecta muitos aspectos da oogese, tais como a proliferação SGC, diferenciação cisto, o crescimento da câmara de ovo, e resposta ao estresse 11. Tal como no PG, enzimas ecdysteroidogenic no ovário também são visualizados com os anticorpos específicos acima descritos 12, 31.Como um evento a jusante sobre o qual ecdisteróides ato, o número de GSCS na germário é o foco (Figura 4). Embora o germário é uma montagem de vários tipos de células, GSCS são especificados por imunocoloração com dois anticorpos marcadores GSC, 1B1 e D a E-caderina 32. Para visualizar a inervação do ovário, do ovário é dissecado juntamente com o cérebro, VNC, intestino, colheita, útero, e spermatheca (Figura 5). Os neurónios são visualizados por mCD8 :: GFP sob o controlo de nSyb-GAL4, um controlador de pan-neuronais (Figura 5B e D). Músculos em torno do ovário, útero, e intestino são coradas com faloidina conjugado com corante.

figura 1
Figura 1: O esquema geral de protocolos. Dois métodos de dissecação são distintos appliccapaz de larvas e fêmeas adultas, dependendo da finalidade dos experimentos. Os métodos de montagem também são concebidos de acordo com as condições da amostra. Fixação, coloração, e técnicas de imagem são, basicamente, comum a todas as amostras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Visualização da PG e os neurónios projectam-PG. (A e B) A glândula cérebro-anel (RG) de complexo de tipo selvagem instar larva 3 rd. Em (B), o PG é descrita por linhas a tracejado. A estrutura filamentosa entre o cérebro e o RG é a traqueia. (C - E) A inervação do PG foi visualizado com mCD8 ::GFP conduzido por GMR45C06-GAL4 na coleção flylight. Os neurónios PG e positivas para GFP foram marcadas com anticorpo anti-Sro (magenta) e anticorpo anti-GFP (verde), respectivamente. A imagem fluorescente é mesclada com a imagem-luz transmitida para especificar o contorno dos tecidos. Em (D), o PG, a corpora Allata (CA) e a corpora cardiaca (CC) estão ilustradas. Os neurônios projectam-PG são mais proeminentes na imagem de alta potência com 40X lente da objectiva (setas em E) do que a imagem de baixa potência com 10X lente objectiva (C). Barra de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: As Stomatogastric Projectos do sistema nervoso para a PG, o PV, uma nd o PM. (A e B) A dissecção filete de um tipo selvagem instar larva 3 rd. As posições do PG, cérebro (BR), cordão nervoso ventral (VNC), discos oculares (ED), os discos de asa (WD), faringe muscular (PM), e proventriculus (PV) permanecem intactos. (C) O PG foi exclusivamente marcada com anticorpo anti-Sro (magenta). (D) O PG foi marcado com turboRFP impulsionado por PHM-GAL4 # 22. neurónios serotoninérgicos 5HT foram marcadas com anti-anticorpos (verde). (E) O sistema nervoso estomatogástrico foi visualizado com mCD8 :: GFP conduzida pelo TRH-GAL4. neurônios serotoninérgicos projetar para o PG, o PM, eo PV (setas). A barra de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: A Germaria de moscas do tipo selvagem contendo um, dois, ou três GSCS. (A) Uma visão geral do órgão reprodutor feminino. Um ovário é composto por 16-20 ovarioles que são cordas de câmaras de ovos. O germário, onde GSCS estão localizados, é na ponta de cada ovaríolo. (B - d) um, dois, ou três GSCS estão localizados em cada germário (círculos brancos pontilhadas) das fêmeas do tipo selvagem. GSCS são coradas com anticorpo 1B1 (verde), que rotula uma estrutura esférica chamado as spectrosome (setas) e uma estrutura do citoesqueleto membranosa conhecido como o fusoma. Os limites da célula são visualizadas com anticorpo D E-caderina anti- (magenta). A barra de escala = 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

