Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Протоколы Визуальное стероидогенных органов и их интерактивные Органов с иммунным окрашиванием плодовой мушки Published: April 14, 2017 doi: 10.3791/55519
Automatic Translation
*1, *1, *2, 3
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
* These authors contributed equally

Summary

Мы опишем протокол для рассечения, фиксации и иммунных стероидогенных органов у дрозофилы личинок и взрослые самок для изучения стероидного биосинтеза гормонов и его механизма регулирования. Помимо стероидогенеза органов, мы визуализируем иннервации стероидогенных органов, а также стероидогенеза клеток-мишеней, таких как зародышевые стволовые клетки.

Abstract

В многоклеточных организмах, небольшая группа клеток наделена специализированная функцией в их биогенной активности, вызывая системную реакцию на рост и размножение. У насекомых, личинок переднегрудная железа (PG) и взрослая женщина играют яичники существенной роль в биосинтезе основных стероидных гормонов, называемых Экдистероидами. Эти ecdysteroidogenic органы иннервируются от нервной системы, с помощью которой время биосинтеза пораженного сигналов окружающей среды. Здесь мы опишем протокол для визуализации ecdysteroidogenic органов и их интерактивных органов у личинок и взрослых плодовой мушки дрозофилы, которая обеспечивает подходящую модельную систему для изучения биосинтеза стероидных гормонов и его механизма регулирования. Умелое рассечение позволяет нам поддерживать позиции ecdysteroidogenic органов и их интерактивные органы, включая мозг, брюшную нервную цепочку, и другие ткани. Иммуноокрашивание сntibodies против ecdysteroidogenic ферментов, наряду с трансгенными белками флуоресценции, управляемых ткане-специфических промоторов, доступны для обозначения ecdysteroidogenic клеток. Кроме того, иннервации ecdysteroidogenic органов также могут быть помечены специфическими антителами или коллекцией GAL4 драйверов в различных типах нейронов. Таким образом, ecdysteroidogenic органы и их нейронные связи могут быть визуализированы одновременно иммунным окрашиванием и трансгенных методов. Наконец, мы опишем, как визуализировать зародышевые стволовые клетки, чье распространение и технические обслуживание контролируются экдистероидами. Этот метод способствует всестороннему пониманию стероидного биосинтеза гормонов и его нейронного механизма регулирования.

Introduction

У многоклеточных организмов, группа клеток обладают специализированной функцией в их биогенной деятельности, которая имеет важное значение для всего тела. Для выполнения своих задач, каждая ткань или орган выражает ряд генов, связанные с их функциями и взаимодействует с другими тканями, чтобы организовать свою деятельность в контексте развития. Для того, чтобы охарактеризовать такие специализированные клеточные функции и взаимодействие между органами, необходимо указать группу клеток, а также другие типы клеток быть сохранены в многоклеточных архитектурах.

Одним из примеров таких специализированных органов являются стероидогенным органом, где многие ферменты биосинтеза опосредуют стадию конверсии из холестерина в активные стероидных гормоны 1. Большинство из этих генов ферментов специфический экспрессируется в стероидогенных органах, а также путь биосинтеза жестко регулируются многими внешними стимулами через гуморальные входы и нейронные входы. однаждыСинтезированные, стероидные гормоны секретируются в гемолимфу и ориентированы на многие ткани и органы для регуляции экспрессии различных генов 2. Таким образом, действие стероидного гормона индуцирует системный ответ для поддержания гомеостаза, роста и размножения.

Для того, чтобы исследовать функции биосинтеза стероидных гормонов и плейотропных действия стероидных гормонов, дрозофилы могут быть использованы в качестве подходящей модельной системы. Во время личиночной стадии, насекомое стероидный гормон, экдистероидов, биосинтезируется в специализированном эндокринный орган называется проторакальной железы (PG) 3. В PG, несколько ecdysteroidogenic ферментов специфически катализировать несколько шагов преобразования из холестерина в экдизона, который управляет линьки и метаморфоза на соответствующих стадиях развития 4. Таким образом, динамическое изменение титра экдистероидов регулируетсямногие сигнальных пути в ответ на сигналы окружающей среды. С другой стороны, на стадии взрослого, экдистероидный играет существенную роль в физиологии, в то числе воспроизведения, сна, памяти, и продолжительностью жизни 5, 6, 7, 8. Известно , что экдистероиды активно синтезируются в яичниках, регулирующее прогрессирование оогенеза 6, 7, 8, 9, 10, 11. Недавно мы сообщали о том , что число зародышевых стволовых клеток (GSCs) зависит от экдистероидов и половой пептидной сигнализации в ответ на стимулы вязки 12.

Мощные инструменты дрозофилы генетики и клеточной биологии, в том числе хорошо аннотированной информации генома, двоичный генсистемы экспрессии и трансгенный RNAi метода, которые позволили нам идентифицировать гены , необходимые для экдистероидсодержащего биосинтеза в PG и яичник 13, 14, 15. После того , как ecdysteroidogenic гены идентифицированы, регуляция транскрипции этих генов и динамических локализации генных продуктов может быть исследована в пути биосинтеза 16. Для этой цели количественно-обратной транскрипции-ПЦР, РНК гибридизация и иммуногистохимического анализа проводятся в. Применение этих методов включает в себя сложную задачу; Сложное рассечение PG или яичника. В частности, PG из плодовой мушки относительно меньше , чем у других насекомых (например , шелкопряд и удар муха), поэтому нужно практиковать жизненно важный навык плодовой мушки рассечение для отбора проб. Кроме того, оба ecdysteroidogenic органы получают иннервациюы из центральной нервной системы (ЦНС) 17, 18, 19, 20. Таким образом, для точных анатомических анализов, ecdysteroidogenic органы должны быть сохранены вместе с ЦНС и другими органами, чтобы не нарушить их нейронные связи.

Здесь мы предлагаем протоколы вскрытия и визуализации стероидогенных органов в D. MELANOGASTER. Изучение техники рассечения является ключевой отправной точкой для этих экспериментов. Кроме того, можно успешно маркировать стероидогенные органы, а также их интерактивные органы с несколькими антителами и линиями драйвера GAL4. Пользуясь этими методы, материалов и генетики, можно изучать комплексные механизмы биосинтеза стероидных гормонов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Общая схема протоколов показана на рисунке 1.

1. Препарирование личиночной кольца железы (РГ)

Примечание: В D. MELANOGASTER, который принадлежит к cyclorrhaphous двукрылых, ПГ находится в пределах составной эндокринный орган называется кольцом железы (RG, фигура 2D). Так как это неосуществимо, что PG хирургическим путем отделены от других типов клеток (обсуждается ниже), практическая цель для выделения целой, неповрежденной RG путем рассечения.

