Summary
우리는 해부, 고정, 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하는 초파리 유충과 성인 여성의 steroidogenic 장기의 면역 염색을위한 프로토콜을 설명합니다. steroidogenic 기관뿐만 아니라, 우리는 배아 줄기 세포로 steroidogenic 기관의 신경 분포뿐만 아니라 steroidogenic 표적 세포를 시각화.
Abstract
다세포 생물에있어서, 세포의 작은 그룹은 성장과 재생에 대한 조직 반응을 유도하는 그들의 생물학적 활성의 특수한 기능을 부여한다. 곤충, 애벌레 prothoracic 글 랜드 (PG) 및 ecdysteroids라는 주요 스테로이드 호르몬 생합성에있는 성인 여성의 난소 플레이 필수적인 역할. 이러한 기관은 ecdysteroidogenic 생합성 타이밍 큐 환경에 의해 영향을 받는다되는 신경계에서 신경 지배된다. 여기에서 우리는 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하기위한 적절한 모델 시스템을 제공 초파리 melanogaster의를 비행 ecdysteroidogenic 기관과 유충에서의 대화 형 기관과 과일의 성인을 시각화하는 프로토콜을 설명합니다. 숙련 된 해부은 우리가 뇌, 복부 신경 코드 및 다른 조직을 포함하여 ecdysteroidogenic 기관의 위치와 그들의 상호 작용하는 기관을 유지할 수 있습니다. 로모그래퍼 면역 염색ecdysteroidogenic 효소에 대한 ntibodies는 조직 - 특이 적 프로모터에 의해 구동 형질 전환 형광 단백질과 함께 ecdysteroidogenic 세포를 레이블을 사용할 수 있습니다. 또한, ecdysteroidogenic 기관의 신경 밀도는 특정 항체 또는 신경의 여러 유형에 GAL4 드라이버의 집합으로 분류 될 수있다. 따라서 ecdysteroidogenic 기관과 신경 세포의 연결은 면역 염색 및 형질 전환 기술에 의해 동시에 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 누구의 증식과 유지 보수 ecdysteroids에 의해 제어되는 배아 줄기 세포를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 스테로이드 호르몬 생합성과 신경 규제 메커니즘의 포괄적 인 이해에 기여한다.
Introduction
다세포 생물에서는 세포의 그룹은 몸 전체에 필수적인 그들의 생체 활동의 전문 기능을 부여한다. 자신의 임무를 완수하기 위해 각 조직이나 기관의 기능과 관련된 유전자의 일련의 표현과 발전의 맥락에서 자신의 활동을 조율하기 위해 다른 조직과 통신한다. 이러한 전문적인 세포 기능과 간 장기 상호 작용을 특성화하기 위해, 우리는 다른 종류의 세포가 다세포 구조에서 그대로 유지되고 함께 세포의 그룹을 지정해야합니다.
이러한 전문 기관의 한 예는 많은 생합성 효소가 활성화 스테로이드 호르몬 1 콜레스테롤에서 변환 단계를 중재 steroidogenic 기관이다. 이러한 효소 유전자의 대부분은 기관 steroidogenic 구체적으로 표현되고, 생합성 경로 단단히 체액 입력 및 신경 입력을 통해 다수의 외부 자극에 의해 조절된다. 일단합성 스테로이드 호르몬은 체액으로 분비되는 유전자 (2)의 다양한 종류의 발현을 조절하기위한 여러 조직 및 기관을 대상으로한다. 따라서, 스테로이드 호르몬의 작용은 항상성, 성장 및 재생을 유지하기 위해 전신 반응을 유도한다.
스테로이드 호르몬 생합성 기능 및 스테로이드 호르몬의다면 발현 성 행동을 조사, 노랑 초파리은 적합한 모델 시스템으로 사용할 수있다. 애벌레 단계 동안, 곤충 스테로이드 호르몬, ecdysteroid가, 전문 내분비 기관에서 생합성되는 것은 prothoracic 글 랜드 (PG)을 3이라고합니다. PG에서, 여러 ecdysteroidogenic 효소 특히 적절한 발달 단계 4에서 탈피하고 변태 제어하는 에크 디손로 콜레스테롤로부터 여러 전환 단계를 촉매. 따라서 ecdysteroid 역가 동적 변화 규제환경 단서에 따라 많은 신호 전달 경로에 의해. 한편, 성인 단계에서 ecdysteroid은 재생, 수면, 메모리 및 수명 5, 6, 7, 8을 포함하여 생리에 중요한 역할을한다. 이는 적극적 ecdysteroid oogenesis 6, 7, 8, 9, 10, 11의 진행을 조절 난소 생합성하는 것으로 알려져있다. 최근 우리는 배아 줄기 세포 (GSC를)의 개수가 정합에 응답 ecdysteroid 성 펩티드 및 시그널링에 의해 영향을받는 것으로보고 (12)를 자극했다.