"Fo: manter-together.within-page =" 1" > Figura 5
Figura 5: os órgãos reprodutivos femininos e seus Órgãos interativos. (A) O ovário (Ov), intestino (intestino), culturas (Cr), cérebro (BR), cordão nervoso ventral (VNC), e spermatheca (Sp) foram dissecados sob o microscópio. (B - D) A inervação do ovário foi visualizado com mCD8 :: GFP conduzida pelo nSyb-GAL4. neurónios GFP positivas estendem-se desde o VNC (seta), que se projecta para a superfície dos ovários (setas). Os ovários são descritos por linhas tracejadas. As amostras foram coradas com anticorpo anti-GFP (verde) e conjugado com corante faloidina (magenta). Faloidina associados com a actina filamentosa de músculos em torno dos ovários (OV) e útero (Ut). A ilustração é mostrado em C. A Barra de escala = 200 pm.rge.jpg" target = '_ blank'> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Foram estudados biossíntese ecdiesteróide e o seu mecanismo de regulação em D. melanogaster, e concebido um protocolo para a dissecção e imunocoloração. A temporização da biossíntese de ecdiesteróide é afectada por sinais ambientais através das entradas 33 neuronais, por isso, é essencial para a manutenção da inervação dos órgãos ecdysteroidogenic juntamente com o cérebro, VNC, e outros tecidos durante a dissecção.

Como descrito acima, o de D. melanogaster PG RG forma um órgão endócrino complexo com o Allata corpora (CA) e a cardiaca corpora (CC) (Figura 2D). Enquanto o PG produz ecdisteróides, a CA e CC produzir hormonas juvenis e hormona adipokinetic, respectivamente. Esta propriedade anatômica tem sido um impedimento para pesquisadores que estudam ecdysteroidogenesis em D. melanogaster, em comparação com outros insectos. No entanto, nas últimas décadas, voar genética has permitiu-nos identificar muitos genes ecdysteroidogenic que são especificamente expressas no PG 4. Estes genes são também expressas em células enfermeira ou células do folículo do ovário 34, 35. Agora pode-se usar um único conjunto de perfis de expressão gênica em órgãos ecdysteroidogenic, tornando possível para especificar células ecdysteroidogenic por imunocoloração e técnicas transgênicas.

Durante a dissecção, é essencial usar uma pinça fina com bordas afiadas. Antes de dissecação, as bordas dos fórceps pode ser afiada com uma pedra de amolar Arkansas para trazer junto as bordas sem quaisquer lacunas. Durante a dissecção, detritos ou os tecidos residuais, tais como a gordura corporal, o intestino, e os discos imaginais, deve ser removido tanto quanto possível. Em particular, pedaços do corpo gordura facilmente manter o tecido de interesse. Além disso, a montagem das amostras em lâminas de vidro, também deve ser executared cuidadosamente. Um complexo de tecidos pode ser perturbada quando uma lamela de cobertura é colocada sobre as amostras em meio de montagem pegajoso. Portanto, um número suficiente de amostras deve ser dissecado, e as amostras adequadas deve ser escolhido para imagiologia, tais como aqueles em que o GR ou o ovário está no lado superior e as ligações neuronais permanecer intacto.

Para realizar a imunocoloração bem sucedida e para obter os resultados reprodutíveis, é crítico para manter as mesmas condições para os processos de amostragem e de manutenção. A extensão da imunocoloração altamente depende da condição de cada animal no momento da amostragem e fixação. Por exemplo, a idade dos animais, as temperaturas de criação, condição de nutrientes, e o tempo de dissecção deve ser cuidadosamente considerada. Para minimizar os erros de manipulação de fixação em vários experimentos, mantemos cuidadosamente quase igual número de amostras para coordenar o tempo de dissecção e tempos de reação de fixação. Para a fixação solução, paraformaldeído a 4% ou 3,7% de formaldeído é usado. Porque paraformaldeído é rapidamente degradado ao longo do tempo, a sua pó é geralmente dissolvido para dar uma solução estoque a 10% em PBS, e as alíquotas são armazenadas a -20 ° C. As aliquotas são descongeladas para tornar a solução fresca solução de 4%, antes de cada dissecção. Além disso, os extensos passos de lavagem de amostras de reduzir a coloração de fundo não específico.

