हम विच्छेदन, निर्धारण, और ड्रोसोफिला लार्वा और वयस्क महिलाओं में steroidogenic अंगों स्टेरॉयड हार्मोन जैव संश्लेषण और उसके नियामक तंत्र का अध्ययन करने के immunostaining के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। steroidogenic अंगों के अलावा, हम इस तरह के germline स्टेम कोशिकाओं के रूप में steroidogenic अंगों की इन्नेर्वतिओन के साथ-साथ steroidogenic लक्ष्य कोशिकाओं कल्पना।
बहुकोशिकीय जीव में, कोशिकाओं के एक छोटे समूह उनके biogenic गतिविधि में एक विशेष समारोह के साथ संपन्न है, विकास और प्रजनन के लिए एक प्रणालीगत प्रतिक्रिया उत्प्रेरण। कीड़ों में, लार्वा prothoracic ग्रंथि (पीजी) और प्रिंसिपल स्टेरॉयड हार्मोन ecdysteroids बुलाया biosynthesizing में वयस्क मादा अंडाशय खेलने आवश्यक भूमिका। ये ecdysteroidogenic अंगों तंत्रिका तंत्र, जिसके माध्यम से जैव संश्लेषण के समय पर्यावरण संकेतों से प्रभावित होता है से आच्छादित कर रहे हैं। यहाँ हम ecdysteroidogenic अंगों और लार्वा में अपने इंटरैक्टिव अंगों और फल के वयस्कों visualizing मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, जो स्टेरॉयड हार्मोन जैव संश्लेषण और उसके नियामक तंत्र के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली प्रदान करता है के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। निपुण विच्छेदन हमें मस्तिष्क, उदर तंत्रिका कॉर्ड, और अन्य ऊतकों सहित ecdysteroidogenic अंगों के पदों और उनके इंटरैक्टिव अंगों को बनाए रखने की अनुमति देता है। एक साथ Immunostainingecdysteroidogenic एंजाइमों के खिलाफ ntibodies, ऊतक विशेष प्रमोटरों द्वारा संचालित ट्रांसजेनिक प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ साथ, ecdysteroidogenic कोशिकाओं लेबल करने के लिए उपलब्ध हैं। इसके अलावा, ecdysteroidogenic अंगों का आच्छादन भी विशिष्ट एंटीबॉडी या GAL4 ड्राइवरों न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार में का एक संग्रह से लेबल किया जा सकता। इसलिए, ecdysteroidogenic अंगों और उनके न्यूरोनल संपर्कों immunostaining और ट्रांसजेनिक तकनीक के द्वारा एक साथ देखे जा सकते हैं। अंत में, हम कैसे germline स्टेम सेल, जिसका प्रसार और रखरखाव ecdysteroids द्वारा नियंत्रित कर रहे कल्पना करने के लिए का वर्णन। इस विधि स्टेरॉयड हार्मोन जैव संश्लेषण और उसके न्यूरोनल नियामक तंत्र की व्यापक समझ के लिए योगदान देता है।
बहुकोशिकीय जीव में, कोशिकाओं का एक समूह उनके biogenic गतिविधि में एक विशेष समारोह है कि पूरे शरीर के लिए आवश्यक है के साथ संपन्न है। उनके मिशन को पूरा करने के लिए, प्रत्येक ऊतक या अंग उनके कार्यों से संबंधित जीन की एक श्रृंखला को व्यक्त करता है और विकास के संदर्भ में उनकी गतिविधियों रच के अन्य ऊतकों के साथ संचार। इस तरह के विशेष सेलुलर कार्यों और अंतर-अंग बातचीत को चिह्नित करने के लिए, हम कोशिकाओं के अन्य प्रकार बहुकोशिकीय वास्तुकला में बरकरार रखा जा रहा है के साथ कोशिकाओं का एक समूह निर्दिष्ट करने के लिए की जरूरत है।
इस तरह के विशेष अंगों का एक उदाहरण एक steroidogenic अंग है, जहां कई biosynthetic एंजाइमों सक्रिय स्टेरॉयड हार्मोन 1 से कोलेस्ट्रॉल से रूपांतरण चरण मध्यस्थता है। इन एंजाइम जीन के अधिकांश विशेष रूप से steroidogenic अंगों में व्यक्त कर रहे हैं, और biosynthesis मार्ग कसकर शारीरिक इनपुट और न्यूरोनल आदानों के माध्यम से कई बाहरी उत्तेजनाओं द्वारा विनियमित है। एक बारसंश्लेषित, स्टेरॉयड हार्मोन hemolymph में स्रावित होते हैं और जीन 2 की एक किस्म की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए कई ऊतकों और अंगों को लक्षित कर रहे हैं। इसलिए, एक स्टेरॉयड हार्मोन की कार्रवाई एक प्रणालीगत प्रतिक्रिया बनाए रखने के लिए समस्थिति, विकास, और प्रजनन प्रेरित करता है।
स्टेरॉयड हार्मोन जैवसंश्लेषण के कार्य करता है और स्टेरॉयड हार्मोन की pleiotropic कार्यों की जांच करने के लिए, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली के रूप में उपयोग किया जा सकता। लार्वा चरण के दौरान, कीट स्टेरॉयड हार्मोन, ecdysteroid, एक विशेष अंत: स्रावी अंग में biosynthesized है prothoracic ग्रंथि (पीजी) 3 कहा जाता है। पीजी में, कई ecdysteroidogenic एंजाइमों विशेष रूप से कई रूपान्तरण चरणों कोलेस्ट्रॉल से ecdysone को उत्प्रेरित है, जो उचित विकास के चरणों 4 पर molting और कायापलट नियंत्रित करता है। इसलिए, ecdysteroid अनुमापांक में एक गतिशील परिवर्तन नियंत्रित किया जाता हैपर्यावरण संकेतों के जवाब में कई संकेत दे रास्ते से। दूसरी ओर, वयस्क अवस्था में, ecdysteroid शरीर क्रिया विज्ञान में आवश्यक भूमिका, प्रजनन, नींद, स्मृति, और जीवन काल 5, 6, 7, 8 सहित निभाता है। यह ज्ञात है कि ecdysteroid सक्रिय रूप से अंडाशय में biosynthesized है oogenesis 6, 7, 8, 9, 10, 11 की प्रगति को विनियमित। हाल ही में हम सूचित किया है कि germline स्टेम सेल (GSCs) की संख्या संभोग के जवाब में ecdysteroid और सेक्स पेप्टाइड संकेत से प्रभावित होता है 12 उत्तेजना।