D.의 강력한 도구가 잘 주석 게놈 정보를 포함 유전학 및 세포 생물학을, melanogaster의 이진 유전자발현 시스템 및 유전자의 RNAi 기술은 PG 및 난소 13, 14, 15 생합성을 ecdysteroid 필수적인 유전자를 식별 할 수있게했다. ecdysteroidogenic 유전자가 식별되면, 이러한 유전자 및 유전자 산물의 동적 지역화의 전사 조절은 생합성 경로 (16)에 조사 될 수있다. 이를 위해, 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응은 동일계 하이브리드 화 및 면역 조직 RNA 분석을 실시한다. 이러한 기술의 적용은 어려운 과제를 포함하고; PG 또는 난소의 정교한 해부. 특히, 초파리의 PG는 다른 곤충에 비해 상대적으로 작은 (예 : 누에와 타격 비행은), 그래서 하나는 과일의 중요한 기술이 샘플링 해부 비행 연습을 할 필요가있다. 또한, 두 ecdysteroidogenic 기관은 신경 분포를받을중추 신경계 (CNS) 17, 18, 19, 20 S. 따라서, 정확한 해부학 적 분석을 위해 상기 장기 ecdysteroidogenic은 CNS 및 다른 기관들은 신경 연결을 방해하지 함께 그대로 유지한다.
여기에서 우리는 해부와 D의 steroidogenic 기관의 시각화를위한 프로토콜을 제공합니다. melanogaster의. 해부 기술을 배우는 것은이 실험에 대한 중요한 출발점이 될 것입니다. 또한, 하나는 성공적으로 여러 항체 및 GAL4 드라이버 라인으로 steroidogenic 기관뿐만 아니라 상호 작용하는 기관에 레이블을 지정할 수 있습니다. 이러한 기술, 재료 및 유전학을 활용, 하나는 스테로이드 호르몬 생합성의 포괄적 인 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.
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Protocol
참고 : 프로토콜의 전체 구조는 그림 1과 같다.
1. 애벌레 링 선의 해부 (RG)
참고 : D에서. cyclorrhaphous 파리목에 속하는 melanogaster의는 상기 PG는 복합 내분비 장기 링 마개 (RG,도 2D)라는 조건. PG는 수술 (후술하는) 다른 유형의 세포로부터 분리하는 것이 실행할 수 없게되기 때문에, 실제 타겟 절개하여 그대로 손상 RG를 분리하는 것이다.
- 적절한 발달 단계에서 유충의 준비
참고 : D. melanogaster의 유충의 발달 단계를 동기화하기 위해서는 좁은 시간 창 내에서 계란을 수집하고 적절한 시간에 유충을 수집하는 것이 필요하다.- 25 ° C에서 포도 주스 한천 플레이트에 2 시간 동안 계란을 수집합니다.
- 수집 한 새로 부화
- 적절한 시점에서, 바람직하지 않은 부상을 방지하기 위해 일회용 플라스틱 루프를 단계적 애벌레를 수집합니다. 3 번째의 령 유충 발달 진행 차이를 최소화하기 위해 70 하엘 (HAH 48)의 2 차의 령 유충을 수집하고 2 개 시간 간격에서 탈피 할 수있다. 그 다음, L3의 탈피 후 2 시간 내에 3 차 령 유충을 수집하고; 이 절차는 0-2 hAL3E 유충을 제공합니다.
- 인산 완충 식염수 (PBS)로 채워진 접시 단계적 유충을 이동.
- 몸에서 잔류 음식을 제거하기 위해 PBS와 유충을 씻어.
- 아래에있는 A 유충의 거친 해부해부 현미경
- 집게로 유충의 입 후크를 잡습니다. 마이크로 가위를 사용하여 상기 본체의 전방 길이 1/3에서 애벌레 몸을 절단.
- 포셉 한 쌍의 전방 애벌레 신체의 절단 끝을 잡고. 집게의 다른 쌍을 사용하여 부드럽게 본체의 내측을 향하여 상기 헤드의 선단을 밀어; 이 절차는 밖으로 내부의 애벌레 몸을집니다.
참고 :이 단계는 1 차 령 유충의 해부에 대한 건너 뛸 수 있습니다. - 단계를 반복 1.2.1-1.2.2 추가 유충으로 5 ~ 10 분.
참고 : 유충의 수는 해부 시간을 저장 같거나 20보다 작아야합니다.
- 유충의 필렛 해부
참고 :이 방법은 조직의 위치를 유지하는 것은 그대로 유지 할 수 있습니다.- 단 1 시간 동안 물에 유충을 둡니다. 유충은 질식에 의한 고정된다.