  1. Получение личинок на соответствующих стадиях развития
    Примечание: Для того, чтобы синхронизировать стадии развития личинок Melanogaster Д., необходимо собрать яйца в узком временном окне и собирать личинок в соответствующие моменты времени.
    1. Сбор яиц в течение 2 ч на агаровой пластине винограда сок при температуре 25 ° С.
    2. Сбор недавно вылупились 1 Примечание: возраст личинок представлена ​​«часов после откладки яиц (Hael)», «часов после того, как люк (ХА)», или «часов после L3 шелушения (hAL3E)».
    3. В соответствующий момент времени, собирают личинки с поэтапными одноразовой пластиковой петлей, чтобы избежать нежелательного повреждения. Для того, чтобы свести к минимуму разницу в прогрессировании развития личинок возрастной стадии на 3 - й, собирать личинки INSTAR 2 - й на 70 Hael (48 ХА) и позволяют им линяют через 2 ч интервалами. Затем собирают личинка INSTAR 3 - я в течение 2 ч после шелушения L3; эта процедура дает 0-2 личинок hAL3E.
    4. Передача личинок в постановке блюда, заполненное фосфатный буферный солевой раствор (PBS).
    5. Промыть личинка с PBS для удаления остатков пищи из организма.
  2. Грубое рассечение личинок в апрепаровальная лупа
    1. Держите рот крючок личинки пинцета. Sever тела личинки на переднем одной трети длины тела с помощью микро ножницы.
    2. Удерживая обрезанный конец переднего личиночного тела с одной парой щипцов. Используя другую пару щипцов, аккуратно вставьте кончик головки по направлению к внутренней части корпуса; эта процедура превращается личиночной тело наизнанку.
      Примечание: Этот шаг может быть пропущен для рассечения 1 личинок го возраста ул.
    3. Повторите шаги 1.2.1-1.2.2 с дополнительными личинками в течение 5-10 мин.
      Примечание: Число личинок должно быть равно или меньше 20, чтобы сэкономить время для рассечения.
  3. Сопряжение рассечение личинок
    Примечание: Этот метод позволяет сохранить положение тканей остается нетронутым.
    1. Оставьте личинок в воде только в течение 1 ч. Личинки обездвижены из-за удушья.
    2. Поместите личинка спинной стороной вверх в капле PBS на покрытый кремниемблюдо, с его спинной стороной вверх.
      Примечание: Спинная сторона имеет 2 трахеи трубки, работающие в продольном направлении.
    3. Под микроскопом рассекает, вставить штифт насекомых в передний конец личинки с помощью щипцов. Stretch личиночной тело к задней стороне и положить второй штифт в заднем конце личинки.
      Примечание: В дополнении к штифтам насекомых, игла изготовлена из вольфрамовой проволоки может быть полезной 21. Игла может быть встроена в наконечнике пипетки путем нагревания для использования в качестве рассекает иглу.
    4. Под микроскопом рассекает, сделайте небольшой надрез около хвоста с микро-ножниц. Из разреза, вырезать спинной кутикулу продольно вдоль средней линии спины по направлению к голове. Будьте осторожны, чтобы не повредить ткани под кутикулой.
    5. Растягивают bodywall кутикулу на каждой стороне и поместите 4 контакта на каждом углу расчлененным bodywall.
    6. Удалить часть переднего тела жира с щипцами, чтобы обнажить мозг-RG громплекс подвергаться воздействию на поверхности. Удалить пару слюнных желез, если это необходимо.
  4. Фиксация и окрашивание ткани с иммуногистохимией
    1. Поместите переднюю одну треть личиночных органов (этап 1.2.2) в 1,5 мл микропробирки, заполненной 500 мкл раствора исправление (4% параформальдегида в PBS). Закрепить менее чем 20 образцов за один раз, в противном случае PBS, прикрепленных к неподвижным образцам могут привести к неблагоприятному разбавлению фиксатора. Для филе рассечение, удалить каплю PBS, а затем добавить каплю раствора починки.
      Примечание: Для исправления раствора, либо 3,7% формальдегид или 4% параформальдегид может быть использован.
    2. Инкубируйте рассеченные ткани в растворе исправления в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) или, альтернативно, в течение 2 ч при 4 ° С.
    3. Заменить исправления раствора с 500 мкл PBS и быстро ополоснуть образцов 3 раза. Промыть образцов с 500 мкл 0,3% PBT (PBS + 0,3% октилфенол этоксилата) в течение 15 мин на качалке при RТ. Для филе рассечение, удалить штифты насекомых и передачи образцов в 1,5 мл микропробирки.
      Примечание: Для повышения проницаемости антител в ткани, образцы обрабатывали 500 мкл 2,0% PBT в течение 1-2 часов на качалке при комнатной температуре.
    4. Заменить PBT 500 мкл блокирующего раствора (2% бычьего сывороточного альбумина в PBT). Инкубируйте образцы в течение 1,5 ч на качалке при комнатной температуре.
    5. Заменить блокирующий раствор с 50 мкл первичного раствора антитела, то есть антитела , разбавленные в блокирующем растворе.
    6. Инкубируйте образцы в течение ночи на качалке при 4 ° С.
    7. Заменить раствор первичного антитела с 500 мкл 0,3% PBT и быстро ополоснуть Образцы 5 раз. Промыть образцов 3 раза 500 мкл 0,3% PBT в течение 15 мин каждый раз на качалке при комнатной температуре.
    8. Заменить 0,3% PBT с 50 мкл вторичного антитела раствора (краситель-конъюгированные антитела, разбавленные в блокирующем растворе). Для получения ядерного окрашивания, 0,5 мкл 4' , 6-diamidino-2-фенилиндола (DAPI, 0,1 мг / мл исходного раствора) добавл ют к 50 мкл раствора. Инкубируйте образцы на качалке в течение 2 ч при комнатной температуре или, альтернативно, при 4 ° С в течение ночи.
      Примечание: Храните образцы в темноте.
    9. Заменить раствор антител с 500 мкл 0,3% PBT и промыть 5 раз. Промыть образцов 3 раза 500 мкл 0,3% PBT в течение 15 мин каждый раз при комнатной температуре.
  5. Точное рассечение мозга RG комплекса , содержащий PG и монтаж
    1. Используйте одноразовые пипетки для переноса образцов иммуноокрашивания блюда, заполненного 0,3% PBT.
      Примечание: Для того, чтобы избежать неудобных пузырей во время вскрытия и монтажа, 0,3% PBT может быть заменен на PBS.
    2. Под микроскопом рассекает, держать кутикулу или рот крючок с одной парой щипцов. С помощью иглы 27 G, прикрепленной к 1 мл шприца в качестве «ножа», вырезать передний кончик пищевода и глаза дисков для удаления диска комплекса мозга Р.Г. глаза от кутикулы тела.
    3. Sepaоценить пищевод и кишечник от диска комплекса мозга RG глаз с щипцами. Так как пищевод проходит через мозг над брюшной нервной цепочкой (VNC), вытащить кишку к задней стороне.
      Примечание: Для того, чтобы удалить лишние имагинальные диски из образцов, вырезать связи между мозгом, глазами дисками и дисками для ног с иглой ножом.
    4. Повторите шаги 1.5.1-1.5.4 для других образцов.
      Примечание: Для того, чтобы предотвратить мусор ткани от прилипания к образцам, передавать каждый заполненный образец на другую чистую чашку, наполненной 0,3% PBT или PBS.
    5. Передача образцов в центр чистого предметного стекла с микропипеткой.
      Примечание: для 2 - го или 3 - го личинок возрастной стадии, конец наконечника микропипетки должен быть усечен с лезвием бритвы.
    6. Под микроскопом рассекает, выровнять отдельные образцы с их дорсальной стороной вверх с помощью пинцета.
      Примечание: RG расположен на спинной стороне мозга (фигура 2А). Это выравнивание облегчает спецификацию отдельных образцов во время формирования изображения.
    7. Наклоните стекло и вытрите столько избытка PBT, насколько это возможно. Поместите каплю монтажным реагента на стороне слайда. Поместите край покровного стекла с другой стороны капли и положить покровный на образцах медленно пинцет.
      Примечание: Эта процедура предотвращает образцы от перемещения за пределы покровного стекла.
    8. Хранить образцы при температуре 4 ° С. Храните образцы в темноте.

2. Препарирование яичника в Взрослые самки

  1. Подготовка взрослых самок
    1. Подача женщина летит со стандартным Дрожжи / кукурузной зольной пищи в течение 3-4 дней, чтобы откормить яичник. Выдерживают при 25 ° С.
  2. Вскрытие взрослого женского яичника
    1. Обезболить женщина летит с CO 2 газом и отрезать им голову.
    2. Передача муху тела в 3 см блюдозаполнены PBS.
    3. Под микроскопом рассекает, держите грудную клетку на спинной стороне с помощью щипцов. Возьмитесь брюшным A5 или A6 сегмента с другим пинцетом и очистить от брюшной кутикулы по направлению к задней стороне. Протрите липкую кутикулу от кончика пинцета.
    4. Зажмите яйцевод и вынуть яичник из организма.
    5. Гребень и распространять кончики яичника с пинцетом.
      Примечание: Эта операция повышает эффективность иммунного окрашивания.
  3. Вскрытие взрослого женского мозга, VNC и репродуктивных органов.
    Примечание: Этот метод позволяет иннервация яичнике быть сохранена.
    1. Обезболить самка летит с СО 2 газ и передавать их на блюдо кремния покрытием , заполненный PBS.
    2. Под микроскопом рассекает, держать хобот и отслаиваться головой кутикулы подвергать мозг щипцами. Удалить трахею, прикрепленную к мозгу.
      Примечание: Braiп представляет собой белые и округлые структуры. Мозг подключается к VNC в грудной клетке.
    3. Держите грудную клетку на спинной стороне и отрезать ноги и крылья с одной парой щипцов. Используя другую пару щипцов, очистить от грудной клетки вентральной кутикулы от оснований ног. После того, как VNC подвергается, удалить остаточный спинной кутикулу и мышцы, прикрепленный к щипцов с помощью VNC. Будьте осторожны, чтобы не повредить связь между мозгом и VNC.
    4. Используйте пинцет, чтобы очистить от брюшной кутикулы и разоблачить яичник и их интерактивные органы, включая нейроны, культуры, кишечник, яйцевод, матка, и соучастник железу.
    5. Удалите остаточные ткани, включая трахею и жировое тело с помощью щипцов.
  4. Фиксация и окрашивание ткани с иммуногистохимией
    1. Передача около 8-10 пар яичников в 1,5 мл микропробирки, заполненной 250 мкл раствора FIX (4% paraformaldehyde в PBS) и инкубируют образцы в течение 30 мин при комнатной температуре.
    2. Заменить исправления раствора с 500 мкл PBS и быстро ополоснуть образцов 3 раза.
    3. Промыть образцов 2 раза с 500 мкл 0,1% PBT в течение 5 мин каждый при комнатной температуре.
    4. Заменить PBT с 50 мкл блокирующего раствора. Инкубируйте образцы в течение 1 ч на качалке при комнатной температуре.
    5. Заменить блокирующий раствор с 50 мкл раствором первичного антитела.
    6. Инкубируйте образцы в течение ночи на качалке при 4 ° С.
    7. Заменить раствор первичного антитела с 500 мкл 0,1% PBT. Промыть образцов 3 раза 500 мкл 0,1% PBT в течение 15 мин каждый раз на качалке при комнатной температуре.
    8. Заменить 0,1% PBT с 50 мкл раствора вторичного антитела. Для получения ядерного окрашивания, добавляют 0,5 мкл DAPI 50 мкл раствора. Инкубируйте образцы в течение 2 ч на качалке при комнатной температуре.
    9. Заменить вторичный раствор антител с 500 мкл 0,1% PBT. Промыть образцы 3 раза 500 мкл 0,1% PBT в течение 15 мин каждый раз на качалке при комнатной температуре.
      Примечание: Процедура промывки может быть сделано при 4 ° С в течение ночи. Храните образцы в темноте.
  5. Монтаж образцов на стеклянные слайды
    1. Передача образцов на предметное стекло с 0,1% ПБТ с помощью микропипетки.
      Примечание: Для того, чтобы избежать неудобных пузырей во время вскрытия и монтажа, 0,1% PBT может быть заменен на PBS.
    2. Для яичника, отдельные струны овариола друг от друга при помощи щипцов под микроскопом рассекает. Не травмировать кончики овариола содержащих germaria. Для мозга VNC-репродуктивные органы комплекса, удалить остаточную кутикулу и организовать позиции на предметном стекле.
    3. Сотрите столько избытка PBT, как это возможно, и поместить каплю монтажным реагента в центре образцов. Поместите крышку скольжения медленно с помощью щипцов.
    4. Хранить образцы при температуре 4 ° С. Храните образцы в темноте.
«> 3. Формирование изображений с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

  1. Обратите внимание на образцы под микроскопом и привести стероидогенные органы в поле зрения. После того, как зафиксировано, переключить систему формирования изображения в режиме захвата изображений.
    Примечание: 10-20X объективы используются для получения изображений мозга RG комплекса или всего яичника. В качестве альтернативы, 40-63X линзы объектива (вода или масло погружения) используется для визуализации внутриклеточной локализации белков в GSCs или нейрональной иннервации PG и яичника.
  2. Настройка параметров получения изображения на прилагаемом программном обеспечении. Выберите комбинацию флуоресценции (например , GFP и RFP). Путь быстрой процедуры сканирования, регулировать мощность лазера, чувствительность детекторов (Gain / Offset), и размер точечных.
    Примечание: Для получения изображений в высоком качестве, мощность лазерного сканирования и чувствительность детектора (Gain) должны быть оптимизированы для каждого образца. Для того, чтобы очертить формутканей, переданный свет изображение может быть сделано в дополнении к флуоресцентному изображению.
  3. Возьмите Z стеки изображений. Во время непрерывного быстрого сканирования, перемещение фокальной плоскости с фокусом приводом микроскопа и установить исходное положение и конечное положение. Количество срезов и интервал расстояние между ломтиками корректируются соответствующим образом.
  4. Выберите скорость сканирования, метод сканирования и режим двунаправленного сканирования.
  5. «Запуск реального сканирования» для получения изображения.
  6. Сохранить изображение в формате прилагаемого программного обеспечения.
    Примечание: Исходные файлы изображений содержат информацию о параметрах захвата изображений и весов. Экспортируемые изображения могут быть обработаны с использованием программного обеспечения для обработки изображений на компьютере 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы использовали вышеупомянутые протоколы для визуализации стероидогенных органов и их интерактивных органов в D. личинок MELANOGASTER и взрослых самках. Общая схема протоколов показана на рисунке 1.

РГ, в том числе PG (рис 2D), является меньшим и более прозрачной , чем мозг и находится в передне-спинной стороне мозга (фиг.2А-С и 3А-Е). Для того, чтобы пометить клетки PG несколько групп породили различные типы антител против ecdysteroidogenic ферментов (то есть, Неверленд 23, Spookier 24, 20, плащаницы Фантом 25, развоплощенных 25, и тени 26). Среди них, анти-Плащаница (СРО) антитела надежно используются для обозначения PG иммунного окрашивания (рис 2С, 2Е, и 3C). В качестве альтернативы, Binarу системы экспрессии гена, GAL4 / система БАСА 27, может быть использована для экспрессии генов флуоресцентных белков в клетках PG. На основе анализа промоторной ecdysteroidogenic гена фантома (МПН), ПГ-специфический промотор может индуцировать экспрессию гена исключительно в PG 28. Таким образом, клетки PG могут быть конкретно визуализировали путем экспрессии GFP или RFP под контролем PhM-GAL4 # 22 (рис 3D).