Na etapa de aquisição de imagem, seguimos o protocolo do fabricante para microscopia confocal. O sistema de microscopia fornece uma interface amigável para os pesquisadores ou estudantes, de tal forma que os conjuntos ideais de filtros de excitação / emissão são automaticamente selecionados quando são especificados os tipos de fluoróforo. Enquanto o sistema de microscopia é fácil de usar, é preciso otimizar os parâmetros de aquisição de imagem em cada amostra ou cada plano focal, alterando o ganho do detector, velocidade de digitalização, números de digitalização e o tamanho pinhole.

36. Para superar este problema, a técnica knock-in pode ser aplicada para inserir um HA-tag no locus do gene da placa do ouija usando o sistema CRISPR / cas9. Ao usar tais técnicas transgénicas em combinação com a imunocoloração, pelo menos, 3-4 proteínas pode ser visualizado simultaneamente no PG ou o ovário. Em contraste com a localização de proteínas, no entanto, um método para visualizar ecdisteróides endógenos por imunocoloração não foi estabelecida. Uma vez que o anticorpo anti-ecdiesteróide está disponível para a imunocoloração, as localizações subcelulares de biossíntese ecdiesteróide e o transporte de ecdiesteróide pode ser investigado no futuro. Outra limitação é que as dinâmicas temporais de ecdysteroidogenesis não pode ser examinado em tecidos fixados. Considerando-se que o tulo de ecdiesteróide é oscilado ao longo das fases de desenvolvimento, a actividade dos órgãos ecdysteroidogenic e os neurónios que se projectam deve ser temporalmente regulados em resposta a vários estímulos ambientais. Um estudo recente monitorou o Ca 2+ dinâmica das células PG usando técnicas de imagem ao vivo 37. Para futuras aplicações, que estão actualmente a desenvolver um protocolo para a imagiologia vivo de PG ou ovários cultivadas juntamente com os seus neurónios que se projectam. No que diz respeito aos métodos existentes, este novo protocolo destina-se a visualizar a actividade de neurónios e seus órgãos alvo simultaneamente. Uma vez que a actividade dos neurónios pode ser monitorizado com o indicador de Ca2 + GCaMP ou Cameleon 38, que pode ser manipulado com abordagens optogenetic ou termogênico no momento oportunoS 39. Estes métodos contribuir para uma compreensão abrangente do esteróide biossíntese de hormônios e seu mecanismo de regulação neuronal.

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Disclosures

Nenhum conflito de interesses declarado.

Acknowledgments

Agradecemos Reiko Kise e Tomotsune Ameku por seu apoio técnico para este trabalho. Também somos gratos a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, o Bloomington Drosophila da Center, Kyoto Stock Center (DGRC), e os estudos de desenvolvimento Hibridoma Bank for stocks e reagentes. Este trabalho foi apoiado por subsídios para YSN de JSPS KAKENHI Grant Número 16K20945, a Fundação Naito, e Inoue Research Award Ciência; e por uma doação para RN de MEXT KAKENHI Grant Número 16H04792.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
egg collection
tissue culture dish (55 mm) AS ONE 1-8549-02  for grape-juice agar plates
collection cup HIKARI KAGAKU
yeast paste Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) SARSTEDT 58.487
disposable loop AS ONE 6-488-01
standard fly food  the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
dissecting microscope Leica S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) IWAKI 1000-035
Sylgard TORAY coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)  TERUMO NN-2719S A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5 Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter) Shiga Brand for fillet dissection
micro scissors NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.  MB-50-10
fixation
ultrapure water Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde Nacalai tesque 16222-65
Paraformaldehyde Nacalai tesque 02890-45
Triton-X100 Nacalai tesque 35501-15
microtubes (1.5 ml) INA OPTIKA CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker) As one TM-300 rocker
Bovine Serum Albumin SIGMA 9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000 Molecular Probes A6455 Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 Nakarai tesque 04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500 SIGMA S5545
anti-Hts 1B1 (mouse) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 DSHB DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50 DSHB nc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin Life Technologies A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. SS7213
Square microscope cover glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent) Calbiochem 345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) WATSON 5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope system Carl Zeiss inverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN Carl Zeiss It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

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Imura, E., Yoshinari, Y., Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (122), e55519, doi:10.3791/55519 (2017).

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