- 실리콘 코팅에 PBS의 드롭 유충의 등쪽을 넣어요리의 등쪽면을 위로.
주 : 등쪽면은 길이 방향으로 실행이 개 기관 튜브가 있습니다. - 해부 현미경, 집게를 사용하여 유충의 앞쪽 끝으로 곤충 핀을 삽입한다. 후방 측으로 애벌레 신체 스트레칭 및 유충의 후방 팁에 제 2 핀을 넣어.
주 : 곤충 핀 외에도 텅스텐 와이어로 만들어진 바늘 (21)이 유용 할 수있다. 바늘은 해부 바늘로서 사용하기위한 가열에 피펫 팁에 내장 될 수있다. - 해부 현미경, 마이크로 가위로 꼬리 근처의 작은 절개를합니다. 절개에서 머리를 향해 지느러미 중간 선을 따라 길이 방향 등의 표피를 잘라. 표피 아래 조직이 손상되지 않도록주의하십시오.
- 양쪽의 bodywall 표피 스트레치와 해부 bodywall의 각 모서리 (4) 핀을 배치했다.
- , 집게와 전방 지방 신체의 일부를 제거하고 뇌 RG의 C를 노출표면 상에 노출 될 omplex. 필요한 경우, 침샘 한 쌍을 제거합니다.
- 고정과 함께 면역 조직 염색
- 500 μL (PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드) 수정 용액으로 충전 된 150 mL의 마이크로 튜브에 유생 체 (단계 1.2.2)의 앞쪽 1/3을 넣어. 정착액의 불리한 희석 발생할 수도 그렇지 PBS가 고정 된 샘플에 부착 한 번에 20 개 미만의 샘플을 고정한다. 필렛 해부를 들어, PBS 한 방울을 제거한 다음 수정 솔루션의 한 방울을 추가합니다.
참고 : 수정 솔루션의 경우, 3.7 %의 포름 알데히드 또는 4 % 파라 포름 알데히드 중 하나를 사용할 수있다. - 39 ° C에서 대안 2 시간 동안 실온 (RT) 또는 30 분 동안 수정 용액 해부 조직을 인큐베이션.
- 500 μL PBS와 수정 솔루션을 교체하고 신속하게 샘플을 3 회 씻어. R에 로커에 15 분 동안 500 μL, 0.3 %의 PBT (PBS + 0.3 % 옥틸 페놀에 톡실 레이트)와 함께 샘플을 씻어T. 필릿 해부 곤충 핀을 제거하고 1.5 ㎖의 마이크로 튜브에 시료를 옮긴다.
주 : 조직에 대한 항체의 투과성을 증가시키기 위해, 샘플을 RT에서 로커에 1-2 시간 동안 500 μL 2.0 % PBT를 처리한다. - 용액 (PBT의 2 % 소 혈청 알부민)를 500 μL로 블로킹 PBT 바꾸기. RT에서 로커에서 1.5 시간 동안 샘플을 인큐베이션.
- 50 μL 차 항체 용액을 블로킹 용액으로 희석 한 항체 즉 블로킹 용액을 대체.
- 밤새 4 ℃에서 로커에 샘플을 인큐베이션.
- 500 μL 0.3 % PBT와 차 항체 용액을 장착하고 신속하게 샘플 5 회 헹군다. RT에서 15 분간 로커 각 500 μL 0.3 % PBT와 샘플 3 회 반복한다.
- 50 μL 차 항체 용액 (블로킹 용액으로 희석 한 염료 복합 항체)를 0.3 % PBT 바꾸기. 핵 염색 0.5 μL 4 ', 6-diamidino- 들어2- 페닐 -은 (DAPI 0.1 mg의 / ㎖ 원액) 50 μL를 첨가한다. RT에서 또는 선택적으로 밤새 4 ℃에서 2 시간 동안 로커에 샘플을 인큐베이션.
참고 : 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오. - 500 μL 0.3 % PBT와 항체 용액을 덮고 5 회 헹군다. RT에서 15 분마다 500 μL 0.3 % PBT와 샘플 3 회 반복한다.
- 500 μL (PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드) 수정 용액으로 충전 된 150 mL의 마이크로 튜브에 유생 체 (단계 1.2.2)의 앞쪽 1/3을 넣어. 정착액의 불리한 희석 발생할 수도 그렇지 PBS가 고정 된 샘플에 부착 한 번에 20 개 미만의 샘플을 고정한다. 필렛 해부를 들어, PBS 한 방울을 제거한 다음 수정 솔루션의 한 방울을 추가합니다.
- 뇌-RG 복합체의 미세 해부 PG를 포함하고 장착
- 0.3 % PBT 가득 접시에 면역 염색 샘플을 전송하는 일회용 피펫을 사용합니다.