डी के शक्तिशाली उपकरण आनुवंशिकी और अच्छी तरह से एनोटेट जीनोम जानकारी सहित कोशिका जीव विज्ञान, मेलानोगास्टर, द्विआधारी जीनअभिव्यक्ति प्रणाली, और ट्रांसजेनिक आरएनएआई तकनीक, हमें सक्षम किया है, आवश्यक जीनों की पहचान करने के लिए पीजी और अंडाशय 13, 14, 15 में जैव संश्लेषण ecdysteroid करने के लिए। एक बार जब ecdysteroidogenic जीन की पहचान कर रहे हैं, इन जीनों और जीन उत्पादों की गतिशील स्थानीयकरणों की ट्रांस्क्रिप्शनल विनियमन biosynthesis मार्ग 16 में जांच की जा सकती। इस प्रयोजन के लिए मात्रात्मक-रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर, स्वस्थानी संकरण, और immunohistological विश्लेषण में शाही सेना आयोजित की जाती हैं। इन तकनीकों के आवेदन एक चुनौती भरा काम भी शामिल है, पीजी या अंडाशय की विस्तृत विच्छेदन। विशेष रूप से, फल मक्खी के पीजी अन्य कीड़ों की तुलना में अपेक्षाकृत छोटा होता है (उदाहरण के लिए रेशमकीट और झटका मक्खी), इसलिए एक फल के महत्वपूर्ण कौशल नमूने के लिए विच्छेदन के लिए उड़ान भरने का अभ्यास करने की जरूरत है। इसके अलावा, दोनों ecdysteroidogenic अंगों इन्नेर्वतिओन प्राप्तकेंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 17, 18, 19, 20 से रों। इस प्रकार, सही संरचनात्मक विश्लेषण के लिए, ecdysteroidogenic अंगों सीएनएस और अन्य अंगों, उनके न्यूरोनल संपर्कों को बाधित करने के लिए नहीं के साथ बरकरार रखा जाना चाहिए।
यहाँ हम विच्छेदन और डी में steroidogenic अंगों के दृश्य के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। मेलानोगास्टर। विच्छेदन तकनीक सीखना इन प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण शुरुआती बिंदु है। इसके अलावा, एक सफलतापूर्वक कई एंटीबॉडी और GAL4 ड्राइवर लाइनों के साथ steroidogenic अंगों के साथ ही उनके इंटरैक्टिव अंगों लेबल कर सकते हैं। इन तकनीकों, सामग्री, और आनुवंशिकी का फायदा उठाते हुए एक स्टेरॉयड हार्मोन जैवसंश्लेषण के व्यापक तंत्र का अध्ययन कर सकते हैं।
हम ecdysteroid जैवसंश्लेषण और डी मेलानोगास्टर में अपनी नियामक तंत्र का अध्ययन किया और विच्छेदन और immunostaining के लिए एक प्रोटोकॉल तैयार की। Ecdysteroid जैव संश्लेषण के समय न्यूरोनल आदानों 33 के माध्यम से पर…
The authors have nothing to disclose.
हम इस काम के लिए उनके तकनीकी सहायता के लिए रीको किस और Tomotsune Ameku धन्यवाद। हम यह भी केई इतो, ओल्गा एलेक्सेयेंको, अकीको Koto, मासायुकी मिउरा, ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र, क्योटो स्टॉक केंद्र (DGRC), और स्टॉक और अभिकर्मकों के लिए विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक के आभारी हैं। इस काम JSPS KAKENHI अनुदान संख्या 16K20945, नाइतो फाउंडेशन, और Inoue साइंस रिसर्च अवॉर्ड से Ysn को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया; और MEXT KAKENHI अनुदान संख्या 16H04792 से आर एन, को अनुदान द्वारा।
egg collection | |||
tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
rearing larvae | |||
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
dissection | |||
dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
fixation | |||
ultrapure water | Merck Millipore | ||
phosphate buffered saline (PBS) | |||
Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
Incubation | |||
As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
primary antibody | |||
anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
secondary antibody | |||
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
Mounting reagents | |||
Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
imaging | |||
LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
image processing | |||
LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
ImageJ | |||
Fly stocks | |||
w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
w[1118] | |||
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |