Summary

Protokoller for Visualisering Steroidogenic organer og deres Interaktiv organer med Farging i bananflue<em> Drosophila melanogaster</em

Published: April 14, 2017
doi:

Summary

Vi beskriver en protokoll for disseksjon, fiksering og immunofarging av steroidogenic organer i Drosophila-larver og voksne kvinner for å studere steroid hormon biosyntese og dens reguleringsmekanisme. I tillegg til steroidogenic organer, visual vi innervasjon av steroidogenic organer samt steroidogenic målceller slik som kimlinje-stamceller.

Abstract

I flercellede organismer, er en liten gruppe av celler utstyrt med et spesialisert funksjon i sin biogene aktivitet som induserer en systemisk respons til vekst og reproduksjon. I insekter, larve prothoracic kjertel (PG) og den voksne kvinnelige eggstokk spille viktige roller i biosynthesizing de viktigste steroidhormoner som kalles ekdysteroider. Disse ecdysteroidogenic organene er innervert fra nervesystemet, gjennom hvilken tidspunktet for biosyntese påvirkes av miljø signaler. Her beskriver vi en protokoll for å visualisere ecdysteroidogenic organer og deres interaktive organer i larver og voksne av bananflue Drosophila melanogaster, som gir en passende modellsystem for å studere steroid hormon biosyntese og dens reguleringsmekanisme. Dyktige disseksjon tillater oss å opprettholde posisjonene til ecdysteroidogenic organer og deres interaktive organer, inkludert hjernen, det ventrale nervesystemet og andre vev. Farging med enntibodies mot ecdysteroidogenic enzymene, sammen med transgene fluorescens proteiner som drives av vevs-spesifikke promotorer er tilgjengelige for å merke ecdysteroidogenic celler. Videre kan innervations av ecdysteroidogenic organer også bli merket spesifikke antistoffer eller en samling av GAL4 sjåfør forskjellige typer av nerveceller. Derfor kan ecdysteroidogenic organer og deres nevrale forbindelser bli visualisert samtidig av immunfarging og transgene teknikker. Til slutt, vil vi beskrive hvordan å visualisere kimlinje stamceller, hvis spredning og vedlikeholds styres av ekdysteroider. Denne fremgangsmåten bidrar til omfattende forståelse av steroidhormon-biosyntese og dens neuronal reguleringsmekanisme.

Introduction

I flercellede organismer, er en gruppe av celler utstyrt med et spesialisert funksjon i sin biogene aktivitet som er vesentlig for hele kroppen. For å oppfylle sine oppgaver, hvert vev eller organ uttrykker en serie av gener relatert til deres funksjoner og kommuniserer med andre vev for å organisere sin aktivitet i sammenheng med utvikling. For å karakterisere slike spesialiserte cellefunksjoner og inter-organ interaksjoner, trenger vi å angi en gruppe av celler sammen med andre typer av celler kan holdes inntakt i den flercellede arkitekturen.

Et eksempel på slike spesialiserte organer er en steroidogenic organ, hvor flere biosyntetiske enzymer som medierer de konverteringstrinn fra kolesterol til aktive steroidhormoner 1. De fleste av disse enzym gener blir spesielt uttrykt i steroidogenic organer, og den biosyntetiske reaksjonsvei er strengt regulert av mange ytre stimuli via humorale innganger og neuronal innganger. En gangsyntetiserte, steroidhormoner utskilles i hemolymfe og er rettet mot en rekke vev og organer for regulering av ekspresjonen av en rekke gener 2. Derfor, induserer virkningen av et steroidhormon en systemisk respons for å opprettholde homeostase, vekst og reproduksjon.

For å undersøke funksjonene av steroidhormon-biosyntese og de pleiotrope virkninger av steroidhormoner, kan Drosophila melanogaster benyttes som en egnet modell system. I løpet av larvestadiet, insekt steroidhormon, ekdysteroid, biosyntetiseres i en spesialisert endokrint organ som kalles prothoracic kjertel (PG) 3. I PG, flere ecdysteroidogenic enzymer spesifikt katalysere flere konverterings trinn fra kolesterol til ekdyson, som kontrollerer at hamskifte og metamorfose på de hensiktsmessige utviklingsstadier 4. Derfor er en dynamisk endring i ekdysteroid-titer regulertved flere signalveier som respons på miljø signaler. På den annen side, i det voksne stadium, spiller ekdysteroid viktige rolle i fysiologien, inkludert reproduksjon, søvn, hukommelse, og levetiden 5, 6, 7, 8. Det er kjent at ekdysteroid er aktivt biosyntetiseres i eggstokken, som regulerer progresjon av oogenesen 6, 7, 8, 9, 10, 11. Nylig har vi rapportert at antall kimlinje-stamceller (GSCs) påvirkes av ekdysteroid og kjønn peptid signalering som reaksjon på stimuli parring 12.