참고 : 해부 및 장착시 불편 거품을 방지하기 위해, 0.3 % PBT PBS로 교체 할 수 있습니다. - 해부 현미경, 포셉 한 쌍의 표피 입 후크를 누르고 있습니다. 는 "칼날"로 1 ml 주사기에 부착 된 27 G 바늘을 사용하여 신체 표피의 뇌 RG 눈 디스크 착물을 제거 식도 눈 디스크의 앞쪽 끝 부분을 잘라.
- SEPA집게로 뇌-RG-눈 디스크 단지에서 식도와 장 평가. 식도 복부 신경 코드 (VNC) 상기 뇌를 통과하기 때문에, 후방 측의 용기를 꺼내.
참고 : 샘플에서 추가 성충 디스크를 제거 바늘 칼로 뇌, 눈 디스크, 다리 디스크 사이의 연결을 차단합니다. - 다른 샘플 단계를 1.5.1-1.5.4 반복합니다.
참고 : 샘플에 달라 붙는 조직 파편을 방지 0.3 % PBT 또는 PBS로 채워진 다른 깨끗한 접시에 각각의 완성 된 샘플을 전송합니다. - 마이크로 피펫 깨끗한 유리 슬라이드의 중심에 샘플을 전송합니다.
참고 : 2 차 또는 3 차 령 유충의 경우, 마이크로 피펫 팁의 끝이 면도날을 절약 할 수. - 해부 현미경, 집게를 사용하여 자신의 등쪽면이 위로 개별 샘플을 맞 춥니 다.
참고 : RG는 그림 2A (뇌의 등쪽에 위치). 이 정렬은 촬영하는 동안 각각의 샘플의 사양을 용이하게합니다. - 유리 슬라이드를 기울이고 가능한 한 많은 초과 PBT를 닦아. 슬라이드 측에 장착 시약의 방울을 넣어. 드롭의 다른 측으로부터 커버 슬립의 가장자리에 놓고 집게 천천히 시료의 커버 슬립을 넣어.
참고 :이 절차는 커버 슬립 외부 이동 샘플을 방지 할 수 있습니다. - 4 ℃에서 샘플을 저장합니다. 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오.
- 0.3 % PBT 가득 접시에 면역 염색 샘플을 전송하는 일회용 피펫을 사용합니다.
2. 난소의 해부에 성인 여성
- 성인 여성의 준비
- 3-4일가 난소를 풍부하게하는 피드 여성 표준 효모 / 옥수수 가루 플라이 음식을 날아. 25 ° C에서 유지한다.
- 성인 여성 난소의 해부
- 여성은 CO 2 가스 파리 마취와 자신의 머리를 잘라.
- 3 센티미터 접시에 플라이 몸을 이동PBS로 가득.
- 해부 현미경, 집게를 사용하여 등쪽 측의 가슴을 누르고 있습니다. 다른 집게 복부 세그먼트 또는 A5 A6를 잡고 후방 측으로 복부 표피를 벗겨. 포셉의 끝에서 끈적 끈적한 표피를 닦아냅니다.
- 난관을 조이고 몸에서 난소를 꺼내.
- 빗과 집게와 난소의 팁을 확산.
참고 :이 작업은 면역 염색의 효율성을 향상시킨다.
- 성인 여성의 뇌, VNC 및 생식 기관의 해부.
참고 :이 방법은 난소의 신경 분포가 그대로 유지 될 수 있습니다.- 여성은 CO 2 가스 파리 마취하고 PBS로 가득 실리콘 코팅 접시로 전송.
- 해부 현미경 하에서, 코를 잡고 집게로 뇌를 노출 머리의 표피를 벗겨. 뇌에 부착 된 기관을 제거합니다.
참고 : 꼰 로프n은 백색 둥근 구조이다. 뇌는 흉부에 VNC에 연결합니다. - 등쪽 측의 가슴을 잡고 포셉 한 쌍의 다리와 날개를 잘라. 포셉의 다른 쌍을 사용하여 다리의 기지에서 흉부 복부 표피를 벗겨. VNC를 노출되면, VNC 사용하는 집게에 부착 된 잔류 등의 표피와 근육을 제거합니다. 뇌와 VNC 사이의 연결이 손상되지 않도록주의하십시오.
- 복부 표피를 벗겨과 난소 및 신경 세포, 작물, 창자, 난관, 자궁, 그리고 악세사리 글 랜드를 비롯한 대화 형 장기 노출 집게를 사용합니다.
- 기관과 집게를 사용하여 지방을 몸을 포함한 잔여 조직을 제거합니다.