Для того, чтобы визуализировать нейронную связь между PG и мозгом, группа нейронов могут быть помечены mCD8 :: GFP под контролем различных GAL4 драйверов и антител (рис 2С, 2Е, 3D и 3Е). База FlyLight коллекций GAL4 линии оптимизирована для нейронов маркировки 29. Среди них, GMR45C06-GAL4 этикетка PG-проецирование нейронов (рис 2C и Е). имmunostaining из GFP -expressing личинок с анти-GFP антитела является эффективным в повышении GFP сигналов. Кроме того, ТРГ-GAL4> mCD8 :: личинка GFP показывает стоматогастральную нервную систему, в которой серотонинергические нейронах проект не только на PG, но также и к железистому (PV, нежелезистые насекомые) и глоточные мышцам (ТЧ) (рис 3D и Е) 20, 30. Поэтому крайне важно , чтобы поддерживать положение RG, головной мозг, а также другие окружающие ткани во время вскрытий фила (рисунок 3).

У взрослых самок, экдистероидную яичников влияет на многие аспекты оогенеза, такие как GSC пролиферации, дифференцировки кист, рост камеры яйца, и стрессовой реакции 11. Как и в PG, ecdysteroidogenic ферментов в яичнике также визуализировали с помощью специфических антител , описанных выше , 12, 31.Как нисходящее событие , на котором экдистероиды акта, количество GSCs в гермарии наш фокус (Рисунок 4). Несмотря на то, гермариях представляет собой сборку из нескольких типов клеток, GS определяются иммунным с двумя GSC маркерных антителами, 1B1 и D E-кадгерином 32. Для визуализации иннервации яичника, яичник рассекают вместе с мозгом, VNC, кишечника, кадрирование, матки и сперматекой (рис 5). Нейроны визуализировали mCD8 :: GFP под контролем nSyb-GAL4, пан-нейронального драйвер (рис 5B и D). Мышцы вокруг яичника, матки и кишечника окрашивают фаллоидином красителем конъюгированный.

Рисунок 1
Рисунок 1: Общая схема протоколов. Два различных метода рассечения являются приложив состоянии личинок и взрослых самок, в зависимости от цели эксперимента. Способы крепления также разработаны в соответствии с образцом условий. Фиксация, окрашивание, и фотографические методы являются в основном общими для всех образцов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Визуализация PG и PG-выступающими нейроны. (А и Б) Мозг кольцо железы (RG) комплексы дикого типа 3 - й возрастной стадии личинки. В (В), П. Г. очерчен пунктирными линиями. Нитевидные структуры между мозгом и RG является трахеи. (С - Е) иннервации PG визуализировали с mCD8 ::GFP движимый GMR45C06-GAL4 в коллекции FlyLight. В PG и GFP-позитивных нейронов были помечены анти-Sro антител (пурпурного) и анти-GFP антител (зеленый), соответственно. Флуоресцентное изображение объединяется с переданным светом изображением, чтобы определить контур тканей. В формуле (D), ПГ, то корпуса allata (СА) и корпуса cardiaca (CC) , проиллюстрированы. В PG-проецирование нейронов более заметны в изображении высокой мощности с 40Й объектива (стрелками Е), чем изображения с низким энергопотреблением с 10-кратным объективом (C). Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: стоматогастральная нервная система Проецирование PG, ФВ, й ПМ. (А и Б) филе рассечение дикого типа 3 - й возрастной стадии личинки. Позиции, PG мозг (Br), вентральный нерв шнур (VNC), глазные диски (ED), крыло диски (WD), глоточная мышца (ПМ) и железистый (PV) остаются нетронутыми. (C) PG был исключительно метили анти-Sro антител (пурпурные). (D) PG метили turboRFP управляется PhM-GAL4 # 22. Серотонинергические нейроны метили с анти-антителом 5НТА (зеленый). (E) стоматогастральных нервная система визуализировали с mCD8 :: GFP управляется TRH-GAL4. Серотонинергические нейроны проецируются на PG, ПМ, и PV (стрелка). Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Файлы / ftp_upload / 55519 / 55519fig4.jpg»/>
Рисунок 4: Germaria мух дикого типа , содержащих один, два или три GSCs. (А) Обзор женского репродуктивного органа. Яичник состоит из 16-20 овариола, которые являются строками из яичных камер. Гермарии, где расположена GSCs, находятся на конце каждой яйцевой трубки. (В - D) Один, два, или три GSCs расположены в каждой гермарии (белые кружки) пунктирные самок дикого типа. GSCs окрашивали антитело 1В1 (зеленый), который маркирует сферическую структуру, которая называется spectrosome (стрелка) и мембранный цитоскелет структура, известной как fusome. Границы клеток визуализировали с помощью анти - Д Е-кадгерина (пурпурного). Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