Kraftige verktøy av D. melanogaster genetikk og cellebiologi, inkludert godt annotert genom informasjon, binær genekspresjonssystemer og transgene RNAi teknikker, har gjort oss i stand til å identifisere gener som er essensielle for ekdysteroid-biosyntese i PG og eggstokk 13, 14, 15. Når ecdysteroidogenic genene er identifisert, kan den transkripsjonelle regulering av disse genene og de dynamiske lokaliseringer av genprodukter bli undersøkt i den biosyntetiske reaksjonsvei 16. For dette formål, kvantitativt-revers transkripsjon-PCR, RNA in situ hybridisering, immunhistokjemi og analyse utføres. Anvendelsen av disse teknikkene omfatter en utfordrende oppgave; forseggjort disseksjon av PG eller eggstokken. Spesielt PG av bananflue er relativt mindre enn for andre insekter (f.eks silkeormen og blåse fly), så man trenger å øve på viktige ferdigheter i bananflue dissekering for prøvetaking. Videre begge ecdysteroidogenic organer motta innervasjons fra sentralnervesystemet (CNS) 17, 18, 19, 20. Således, for nøyaktig anatomiske analyser, de ecdysteroidogenic organer bør holdes intakt sammen med CNS og andre organer, for ikke å forstyrre deres nevrale forbindelser.

Her gir vi protokoller for disseksjon og visualisering av steroidogenic organer i D. melanogaster. Læring disseksjon teknikk er nøkkelen utgangspunktet for disse eksperimentene. I tillegg kan man med hell merke steroidogenic organer så vel som deres interaktive organer med flere antistoffer og GAL4 driverlinjer. Å utnytte disse teknikker, materialer og genetikk, kan man studere omfattende mekanismer for steroidhormon biosyntese.

Protocol

NB: Den generelle ordningen av protokoller er vist i figur 1. 1. Disseksjon av larve Ring Gland (RG) MERK: I D. melanogaster, som hører til cyclorrhaphous Diptera, er PG innenfor et kompositt endokrint organ som kalles ring kjertel (RG, figur 2D). Siden det er ugjørlig at PG er kirurgisk separeres fra andre celletyper (omtalt senere), er et praktisk mål for å isolere et intakt og uska…

Representative Results

Vi brukte de ovennevnte protokoller for å visualisere steroidogenic organer og deres interaktive organer i D. melanogaster larver og voksne kvinner. Det totale skjema av protokoller er vist i figur 1. RG, inkludert PG (figur 2D), er mindre og mer gjennomsiktige enn hjernen og er plassert ved den fremre-ryggsiden av hjernen (figur 2A-C og 3A-E). Å merke PG-celler, har flere grupper generert forskjellige typer av antistoffer mot ecdysteroidogenic enzymer <s…

Discussion

Vi studerte ekdysteroid-biosyntese og dens reguleringsmekanisme i D. melanogaster, og utviklet en protokoll for disseksjon og immunofarging. Tidspunktet for ekdysteroid-biosyntese er påvirket av omgivelses signaler gjennom neuronale innganger 33, så det er viktig å opprettholde den innervasjon av ecdysteroidogenic organene sammen med hjernen, VNC, og annet vev under dissekering.

Som beskrevet ovenfor, danner D. melanogaster PG et kompleks endokrin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Reiko Kise og Tomotsune Ameku for deres tekniske støtte til dette arbeidet. Vi er også takknemlige for Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stock Center, KYOTO Stock Center (DGRC), og utviklingsstudier Hybridomproduksjon Bank for aksjer og reagenser. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til YSN fra JSP KAKENHI Grant Antall 16K20945, The Naito Foundation, og Inoue Science Research Award; og ved en bevilgning til RN fra MEXT KAKENHI Grant Number 16H04792.

Materials

egg collection
tissue culture dish (55 mm) AS ONE 1-8549-02  for grape-juice agar plates
collection cup HIKARI KAGAKU
yeast paste Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) SARSTEDT 58.487
disposable loop AS ONE 6-488-01
standard fly food  the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
dissecting microscope Leica S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) IWAKI 1000-035
Sylgard TORAY coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)  TERUMO NN-2719S A "knife" to cut the tissue
Terumo syringe, 1ml TERUMO SS-01T
forceps, Inox, #5 Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter) Shiga Brand for fillet dissection
micro scissors NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.  MB-50-10
fixation
ultrapure water Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde Nacalai tesque 16222-65
Paraformaldehyde Nacalai tesque 02890-45
Triton-X100 Nacalai tesque 35501-15
microtubes (1.5 ml) INA OPTIKA CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker) As one TM-300 rocker
Bovine Serum Albumin SIGMA 9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000 Molecular Probes A6455 Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 Nakarai tesque 04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500 SIGMA S5545
anti-Hts 1B1 (mouse) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 DSHB DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50 DSHB nc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin Life Technologies A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. SS7213
Square microscope cover glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent) Calbiochem 345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) WATSON 5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope system Carl Zeiss inverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN Carl Zeiss It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

References

  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
  3. Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
  4. Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
  5. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
  6. Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
  7. Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
  8. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
  9. Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
  10. Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
  11. Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
  12. Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
  13. Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
  14. Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O’Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
  15. Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O’Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
  16. Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
  17. Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
  18. Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
  19. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
  20. Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
  21. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  22. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
  24. Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
  25. Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
  26. Parvy, J. -. P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  28. Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
  29. Li, H. -. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
  30. Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
  31. Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
  32. Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
  33. Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
  34. Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
  35. Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
  36. Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
  37. Yamanaka, N., Marqués, G., O’Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
  38. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  39. Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).

Play Video

Cite This Article
Imura, E., Yoshinari, Y., Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (122), e55519, doi:10.3791/55519 (2017).

View Video