- 고정과 함께 면역 조직 염색
- 250 μL로 채워진 1.5 ㎖의 마이크로 튜브에 고정 용액 난소 약 8-10 쌍 트랜스퍼 (4 % paraformaPBS에서 ldehyde) 및 RT에서 30 분 동안 샘플을 배양한다.
- 500 μL PBS와 수정 솔루션을 교체하고 신속하게 샘플을 3 회 씻어.
- RT에서 5 분마다 샘플을 500 μL의 0.1 % PBT 2 회 반복한다.
- 차단 솔루션 50 μL와 PBT를 교체합니다. RT에서 로커에서 1 시간 동안 샘플을 인큐베이션.
- 50 μL 차 항체 용액으로 블로킹 용액을 대체.
- 밤새 4 ℃에서 로커에 샘플을 인큐베이션.
- 500 μL 0.1 % PBT와 차 항체 용액을 대체. RT에서 15 분간 로커 각 500 μL 0.1 % PBT와 샘플 3 회 반복한다.
- 50 μL 차 항체 용액 0.1 % PBT 바꾸기. 핵 염색을 위해, 50 μL 용액 0.5 μL를 추가 DAPI. RT에서 로커에서 2 시간 동안 샘플을 인큐베이션.
- 500 μL 0.1 % PBT와 이차 항체 용액을 대체. 500 μL 0.1 % PBT로 시료를 3 회 반복 RT에서 15 분간 로커마다.
참고 : 세척 절차를 4 ° C에서 하룻밤을 수행 할 수 있습니다. 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오.
- 유리 슬라이드에 샘플을 장착
- 0.1 % PBT는 마이크로 피펫을 이용하여 유리 슬라이드에 시료를 옮긴다.
참고 : 해부 및 장착시 불편 거품을 방지하기 위해, 0.1 % PBT PBS로 교체 할 수 있습니다. - 난소를 들어, 해부 현미경 집게 서로로부터 ovarioles의 문자열을 분리한다. germaria를 포함하는 ovarioles의 팁을 손상하지 마십시오. 뇌-VNC-생식 기관의 복잡한 경우, 잔류 표피를 제거하고 유리 슬라이드의 위치를 배열합니다.
- 가능한 한 많은 초과 PBT를 닦아 및 샘플의 중앙에 장착 시약 한 방울을 넣어. 천천히 집게를 사용하여 커버 슬립을 놓습니다.
- 4 ℃에서 샘플을 저장합니다. 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오.
- 0.1 % PBT는 마이크로 피펫을 이용하여 유리 슬라이드에 시료를 옮긴다.
- 현미경으로 샘플을 관찰하고보기의 필드에 steroidogenic 기관을 가지고. 뷰가 고정되면, 화상 취득 모드로 촬상 시스템을 전환.
참고 : 10-20X의 대물 렌즈는 뇌-RG의 복잡하거나 전체 난소의 이미지를 얻기 위해 사용된다. 이와 달리, 대물 렌즈 40-63X (물 또는 오일 침지) GSC를 또는 PG 및 난소 신경 신경 밀도 단백질의 세포 내 위치 파악 시각화 사용된다. - 첨부 된 소프트웨어 이미지 수집의 매개 변수를 설정합니다. 형광의 조합 (예 : GFP 및 RFP)를 선택합니다. 고속 스캔 절차에 의해, 레이저 파워 검출기의 감도 (이득 / 오프셋), 및 핀 홀의 크기를 조절한다.
주 : 고품질의 이미지를 획득하기 위해, 주사 레이저 파워 검출기 (게인)의 감도는 각각의 샘플에 대해 최적화되어야한다. 모양을 간략하게 설명합니다조직에, 전송 된 광 화상을 형광 영상에 더하여 수행 될 수있다. - 이미지의 Z 스택을 가져 가라. 연속 빠른 스캔하는 동안, 현미경의 초점 거리와 초점면을 이동하고 시작 위치와 종료 위치를 설정합니다. 슬라이스의 수와 조각 사이의 간격 거리를 적절하게 조정된다.
- 스캔 속도, 스캔 방법 및 양방향 스캔 모드를 선택합니다.
- 이미지 수집을위한 "실제 스캔을 시작합니다."
- 첨부 된 소프트웨어의 형식으로 이미지를 저장합니다.
참고 : 원본 이미지 파일은 이미지 수집 매개 변수와 비늘의 정보가 포함되어 있습니다. 보낸 이미지는 컴퓨터 (22)에 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 처리 될 수있다.
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Representative Results
우리는 steroidogenic 기관 및 D. melanogaster의 유충과 성인 여성에서의 대화 형 장기를 시각화하기 위해 위의 프로토콜을 사용했다. 프로토콜의 전체 구조는 그림 1과 같다.
PG (도 2D), 뇌보다 더 작고 더 투명하고, 뇌 (도 2A 및 3A-C-E)의 전방 - 등쪽 측에 위치하고 포함 RG. PG 셀 라벨을 여러 그룹 ecdysteroidogenic 효소에 대한 항체의 다양한 형태를 생성 한 (즉, 버 랜드 (23), 측판 (20), 팬텀 25, 25 맞추기 및 26 그림자 Spookier 24). 그 중에서도, 안티 덮개 (SRO) 항체가 안정적으로 면역 염색하여 PG 라벨을 위해 사용된다 (도 2c,도 2e 및도 3c). 또는, binarY 유전자 발현 시스템, GAL4 / UAS 시스템 (27)은 PG 세포 형광 단백질 유전자를 발현하는데 사용될 수있다. ecdysteroidogenic 유전자 팬텀 (PHM)의 프로모터의 분석을 통해, PG - 특이 적 프로모터는 PG 28 단독 유전자 발현을 유도 할 수있다. 따라서, PG 세포 특이 PHM-GAL4 번호 22 (도 3D)의 제어하에 GFP 또는 RFP 발현에 의해 시각화 될 수있다.
PG 뇌의 신경 연결 시각화 뉴런의 그룹은 다양한 드라이버와 GAL4 항체 (도 2C, 2E, 3D 및 3E)의 제어하에 mCD8 :: GFP로 표지 될 수있다. GAL4 라인 컬렉션의 FlyLight 데이터베이스는 라벨 뉴런 (29)에 최적화되어 있습니다. 그 중 GMR45C06-GAL4는 신경 세포 (그림 2C와 E를) PG는-돌출 된 레이블. 메신저항 GFP 항체로 GFP FPRL1- 발현 유충 munostaining은 GFP 신호를 높이는 데 효과적이다. 또한, TRH-GAL4은> mCD8는 :: GFP 유충은 세로토닌 신경이 프로젝트에뿐만 아니라 PG뿐만 아니라 proventriculus (PV, 곤충 foregut)과 인두 근육 (PM) (그림 3D 및에 stomatogastric 신경계를 보여 E) (20, 30). 따라서, RG, 뇌 및 필렛 해부 동안 다른 주변 조직 (도 3)의 위치를 유지하는 것이 중요하다.
성인 여성에서 난소 ecdysteroid는 GSC 증식, 낭종의 분화, 계란 챔버의 성장 및 스트레스 반응 11 oogenesis의 여러 측면에 영향을 미친다. PG 마찬가지로, 난소 ecdysteroidogenic 효소는 31 (12) 상술 한 특정 항체로 가시화된다.하류에있는 이벤트 행위 ecdysteroids 같이 GSC를 germarium의 수는 우리의 초점 (도 4)이다. germarium 여러 세포 유형의 조립이지만, GSC를 두 GSC 마커 항체 1B1 D 및 E-cadherin의 32 면역 염색에 의해 규정된다. 난소의 신경 분포를 시각화하기 위해, 난소 뇌, VNC, 창자, 자르기, 자궁 및 spermatheca (그림 5)와 함께 해부한다. 뉴런 nSyb-GAL4, 범 신경 드라이버 (도 5b 및 D)의 제어하에 mCD8 : GFP에 의해 가시화된다. 난소, 자궁, 및 창자 주위 근육 염료 공액 팔로이 딘으로 염색된다.
그림 1 : 프로토콜의 전체 계획. 두 가지 해부 방법은 APPLIC 있습니다실험의 목적에 따라, 그리고 성인 여성을 애벌레 할 수. 장착 방법은 시료 상태에 따라 고 안된다. 고정, 염색, 및 이미징 기술은 모든 샘플에 기본적으로 공통입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : PG 및 PG-투사 신경 세포의 시각화. (A 및 B) 야생형 3 차 령 유충의 뇌 링 선 (RG) 착체. (B)에서, PG는 점선으로 설명된다. 뇌와 RG 사이의 필라멘트 구조는 기관이다. (C - E)를 PG의 신경 분포는 mCD8으로 가시화 ::FlyLight 컬렉션 GMR45C06-GAL4에 의해 구동 GFP. PG 및 GFP 양성 신경 세포를 각각 안티 SRO 항체 (마젠타) 및 항 GFP 항체 (녹색)로 표지 하였다. 형광 이미지는 조직의 윤곽을 지정 투과광 화상에 병합된다. (D)에서, 상기 PG는 코퍼스 allata (CA) 및 코퍼스에 cardiaca (CC)가 도시되어있다. PG 투 뉴런 10X 대물 렌즈 (C)와 저전력 이미지보다 40X 대물 렌즈 (E 중 화살표)와 고출력 이미지에서 더 두드러진다. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : PG, 태양 광,에 Stomatogastric 신경계 투영합니다 ND는 PM. (A 및 B) 야생형 3 차 령 유충의 필렛 해부. PG, 뇌 (BR)의 위치는 복부 신경 코드 (VNC), 아이 디스크 (ED), 날개 디스크 (WD), 인두 근육 (PM) 및 proventriculus (PV)는 그대로 유지됩니다. (C)가 PG 독점적 항 SRO 항체 (마젠타)로 표지 하였다. (D)이 PG가 PHM-GAL4 번호 (22)에 의해 구동 turboRFP로 표지 하였다. 세로토닌 신경 세포는 항 5HT 항체 (녹색)으로 표시했다. (E)를 stomatogastric 신경계 TRH-GAL4 구동 mCD8 :: GFP 가시화 하였다. 세로토닌 신경 세포는 PG의 PM 및 PV (화살표)로 예상된다. 배율 = 100 μm의 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 4 : 한 개, 두 개 또는 세 개의 GSC를 함유 야생 타입 파리의 Germaria. (A) 여성 생식 기관의 개요. 난소는 달걀 챔버 문자열 16-20 ovarioles 구성된다. GSC를이있는 germarium는 각 ovariole의 선단이다. (B - D) 1, 2 또는 3 GSC를이 야생형 암컷의 각 germarium (흰색 점선 원)에 있습니다. GSC를는 spectrosome (화살표)에서 발생한 구면 구조 및 fusome라고도 멤브레인 골격 구조 라벨 1B1 항체 (녹색)로 염색된다. 셀 경계 안티 D의 E-cadherin의 항체 (마젠타) 가시화된다. 스케일 바는 10 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 여성의 생식 기관과 상호 작용하는 기관. (A) 난소 (OV), 창자 (직감), 자르기 (CR), 뇌 (BR), 복부 신경 코드 (VNC)과 spermatheca (SP)을 현미경 하에서 절개 하였다. (B - D) 난소의 신경 분포는 nSyb-GAL4 구동 mCD8 :: GFP 가시화 하였다. GFP 양성 신경 세포가 난소 (화살촉)의 표면에 돌출는 VNC (화살표)으로부터 연장된다. 난소는 점선으로 설명되어 있습니다. 샘플을 항 GFP 항체 (녹색)로 염색 염료 공역 팔로이 딘 (마젠타) 하였다. 필라멘트 상 난소 주위 근육의 액틴 (OV) 및 자궁 (UT)와 동료를 팔로이 딘. 그림은 C.에서 눈금 막대 = 200 μm의 도시이다.rge.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 ecdysteroid 생합성 및 D. melanogaster의에서의 규제 메커니즘을 연구하고, 해부 및 면역 염색을위한 프로토콜을 고안했다. ecdysteroid 생합성의 타이밍은 신경 입력 큐 (33)의 환경에 의해 영향을받는, 그래서 박리시 뇌 VNC 및 다른 조직과 함께 ecdysteroidogenic 기관의 신경 분포를 유지하기 위해 필수적이다.
전술 한 바와 같이, D. melanogaster의 PG는 코퍼스의 allata (CA) 및 코퍼스에 cardiaca (CC) (도 2d)와 복합체 내분비 장기 RG를 형성한다. PG가 ecdysteroids를 생산하는 동안, CA와 CC는 각각 청소년 호르몬과 adipokinetic 호르몬을 생산하고 있습니다. 이 해부학 적 특성은 D에 ecdysteroidogenesis을 공부하고 연구에 장애가되고있다. melanogaster의 다른 곤충에 비해. 그러나 지난 수십 년 동안, 유전학 하 비행들 우리가 특별히 PG 사에서 표현되는 많은 ecdysteroidogenic 유전자를 식별 할 수 있었다. 이 유전자는 세포 또는 간호사 난소 (34), (35)의 모낭 세포에서 발현된다. 이제 하나는 가능한 면역 염색 및 형질 전환 기술에 의해 ecdysteroidogenic 세포를 지정하고, ecdysteroidogenic 기관에서 유전자 발현 프로파일의 고유 한 세트를 사용할 수 있습니다.
해부 동안, 날카로운 모서리와 미세 집게를 사용하는 것이 필수적이다. 이전 해부, 포셉의 가장자리 틈없이 함께 가장자리를 가져 아칸소 숫돌로 날카롭게 할 수있다. 박리 찌꺼기 또는 지방 체, 창자 및 성충 디스크와 같은 잔여 조직 중에 가능한 한 많이 제거되어야한다. 특히, 지방 신체의 조각은 쉽게 관심의 조직에 충실. 또한, 유리 슬라이드 상에 장착 된 샘플의은 수행되어야조심스럽게 에디션. 커버 슬립을 장착 스티커 매체의 샘플들에 배치 될 때 조직의 복합체 흐트러진 될 수있다. 따라서, 샘플의 충분한 수가 절개해야하고, 적절한 샘플은되는 RG 또는 난소의 최상부 측에 있고 신경 연결을 그대로 유지 것과 같은 촬상을 위해 선택되어야한다.