"ВОК: держать-together.within-страница =" 1" > Рисунок 5
Рисунок 5: женские половые органы и их интерактивные органы. (А) Яичник (Оу), кишечника (Gut), растениеводство (Cr), мозг (Br), вентральный нерв шнур (VNC) и сперматека (Sp) рассекали под микроскопом. (В - D) иннервации яичника визуализировали с mCD8 :: GFP управляется nSyb-GAL4. GFP-положительные нейроны простираются от VNC (стрелка), выступающих на поверхность яичников (стрелка). Яичники обведены пунктирными линиями. Образцы окрашивали анти-GFP антител (зеленый) и краситель-конъюгированный фаллоидин (пурпурный цвет). Фаллоидин ассоциированные с нитчатых актина мышц вокруг яичников (OV) и матки (Ut). Иллюстрации показаны на C. Шкала бар = 200 мкм.rge.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы изучали экдистероиды биосинтеза и его механизм регулирования в дрозофиле, и разработали протокол вскрытия и иммунное окрашивание. Сроки экдистероидов биосинтеза зависят от окружающей среды сигналов через нейронные входы 33, так что имеет важное значение для поддержания иннервации ecdysteroidogenic органов наряду с мозгом, VNC и другими тканями при вскрытии.

Как описано выше, дрозофилы ПГ образует сложный эндокринный орган RG с корпусами allata (CA) и корпуса cardiaca (CC) (рис 2D). В то время как PG производит экдистероиды, СА и СС производят ювенильные гормоны и адипокинетический гормон, соответственно. Это анатомическое свойство было препятствием для исследователей , изучающих ecdysteroidogenesis в D. MELANOGASTER, по сравнению с другими насекомыми. Тем не менее, в последние десятилетия, летать генетики гаs позволило определить многие ecdysteroidogenic генов , которые специфически экспрессируются в PG 4. Эти гены также экспрессируются в клетках или медсестра фолликулярных клеток яичника 34, 35. Теперь можно использовать уникальный набор профилей экспрессии генов в ecdysteroidogenic органах, что позволяет указать ecdysteroidogenic клетки иммунным окрашиванием и трансгенными методами.

Во время вскрытия, необходимо использовать тонкий пинцет с острыми краями. Перед вскрытием, края пинцетом могут быть заточены с Arkansas шлифовальным камнем, чтобы принести края вместе без каких-либо зазоров. Во время вскрытия, мусора или остаточных тканей, таких как жир тело, кишечник и имагинальных диски, должно быть удалено как можно больше. В частности, куски жира тела легко прилипают к интересующей ткани. Кроме того, крепление образцов на стеклянные слайды должны также выполнитьред тщательно. Комплекс тканей может быть растрепал, когда крышка скольжения размещается на образцах в клейкой монтажной среде. Таким образом, достаточное количество образцов должно быть расчленено, и подходящие образцы должны быть выбраны для формирования изображения, такие, как те, в которых РГ или яичник находится на верхней стороне и нейронные соединения остаются нетронутыми.

Для того, чтобы выполнить успешную иммунное окрашивание и получить воспроизводимые результаты, очень важно поддерживать одни и те же условия для процедур отбора проб и обработки. Степень иммуноокрашивания сильно зависит от состояния отдельных животных в момент выборки и фиксации. Например, возраст животных, подьем температуры, состояние питательного и время вскрытия должны быть тщательно продуманы. Чтобы свести к минимуму ошибки обработки фиксации в нескольких экспериментах, мы тщательно держать почти равное количество образцов для координации времени рассечения и времени реакции фиксации. Для фиксации сolution, используется 4% параформальдегида или 3,7% формальдегида. Поскольку параформальдегид быстро деградирует с течением времени, его порошок обычно растворяют, чтобы 10% исходного раствора в PBS, и аликвоты хранили при -20 ° C. Аликвоты разморожены, чтобы сделать свежий 4% раствор исправления перед каждым рассечением. Кроме того, обширные шаги мыть образцы уменьшить фон неспецифического окрашивания.

На этапе получения изображения, мы будем следовать протоколу производителя для конфокальной микроскопии. Система микроскопии обеспечивает удобный интерфейс для исследователей и студентов, в частности, что оптимальные наборы фильтров возбуждения / излучения автоматически выбираются, когда указаны типы флуорофоры. В то время как система микроскопии проста в использовании, необходимо оптимизировать параметры получения изображения на каждом образце или каждой фокальной плоскости, путем изменения коэффициента усиления детектора, скорость сканирования, число сканирования, а также размер обскура.