성공적인 면역 염색을 수행하고 재생 가능한 결과를 얻기 위해, 샘플링 및 처리 절차에 대해 동일한 상태를 유지하는 것이 중요하다. 면역 염색 정도는 높은 샘플링 및 정착시의 개별 동물의 상태에 의존한다. 예를 들어, 동물의 사육 온도, 영양 상태 및 해부 시간의 나이 신중하게 고려되어야한다. 여러 실험에서 고정의 처리 오류를 최소화하기 위해, 우리는 신중하게 해부 시간과 고정 반응 시간을 조정하는 샘플의 거의 같은 수를 유지한다. 고정 s의해결 방법, 4 % 파라 포름 알데히드 또는 포름 알데히드를 3.7 %가 사용된다. 파라 포름 알데히드가 빠르게 시간이 지남에 따라 저하되기 때문에, 그 분말은 일반적으로 PBS에서 10 %의 원액을 용해하고, 분취 액은 -20 ° C에 저장됩니다. 분취 량은 모든 해부에 신선한 4 % 수정 솔루션은 이전에 만들 얼지 있습니다. 또한, 샘플의 광범위한 세척 단계는 배경 비특이적 염색을 감소시킨다.
이미지 수집의 단계에서, 우리는 공 초점 현미경 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. 현미경 시스템은 형광의 유형이 지정된 경우 여기 / 방출 필터의 최적의 세트가 자동으로 선택되도록 연구원이나 학생들을위한 사용자 친화적 인 인터페이스를 제공합니다. 현미경 시스템은 쉽게 사용할 수 있지만, 하나는 검출기 이득, 스캔 속도, 스캔 숫자, 핀 홀의 크기를 변경하여, 각 시료 또는 각각의 초점면에 화상 취득의 파라미터를 최적화 할 필요가있다.
(36)와 같은 다른 ecdysteroidogenic 유전자 제품에 대한 여러 항체를 생성하지 못했습니다. 이 문제를 극복하기 위해, 노크의 기술은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용 위자 보드 유전자좌에서 HA 태그 삽입에 적용될 수있다. , 면역 염색과 조합하여 이러한 형질 전환 기술을 이용하여 적어도 3-4 단백질 동시에 PG 또는 난소 시각화 할 수있다. 면역이 성립되지 않은 단백질에 의해 제이션 달리, 그러나, 방법은 내인성 ecdysteroids 시각화. 안티 ecdysteroid 항체 면역 염색에 사용할 수있게되면, ecdysteroid 생합성의 세포 내 지역화 및 ecdysteroid의 전송은 미래에 조사 할 수있다. 또 다른 제한은 ecdysteroidogenesis의 시간적 동성 고정 조직에서 관찰 될 수 없다는 것이다. ecdysteroid 역가가 발달 단계에 따라 변동되는 점을 감안 ecdysteroidogenic 기관과 투사 뉴런의 활동은 일시적으로 다양한 환경 자극에 대한 응답으로 규제해야한다. 최근의 연구는 칼슘을 라이브 영상 기술 (37)를 사용하여 PG 세포의 2+ 역학을 모니터링. 미래의 애플리케이션의 경우, 우리는 현재 PG 또는 투사 신경 세포와 함께 배양 난소의 라이브 영상을위한 프로토콜을 개발하고있다. 기존의 방법과 관련하여,이 새로운 프로토콜을 동시에 신경 세포와 그 표적 기관의 활동을 시각화하는 것을 목표로하고있다. 뉴런의 활동이 칼슘 2 + 표시 GCaMP 또는 Cameleon 38 모니터링 할 수있게되면, 그것은 적절한시기에 optogenetic 또는 thermogenetic 방식으로 조작 할 수 있습니다39이야. 이러한 방법은 스테로이드 호르몬 생합성의 포괄적 인 이해와 신경 규제 메커니즘에 기여한다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는이 작품에 대한 자신의 기술 지원 레이코 키세 및 Tomotsune Ameku 감사합니다. 우리는 또한 케이 이토, 올가 알렉시앙코, 아키코 고토 마사유키 미우라, 블루밍턴 초파리 증권 센터, 교토 증권 센터 (DGRC)과 주식 및 시약의 발달 연구 하이 브리 도마 은행에 감사하고 있습니다. 이 작품은 JSPS KAKENHI 허가 번호 16K20945, 나이토 재단, 그리고 이노우에 과학 연구 상에서 YSN 보조금에 의해 지원되었다; 및 문부 과학성 KAKENHI 허가 번호 16H04792에서 RN에 그랜트.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
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