36. Чтобы преодолеть эту проблему, то в нокауте-метод может быть применен для вставки HA-тега в локусе гена планшетки с использованием системы / cas9 CRISPR. При использовании таких трансгенных методов в сочетании с иммунным окрашиванием, по крайней мере, 3-4 белки могут быть одновременно визуализировали в PG или яичника. В отличии от локализации белка, однако, способ визуализировать эндогенные экдистероиды иммунного окрашивания не было установлено. После того, как анти-антитело экдистероидов доступно для иммуноокрашивания, субклеточные локализации экдистероидов биосинтеза и транспортировка экдистероида могут быть исследованы в будущем. Другим ограничением является то, что временная динамика ecdysteroidogenesis не могут быть рассмотрены в фиксированных тканей. Учитывая, что эндостероида титр колебалась по стадии развития, деятельность ecdysteroidogenic органов и выступающим нейронов должна быть временно регулироваться в ответ на различные стимулы окружающей среды. Недавнее исследование , мониторинг которых Ca 2+ динамики клеток PG 37 с использованием методов живого изображения. Для будущих приложений, мы в настоящее время разрабатывается протокол для живых изображений PG или культивируемых яичников вместе с их выступающими нейронами. Что касается существующих методов, этот новый протокол призван визуализировать активность нейронов и их органов-мишеней одновременно. После того , как активность нейронов может контролироваться с помощью Са 2+ индикатором GCaMP или Cameleon 38, то можно манипулировать с оптогенетикой или thermogenetic подходов в соответствующее времяS 39. Эти методы способствуют всестороннему пониманию биосинтеза стероидных гормонов и его нейронного механизма регулирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим Рейко Кисы и Tomotsune Ameku за техническую поддержку этой работы. Мы также благодарны Кей Ито, Ольга Алексеенко, Акико Кото, Масаюки Миура, фондовый центр Блумингтона дрозофилы, КИОТСКАЯ Stock Center (DGRC), а также с развитием исследованиями гибрид банк запасов и реагентами. Эта работа была поддержана грантами на YSN из JSPS KAKENHI Грант Номер 16K20945, The Найто Foundation и премии Исследовательского Inoue науки; и грант в RN от МПКСНТА KAKENHI Гранта Номер 16H04792.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
egg collection
tissue culture dish (55 mm) AS ONE 1-8549-02  for grape-juice agar plates
collection cup HIKARI KAGAKU
yeast paste Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) SARSTEDT 58.487
disposable loop AS ONE 6-488-01
standard fly food  the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
dissecting microscope Leica S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) IWAKI 1000-035
Sylgard TORAY coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)  TERUMO NN-2719S A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5 Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter) Shiga Brand for fillet dissection
micro scissors NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.  MB-50-10
fixation
ultrapure water Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde Nacalai tesque 16222-65
Paraformaldehyde Nacalai tesque 02890-45
Triton-X100 Nacalai tesque 35501-15
microtubes (1.5 ml) INA OPTIKA CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker) As one TM-300 rocker
Bovine Serum Albumin SIGMA 9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000 Molecular Probes A6455 Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 Nakarai tesque 04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500 SIGMA S5545
anti-Hts 1B1 (mouse) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 DSHB DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50 DSHB nc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin Life Technologies A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. SS7213
Square microscope cover glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent) Calbiochem 345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) WATSON 5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope system Carl Zeiss inverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN Carl Zeiss It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
  3. Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
  4. Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
  5. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
  6. Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
  7. Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
  8. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
  9. Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
  10. Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
  11. Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
  12. Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
  13. Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
  14. Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
  15. Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
  16. Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
  17. Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
  18. Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
  19. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
  20. Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
  21. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  22. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
  24. Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
  25. Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
  26. Parvy, J. -P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  28. Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
  29. Li, H. -H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
  30. Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
  31. Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
  32. Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
  33. Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
  34. Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
  35. Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
  36. Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
  37. Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
  38. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  39. Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).

Tags

Биология развития выпуск 122 Биология развития неврология, иммуногистохимия зародышевые стволовые клетка яичники переднегрудная железа
Протоколы Визуальное стероидогенных органов и их интерактивные Органов с иммунным окрашиванием плодовой мушки<em&gt; Дрозофилы</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imura, E., Yoshinari, Y.,… More

Imura, E., Yoshinari, Y., Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (122), e55519, doi:10.3791/55519 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter