Summary
Biz diseksiyon, tespit ve steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmaya Drosophila larvaları ve yetişkin kadınlarda Sterpidojenik organların immün için bir protokol açıklar. steroidojenik organlara ek olarak, böyle germ çizgili kök hücreleri gibi steroidojenik organların innervasyon olarak steroidojenik hedef hücreleri görselleştirmek.
Abstract
Çok hücreli organizmalarda, hücre küçük bir grup, büyüme ve üreme sistemik tepkisine sebep olarak, bunların biyojenik aktiviteye özel bir fonksiyon ile donatılmıştır. böceklerde, larva prothoracic bezi (PG) ve ekdisteoidlerden adlandırılan ana steroid hormonları-üreten mutantı ya yetişkin kadın yumurtalık oyun temel roller. Bu ecdysteroidogenic organlar biyosentezi zamanlaması çevresel işaret tarafından etkilendiğini sinir sistemi, gelen innerve. Burada steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmak için uygun bir model sistemi sağlar Drosophila melanogaster, sinek ecdysteroidogenic organları ve larva kendi interaktif organları ve meyve yetişkinleri görselleştirilmesi için bir protokol açıklar. Usta diseksiyon bize beynin ventral sinir kordonu ve diğer dokularda da dahil ecdysteroidogenic organların konumlarını ve interaktif organlarını korumak sağlar. Bir ile immün boyamaecdysteroidogenic enzimlerine karşı ntibodies, dokuya özel promoterler tarafından tahrik edilen transgenik floresan proteinleri ile birlikte, ecdysteroidogenic hücreleri etiketlemek için kullanılabilir. Üstelik ecdysteroidogenic organların inervasyonları da spesifik antikorların veya nöronların çeşitli GAL4 sürücülerin bir koleksiyon ile etiketli olabilir. Bu nedenle, ecdysteroidogenic organları ve nöronal bağlantıları immün ve transgenik teknikler ile eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Son olarak, kimin çoğalması ve bakım ekdisteoidlerden tarafından kontrol edilir germ hattı kök hücreleri, görselleştirmek için nasıl açıklar. Bu yöntem steroid hormon biyosentezi ve nöronal düzenleyici mekanizmanın kapsamlı anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Introduction
çok hücreli organizmalarda, bir grup hücre tüm vücut için gerekli olan kendi biyojenik aktivitesinde özel fonksiyonu ile donatılmıştır. görevlerini yerine getirmek için, her bir doku ya da organ işlevleri ile ilişkili genlerin bir dizi ifade eden ve gelişme bağlamında kendi faaliyetlerinin düzenlemek için başka doku ile iletişim kurar. Böyle özel hücresel fonksiyonları ve arası Organ etkileşimlerini karakterize etmek için, hücrelerin diğer türleri çok hücreli mimarisinde bozulmadan tutuluyor ile birlikte bir hücre grubu belirtmek gerekir.
Gibi özel organların bir örneği birçok biyosentetik enzimleri aktif steroid hormonları 1 kolesterolden dönüşüm basamaklarını aracılık bir steroidojenik organdır. Bu enzim genlerinin çoğu özel olarak steroidojenik organlarda eksprese edilir ve biyosentez yolu sıkıca hümoral giriş ve nöronal girişleri yoluyla çok sayıda dış uyaranlarla düzenlenir. bir Zamanlarsentez, steroid hormonlar hemolimf içine salgılanır ve gen 2, çeşitli ekspresyonunun düzenlenmesi için bir çok doku ve organların hedeflenir. Bu nedenle, bir steroid hormonunun hareketini homeostazı, büyüme ve üreme korumak için sistemik bir yanıtı indükler.
Steroid hormon biyosentezindeki fonksiyonlarını ve steroid hormon pleiotropik etkilerin araştırılması için, Drosophila melanogaster, uygun bir model sistem olarak da kullanılabilir. Larva aşamalarında, böcek steroid hormonu, ekdisteroid, özel bir endokrin organa biyosentezlenir prothoracic bezi (PG) 3 çağırdı. PG, çeşitli ecdysteroidogenic enzimler, özel olarak uygun bir gelişim aşamalarında 4 de deri değiştirme ve başkalaşım kontrol eden, ekdison kolesterol birden fazla dönüşüm basamaklarını katalize ederler. Bu nedenle, ekdisteroid titre içindeki dinamik değişim düzenlenirçevresel uyaranlara yanıt olarak birçok sinyal yollarının tarafından. Öte yandan, yetişkin safhasında, ekdisteroid üreme, uyku, hafıza ve ömrü 5, 6, 7, 8 dahil olmak üzere fizyolojisinde önemli rol oynar. Ekdisteroid aktif oogenez 6, 7, 8, 9, 10, 11 ilerlemesini düzenleyen, yumurtalık biyosentezlenmiş olduğu bilinmektedir. Yakın zamanda tohum çizgisi kök hücreleri (GSC'ler) sayısı çiftleşme yanıt olarak ekdisteroid ve cinsiyete peptid sinyal etkilenir bildirmiştir 12 uyarıcıya sahip.
D. güçlü araçlar iyi açıklamalı genom bilgileri de dahil olmak genetik ve hücre biyolojisi, melanogaster, ikili gensentezleme sistemleri ve transgenik RNAi teknikleri, PG ve yumurtalık 13, 14, 15'te biyosentezini ekdisteroid için gerekli genleri tanımlamak için sağlamıştır. Ecdysteroidogenic genler tespit edildikten sonra, bu genlerin ve gen ürünlerinin dinamik lokalizasyonunun transkripsiyonel düzenleme biyosentez yolunun 16 incelenebilir. Bu amaç için, nicel-ters transkripsiyon-PCR, in situ hibridizasyon ve immünohistolojik analizi RNA yürütülmektedir. Bu tekniklerin uygulanması zor bir görev içerir; PG veya yumurtalık ayrıntılı diseksiyon. Özellikle meyve sineği PG diğer böcekler bu göreceli olarak daha küçük olan (örneğin ipek böceği ve darbe sineği), bu nedenle bir meyve hayati bir beceri örnekleme için diseksiyon sinek uygulama gerekir. Ayrıca, her iki ecdysteroidogenic organlar innervasyon almakMerkezi sinir sisteminde (MSS) 17, 18, 19, 20 s. Bu nedenle, doğru anatomik analizler için, ecdysteroidogenic organlar CNS ve diğer organlarda, bunların nöronal bağlantıları bozmak için birlikte sağlam tutulmalıdır.
Burada diseksiyon ve D Sterpidojenik organların görüntülenmesi için protokoller sağlamaktadır. melanogaster. diseksiyon tekniğini öğrenmek bu deneyler için anahtar bir başlangıç noktasıdır. Buna ek olarak, bir başarıyla birkaç antikorlar ve GAL4 sürücü hatları ile steroidogenik organları yanı sıra interaktif organları etiketleyebilirsiniz. bu teknikler, malzeme ve genetik yararlanarak, bir steroid hormon biyosentezindeki kapsamlı mekanizmaları incelemek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: protokolleri genel şeması Şekil 1 'de gösterilmiştir.
1. Larvaların halkası Gland Diseksiyon (RG)
NOT: D'de. cyclorrhaphous Diptera ait melanogaster, PG, bileşik endokrin organ halka bezi (RG, Şekil 2D) adı içindedir. Bu PG cerrahi (daha sonra ele alınmıştır) diğer hücre tiplerinden ayrılır, imkansız olduğu için, pratik bir hedef diseksiyon ile de dokunulmamış, hasarsız RG izole etmektir.
- Uygun gelişim aşamalarında larvalarının hazırlanması
NOT: D. melanogaster larvalarının gelişim aşamalarını senkronize etmek için, dar bir zaman aralığında yumurta toplamak için ve uygun zamanlarda larvaları toplamak için gereklidir.- 25 ° C'de bir üzüm suyu agar plakası üzerinde 2 saat boyunca yumurta toplayın.
- Toplayın 1 yumurtadan yeni çıkmış
- Uygun bir zaman noktasında, istenmeyen yaralanmaları önlemek için tek bir plastik döngü ile aşamalı larvaları toplamak. 3. instar larvaları gelişimsel ilerlemesinde bir fark en aza indirmek için, 70 Hael (48 Hah) fazla 2. evre larvaları toplamak ve onları 2 saat aralıklarla dökülmüyor sağlar. Daha sonra, L3 ecdysis sonra 2 saat içinde 3. instar larvaları toplamak; Bu prosedür 0-2 hAL3E larvaları verir.
- fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile doldurulmuş bir tabak için aşamalı larva aktarın.
- Vücuttan kalan yiyecek çıkarmak için PBS ile larva durulayın.
- Bir altında larva Kaba diseksiyondiseksiyon mikroskobu
- forseps ile larva ağzı kancasını tutun. Mikro makas kullanılarak gövde uzunluğunun ön üçte biri larva vücut Sever.
- Forseps bir çift ile ön larva vücudunun kesik ucunu tutun. Forseps diğer bir çift kullanarak, yavaşça gövdenin içine doğru baş ucu itme; Bu prosedür tersyüz larva vücut döner.
NOT: Bu adım 1. evre larvalar diseksiyon için atlanabilir. - adımları tekrarlayın 1.2.1-1.2.2 ek larvaları ile 5-10 dakika boyunca.
NOT: larva sayısı diseksiyon için zaman kazanmak için eşit veya 20'den küçük olmalıdır.
- Larvalarının Fillet diseksiyon
NOT: Bu yöntem, dokuların konuma tutma bozulmadan kalmasını sağlar.- Sadece 1 saat boyunca suda larvaları bırakın. Larvalar boğulma nedeniyle hareketsiz kılınmıştır.
- bir silikon kaplı PBS bir damla bir larva dorsal tarafına koyunyemek, dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde.
NOT: sırt tarafında boylamasına uzanan 2 trakeal tüpleri yer alır. - bir mikroskop altında, forseps kullanılarak larva ön ucu içine bir böcek pimi takın. arka tarafına larva vücut Stretch ve larva posterior ucu içine ikinci bir pimi koydu.
Not: böcek iğneli ek olarak, tungsten telden yapılmış bir iğne 21 yararlı olabilir. Bir iğne, bir kesme iğne olarak kullanım için ısıtılarak bir pipet ucu gömülü olabilir. - bir mikroskop altında, mikro makas ile kuyruk yakın küçük bir kesi yapmak. kesi itibaren kafasına doğru dorsal orta hat boyunca uzunlamasına sırt manikür kesti. manikür altında dokuları zarar vermemeye özen gösterin.
- her iki tarafta bodywall manikür gerin ve disseke bodywall her köşesindeki 4 işaretçilerine yerleştirin.
- , Forseps ile ön yağ gövdesinin bir kısmını çıkarmak beyin-RG c açığayüzeyinde açığa omplex. Gerekirse, tükürük bezlerinin bir çift çıkarın.
- Sabitleme ve immünohistokimya ile doku boyama
- 500 uL (PBS içinde% 4 paraformaldehid) düzeltme çözeltisi ile doldurulmuş bir 1,5 mL'lik bir mikro tüpe larva organları (aşama 1.2.2) ön üçte biri koyun. sabitleyici uygun olmayan bir seyreltme neden olabilir, aksi takdirde, PBS sabit örnekleri bağlanmış bir seferde en az 20 numune, sabitleyin. fileto diseksiyon için, PBS bir damla kaldırmak ve daha sonra düzeltme çözümün bir damla ekleyin.
Not: düzeltme çözümü için,% 3.7 formaldehid veya% 4 paraformaldehit ya kullanılabilmektedir. - 4 ° C 'de, alternatif olarak 2 saat süre ile oda sıcaklığında (RT) ya da 30 dakika için düzeltme çözeltisinde kesildi dokuları inkübe edin.
- 500 uL PBS ile düzeltme çözeltisi yerine ve hızlı bir şekilde numuneler 3 kez yıkayın. Ar bir rocker 15 dakika boyunca 500 uL% 0.3 PBT (PBS +% 0.3 oktilfenol etoksilat) ile örnekleri yıkayınT. köşe diseksiyon, böceğe iğneleri kaldırmak ve 1.5 mL'lik bir mikro tüpe örnekleri aktarın.
Not: dokulara antikorların geçirgenliğini artırmak için numuneler oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 1-2 saat için 500 uL% 2.0 PBT tedavi edilir. - çözeltisi (PBT içinde% 2 sığır serum albümini) ile bloke 500 uL PBT değiştirin. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 1.5 saat boyunca inkübe edin.
- 50 uL primer antikor çözeltisi bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş örneğin antikorlar ile bloke çözeltisi değiştirin.
- gece boyunca 4 ° C'de bir sallama düzeneği üzerinde inkübe edin.
- 500 uL% 0.3 PBT ile primer antikor çözeltisi yerine ve hızlı bir şekilde numuneler 5 kez çalkalayın. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 15 dakika her biri için 500 uL% 0.3 PBT ile numuneler 3 kez yıkayın.
- 50 uL ikinci antikor çözeltisi (blokaj çözeltisi içinde seyreltilmiş boya ile konjüge edilmiş antikorlar) ile% 0.3 PBT değiştirin. nükleer boyama, 0.5 uL 4' , 6-diamidino- için2-fenilindol (DAPI, 0.1 mg / mL stok solüsyonu) 50 uL çözelti ilave edilir. Oda sıcaklığında ya da seçenek olarak bir gece boyunca 4 ° C 'de 2 saat süre ile bir rocker inkübe edin.
NOT: Karanlıkta örnekleri tutun. - 500 uL% 0.3 PBT ile antikor çözeltisi yerine ve 5 kez çalkalayın. Oda sıcaklığında 15 dakika her biri için 500 uL% 0.3 PBT ile numuneler 3 kez yıkayın.
- 500 uL (PBS içinde% 4 paraformaldehid) düzeltme çözeltisi ile doldurulmuş bir 1,5 mL'lik bir mikro tüpe larva organları (aşama 1.2.2) ön üçte biri koyun. sabitleyici uygun olmayan bir seyreltme neden olabilir, aksi takdirde, PBS sabit örnekleri bağlanmış bir seferde en az 20 numune, sabitleyin. fileto diseksiyon için, PBS bir damla kaldırmak ve daha sonra düzeltme çözümün bir damla ekleyin.
- Beyin-RG kompleksinin İnce kesme PG'yi içeren ve içine monte
- % 0.3 PBT ile doldurulmuş bir tabak için immüno örnekleri aktarmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın.
NOT: diseksiyon ve montaj esnasında rahatsız edici kabarcıklarını önlemek için,% 0.3 PBT PBS ile değiştirilebilir. - bir mikroskop altında, forseps bir çift üst deri veya ağız kanca tutun. Bir "bıçak" olarak 1 ml şırıngaya bağlanmış bir 27 G iğne kullanılarak, vücut kütikül beyin-RG-göz diski kompleksi kaldırmak için yemek borusu ve göz diskleri ön ucu kesilmiş.
- Sepaforseps ile beyin-RG göz disk kompleksinden yemek borusu ve bağırsağı oranı. Yemek borusu ventral sinir kablosu (VNC), yukarıdaki beyin üzerinden geçtiğinden, arka tarafına gut çekin.
NOT: örneklerinden ekstra hayali diskleri kaldırmak bir iğne bıçakla beyinde, göz diskler ve bacak diskler arasındaki bağlantıları kesmek için. - Diğer örnekler için adımlar 1.5.1-1.5.4 tekrarlayın.
NOT: örnekler yapışmasını doku kalıntıları önlemek% 0.3 PBT veya PBS ile doldurulmuş farklı temiz bir tabak için tamamlanan her örnek aktarmak için. - mikropipet ile temiz bir cam slayt ortasına örnekleri aktarın.
NOT: 2 nci veya 3 instar larvaları için, bir mikro pipet ucu bir jiletle kesilmiş olmalıdır. - bir mikroskop altında, forseps kullanılarak dorsal tarafına kadar olan bireysel numunelerin hizalayın.
Not: RG Şekil 2A (beyin sırt tarafında yer almaktadır). Bu hizalama görüntüleme sırasında tek tek numunelerin özelliklerini kolaylaştırır. - Bir cam slayt yatırın ve mümkün olduğu kadar fazla PBT silin. slayt bir tarafında montaj reaktif bir damla koyun. damla diğer taraftan bir kapak slip kenarını ve forseps ile yavaş yavaş örnekleri kapak kayma koydu.
NOT: Bu prosedür kapak kayma dışında hareket etmesini örnekleri engeller. - 4 ° C'de örnekleri saklayın. Karanlıkta örnekleri tutun.
- % 0.3 PBT ile doldurulmuş bir tabak için immüno örnekleri aktarmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın.
2. Yumurtalık diseksiyonunda Yetişkin Dişiler
- Yetişkin kadın hazırlanması
- 3-4 gün yumurtalık kadar şişmanlatıyor Yem dişi standart maya / mısır unu sinek gıda ile uçar. 25 ° C 'de muhafaza edin.
- Yetişkin kadın yumurtalığı diseksiyonu
- Kadın CO2 gazı ile uçan anestezisi ve kafalarını kesti.
- 3 cm'lik çanak sinek organları aktarınPBS ile doldurulur.
- bir mikroskop altında, forseps kullanılarak sırt tarafında göğüs kafesi tutun. Diğer forseps ile karın kademeli A5 ya da A6 tutun ve arka tarafına doğru karın kütikül soyarak. forseps ucu yapışkan kütikül silin.
- Bir yumurta kanalının sıkıştırın ve vücuttan yumurtalık çıkar.
- Tarak ve forseps ile yumurtalık ipuçlarını yayıldı.
NOT: Bu işlem immünboyanmadan verimliliğini artırır.
- Yetişkin kadın beyninde, VNC ve üreme organlarının Diseksiyon.
NOT: Bu yöntem yumurtalık inervasyonu bozulmadan muhafaza edilmesini sağlar.- Kadın CO2 gazı ile uçan anestezisi ve PBS ile doldurulmuş bir silikon kaplı tabak aktarın.
- Diseksiyon mikroskobu altında, burnumun tutun ve forseps ile beyin maruz kafa manikür soyarak. beyne bağlı trakea çıkarın.
NOT: brain, beyaz ve yuvarlak bir yapıdır. Beyin toraks VNC bağlanır. - sırt tarafında toraks tutun ve forseps bir çift bacak ve kanatları kesti. Forseps diğer bir çift kullanılarak, bacakların bazlardan göğüs ventral kütikül soyarak. VNC ortaya çıktığında, VNC forseps kullanılarak bağlanmış kalan sırt kütikül ve kasların çıkarın. beyin ve VNC arasındaki bağlantıyı zarar vermemeye özen gösterin.
- Karın manikür soymaya yumurtalık ve nöronlar, kırpma, gut, yumurta kanalı, rahim ve suç ortağı bezi de dahil olmak üzere interaktif organları açığa forseps kullanın.
- trakea ve forseps kullanarak yağ vücutta dahil kalıntı dokuları çıkarın.
- Sabitleme ve immünohistokimya ile doku boyama
- 250 uL ile dolu bir 1,5 mL'lik bir mikro için düzeltme çözeltisi yumurtalıkların yaklaşık 8-10 çift transfer (% 4 paraformaPBS içinde kulanılan) ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca numune inkübe edin.
- 500 uL PBS ile düzeltme çözeltisi yerine ve hızlı bir şekilde numuneler 3 kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında her biri 5 dakika için numuneler 500 uL% 0.1 PBT ile 2 kez yıkanır.
- çözümü engelleme 50 uL PBT değiştirin. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 1 saat inkübe edin.
- 50 uL primer antikor çözeltisi ile bloke çözeltisi değiştirin.
- gece boyunca 4 ° C'de bir sallama düzeneği üzerinde inkübe edin.
- 500 uL% 0.1 PBT ile primer antikor çözeltisi değiştirin. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 15 dakika her biri için 500 uL% 0.1 PBT ile numuneler 3 kez yıkayın.
- 50 uL ikinci antikor çözeltisi ile% 0.1 PBT değiştirin. nükleer boyama için, 50 uL çözelti 0.5 uL DAPI ekleyin. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 2 saat inkübe edin.
- 500 uL% 0.1 PBT ile ikincil antikor çözeltisinin değiştirin. 500 uL% 0.1 PBT ile numuneler 3 kez yıkayın Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 15 dakika her biri için.
Not: yıkama prosedürü bir gece boyunca 4 ° C'de yapılabilir. Karanlıkta örnekleri tutun.
- Cam slaytlar üzerine örnekleri Montaj
- % 0.1 PBT bir mikropipet kullanılarak bir cam slayt örnekleri aktarın.
NOT: diseksiyon ve montaj esnasında rahatsız edici kabarcıklarını önlemek için,% 0.1 PBT PBS ile değiştirilebilir. - yumurtalık, bir mikroskop altında forseps ile birbirinden ovarioles dizilerini ayırır. germaria içeren ovarioles uçlarını zarar vermeyin. beyin VNC-üreme organı kompleksi için, artık kütikül kaldırmak ve bir cam slayt pozisyonu sağlayabilir.
- mümkün olduğu kadar fazla PBT silin ve numunelerin merkezi montaj reaktif bir damla koymak. yavaşça forseps kullanarak bir kapak kayma yerleştirin.
- 4 ° C'de örnekleri saklayın. Karanlıkta örnekleri tutun.
- % 0.1 PBT bir mikropipet kullanılarak bir cam slayt örnekleri aktarın.
- mikroskop altında örnekleri gözlemleyin ve görüş alanında steroidojenik organları getir. görünüm düzeltildikten sonra, görüntü elde etme moduna görüntüleme sistemini açmak.
NOT: 10-20X objektif lensler beyin-RG kompleksi veya tüm yumurtalığı görüntülerini elde etmek için kullanılır. Seçenek olarak ise, 40-63X objektifler (su ya da yağ daldırma) GSC 'lerin veya PG ve yumurtalık nöronal innervasyon proteinlerin hücre içi lokalizasyonu görselleştirmek için kullanılır. - ekli yazılıma görüntü elde etme parametrelerini ayarlayın. Floresan kombinasyonu (örneğin GFP ve RFP) seçin. hızlı tarama prosedürü ile, lazer gücü, detektörlerin duyarlılığı (kazanç / ofset) ve iğne deliği boyutunu ayarlamak.
NOT: Yüksek kalitede görüntü elde etmek için, tarama lazer gücü ve dedektör (Kazanç) duyarlılığı her numune için optimize edilmelidir. şeklinin ana hattını içindokuların, iletilen ışık görüntü bir floresan görüntü ek olarak alınabilir. - Görüntülerin Z yığınlarını atın. Sürekli hızlı tarama sırasında mikroskop odağı sürücüsüyle odak düzlemi taşımak ve başlangıç konumunu ve son konumu ayarlayabilirsiniz. dilim sayısı ve dilimler arasındaki aralık mesafe buna göre ayarlanır.
- Tarama hızı, tarama yöntemi ve çift yönlü tarama modunu seçin.
- görüntü elde etmek için "gerçek taramalar başlat".
- ekli yazılımın formatı ile görüntü kaydetme.
NOT: Orijinal resim dosyaları görüntü elde etme parametreleri ve ölçeklerin bilgiler içerir. Dışa görüntüler bilgisayara 22 bir görüntü işleme yazılımı kullanılarak işlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz steroidogenik organları ve D. melanogaster larvaları ve yetişkin kadınlarda onların interaktif organ incelemeleri için yukarıdaki protokoller kullanılır. Protokolleri genel şeması Şekil 1 'de gösterilmiştir.
PG (Şekil 2D), beyin göre daha küçük ve daha şeffaf olduğu ve beyin (Şekil 2A-C ve 3A-E) ön-sırt tarafında yer de dahil olmak üzere, RG,. PG hücreleri etiketlemek için, çeşitli gruplar ecdysteroidogenic enzimlerine karşı antikorların çeşitli yarattı (yani Neverland 23, örtü 20, Phantom 25, 25 bedensiz ve 26 Gölge, 24 spookier). Bunlar arasında, bir anti-Örtü (Sro) antikoru güvenilir imüno-boyama ile PG etiketlemek için kullanılır (Şekil 2C, 2E, ve Şekil 3C). Seçenek olarak ise, BinarY gen sentezleme sistemi, GAL4 / UAS sistemi 27, PG hücrelerinde floresan protein genleri ifade etmek için kullanılabilir. Ecdysteroidogenic gen hayali (phr) promoter analizi sayesinde, PG-spesifik promotör PG 28 münhasıran gen ifadesini endükleyebilen. Bu nedenle, PG hücreleri spesifik phm-GAL4 # 22 (Şekil 3D) kontrolü altında GFP veya RFP ifade edilmesi ile görselleştirilebilir.
PG ve beyin arasında nöronal bağlantı görselleştirmek için, nöronların bir grubu, çeşitli GAL4 sürücüler ve antikorları (Şekil 2C, 2E, 3B ve 3E) kontrolü altında mCD8 :: GFP ile etiketlenebilir. GAL4 hat koleksiyonlarından FlyLight veritabanı etiketleme nöronlar 29 için optimize edilmiştir. Bunlar arasında, GMR45C06-GAL4 nöronlar (Şekil 2C ve E) PG-çıkıntı etiketler. imanti-GFP antikor ile GFP eksprese eden larva munostaining GFP sinyalleri artırmada etkilidir. Ayrıca, TRH-GAL4> mCD8 :: GFP larva hangi serotonerjik nöronlar proje içinde değil sadece PG, aynı zamanda proventriculus (PV, böcek ön bağırsak) ve farenks kaslarının (PM) (Şekil 3B ve stomatogastric sinir sistemini göstermek e) 20, 30. Nedenle, RG, beyin ve köşe diseksiyonlarda diğer çevre dokulara (Şekil 3) konumunu korumak için önemlidir.
Yetişkin kadın, yumurtalık ekdisteroid gibi GSC proliferasyonu, kist farklılaşması, yumurta odası büyüme ve stres tepkisi 11 ile oogenezisin birçok özelliğini etkiler. PG olduğu gibi, yumurtalık ecdysteroidogenic enzimler de, 31, 12, yukarıda tarif edilen spesifik antikorlar ile görselleştirilmiştir.Bir alt olay bunun üzerine hareket ekdisteoidlerden gibi, germarium GSC 'lerin sayısı eden odaklama (Şekil 4). Germarium çok sayıda hücre tipinde bir düzenek olsa da, GSC'ler iki GSC marker antikorlar, 1B1 ve D, E-kadherin 32 imüno-boyama ile belirlenir. Yumurtalık innervasyon görselleştirmek için, yumurtalık, beyin, VNC, gut, kırpma, uterus ve spermateka (Şekil 5) ile birlikte incelenmek üzere kesip ayrılır. Nöronlar nSyb-GAL4, bir pan-nöronal sürücü (Şekil 5 B ve D) kontrolü altında mCD8 :: GFP tarafından görüntülenmiştir. yumurtalık, uterus ve bağırsak etrafında kaslar boya-konjüge edilmiş falloidinle boyanır.
Şekil 1: protokolleri genel şeması. İki farklı diseksiyon Methods Applic olanDeneylerin amacına bağlı olarak ve yetişkin kadın larva mümkün. Montaj yöntemleri de örnek koşullarına göre oluşturulmaktadır. Sabitleme, boyama ve görüntüleme teknikleri Tüm numunelere temelde yaygındır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: PG PG-çıkıntı Nöronlar görselleştirilmesi. (A ve B) vahşi-tür 3. instar larvasının beyin halkalı bezi (RG) kompleksi. (B) 'de, PG noktalı çizgilerle belirtilmiştir. beyin ve RG arasında ipliksi yapı trakea olup. (Cı - E) PG innervasyon mCD8 ile görselleştirildi ::FlyLight koleksiyonunda GMR45C06-GAL4 tarafından tahrik GFP. PG ve GFP pozitif nöronların sırasıyla, anti-Sro antikoru (eflatun) ve anti-GFP antikoru (yeşil) ile etiketlenmiştir. floresan görüntü dokuların hatlarını belirlemek için iletilen ışık görüntü ile birleştirilir. (D) 'de, PG, korpus allata (CA) ve korpus Cardiaca (CC) gösterilmektedir. PG-çıkıntı nöronlar 10X objektif lens (C) düşük güç resimden daha 40X objektif merceği (E oklar) ile yüksek güç görüntüde daha fazla belirgindir. Ölçü bar = 100 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: PG, PV için Stomatogastric sinir sistemi Projeler, nd PM. (A ve B), bir vahşi tip 3. instar larvasının köşe diseksiyon. PG, beyin (Br) pozisyonları, ventral sinir kablosu (VNC), göz diskler (ED), kanat diskler (AS) faringeal kas (PM) ve proventrikülüs (PV) değişmeden kalır. (C), PG, özel olarak bir anti-Sro antikoru (eflatun) ile etiketlenmiştir. (D) PG phm-GAL4 # 22 tarafından tahrik edilen turboRFP ile etiketlenmiştir. Serotonerjik sinirler, anti-5-HT antikoru (yeşil) ile etiketlenmiştir. (E) stomatogastric sinir sistemi TRH-GAL4 ile tahrik mCD8 :: GFP ile görselleştirildi. Serotonerjik nöronlar PG, PM ve PV (oklar) tahmin etmekteyiz. Ölçü bar = 100 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
dosyaları / ftp_upload / 55519 / 55519fig4.jpg"/>
Şekil 4: Bir, iki ya da üç GSC'lerin içeren vahşi tip Sineklerin Germaria. (A), dişi üreme organının bir bakış. Bir yumurtalık yumurta odalarının dizeleri 16-20 ovarioles oluşmaktadır. GSC'ler bulunduğu germarium, her ovaryol ucunda yer almaktadır. (B - D), bir, iki, ya da üç GSC'ler vahşi tip kadınlarda her germarium (beyaz noktalı daireler) yer almaktadır. GSC'ler spectrosome (oklar) olarak adlandırılan bir küresel yapısı ve fusome olarak bilinen bir zar sitoskeletal yapı etiketler 1B1 antikoru (yeşil) ile boyanır. Hücre sınırları anti D E-kaderin antikoru (kırmızı) ile görselleştirilir. Ölçek çubuğu 10 um =. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 5: Kadının üreme organları ve bunların Etkileşimli Organlar. (A), yumurtalık (Ov), gut (hazım), ürün (Cr), beyin (Br), ventral sinir kablosu (VNC) ve kesesi (Sp) mikroskop altında kesilmiştir. (B - D), yumurtalık innervasyonunun nSyb-GAL4 ile tahrik mCD8 :: GFP ile görselleştirildi. GFP pozitif nöronların yumurtalık (ok başları) yüzeyine çıkıntı yapan, VNC (ok) kadar uzanır. Yumurtalıklar noktalı çizgilerle belirtilmiştir. Örnekler, anti-GFP antikoru (yeşil) ile boyanmıştır ve boya birleşmiş falloidin (kırmızı) ilave edilmiştir. ipliksi yumurtalıkların etrafında kasların aktin (Ov) ve rahim (Ut) ile ortakları faloidin. örnekleme C. Ölçü bar = 200 um gösterilmiştir.rge.jpg" target = '_ blank'> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz ekdisteroid biyosentezi ve D. melanogaster düzenleyici mekanizma inceledi ve diseksiyon ve immün için bir protokol geliştirmiştir. Ekdisteroid biyosentezi zamanlaması nöronal girişler 33 boyunca çevresel olaylara etkilenir, nedenle diseksiyon sırasında beyin, VNC ve diğer dokuları ile birlikte ecdysteroidogenic organların innervasyon korumak için esastır.
Yukarıda tarif edildiği gibi, D. melanogaster PG korpus allata (CA) ve korpus cardiaca (CC) (Şekil 2D) ile kompleks endokrin organ RG oluşturur. PG ekdisteoidlerden üretirken, CA ve CC, sırasıyla genç hormonlar ve adipokinetik hormon üretir. Bu anatomik özellik D ecdysteroidogenesis okuyan araştırmacılara bir engel olmuştur. melanogaster, diğer böcekler ile karşılaştırıldığında. Ancak, geçmiş yıllarda, genetik ha sinekS US özellikle PG 4 olarak ifade edilmiştir birçok ecdysteroidogenic genleri tanımlamak için izin verdi. Bu genler, aynı zamanda hemşire hücreleri veya yumurtalık 34, 35 folikül hücreleri olarak ifade edilmiştir. Şimdi tek mümkün boyanmalarının ve transgenik tekniklerle ecdysteroidogenic hücreleri belirtmek için yapım ecdysteroidogenic organlardaki gen ifadesi profillerinin özel bir takım kullanabilirsiniz.
Diseksiyon sırasında, keskin kenarlar ile ince forseps kullanmak esastır. Diseksiyon önce, forseps kenarları hiçbir boşluk olmadan birlikte kenarları getirmek için Arkansas taşlama taşı ile bilenmiş edilebilir. Diseksiyon, döküntü ya da vücut yağ, gut, ve hayali diskler gibi artık dokular sırasında mümkün olduğu kadar çıkarılmalıdır. Özellikle, yağ vücudun parçaları kolayca ilgi dokusuna sadık. Buna ek olarak, cam slaytlar üzerine numune montaj da yerine olmalıdırdikkatle Ed. kapak kılıfı yapışkan montaj orta numune üzerine yerleştirildiğinde dokuların bir kompleks karıştırılmış olan edilebilir. Bu nedenle, numuneler, yeterli sayıda parçalara gerekir ve bunların uygun örnekleri, örneğin burada RG veya yumurtalık üst taraftadır ve nöronal bağlantıları sağlam kalır gibi, görüntüleme için seçilmelidir.
Başarılı immun boyama yapmak için ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, numune alma ve işleme prosedürleri için aynı koşullar korumak için önemlidir. immün ölçüde yüksek örnekleme ve tespitin zamanda bireysel hayvanların durumuna bağlıdır. Örneğin, hayvanların, yetiştirme sıcaklıklar, besin durumu ve diseksiyon zaman yaşı dikkatle düşünülmelidir. Birden deneylerinde tespit ele alınması hatalarını en aza indirmek için, dikkatli diseksiyon zaman ve sabitleme reaksiyon sürelerini koordine etmek örneklerin neredeyse eşit sayıda tutmak. sabitleme s içineriyiği,% 4 paraformaldehit ya da% 3.7 formaldehid kullanılır. paraformaldehit hızlı bir şekilde zamanla bozulduğundan, söz konusu nesnenin Toz genellikle PBS içinde% 10 stok çözelti yapmak için çözülür ve alikotlar -20 ° C'de saklanır. alikotları her diseksiyon taze% 4 düzeltme çözümü önce yapmak donmaz. Ayrıca, numune geniş yıkama aşamaları arka spesifik olmayan lekeler azaltır.
Görüntü edinimi adımda, biz konfokal mikroskobu için üreticinin protokolünü takip edin. mikroskopi sistemi fluorofor tipleri belirtildiğinde uyarma / emisyon filtreleri optimal setleri otomatik olarak seçilir, öyle ki araştırmacılar veya öğrenciler için kullanıcı dostu bir arayüz sağlar. mikroskopi sistemi kullanımı kolay olsa da, tek bir dedektör kazancı, tarama hızı, tarama numaraları ve iğne deliği boyutunu değiştirerek, her numune ya da her odak düzleminde görüntü elde etme parametrelerini optimize etmek gerekiyor.
36 gibi diğer ecdysteroidogenic geni ürünlerine karşı çeşitli antikorları üretmek için başarısız oldu. Bu sorunu aşmak için, knock-in teknik CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ouija kurulu gen lokusunda bir HA-etiket eklenmesi uygulanabilir. , Immün ile kombinasyon halinde bu gibi transgenik teknikleri kullanarak en az 3-4 proteinleri aynı anda PG ya da yumurtalık görselleştirilebilir. immüno-lekeleme kanıtlanmamıştır protein lokalizasyonu aksine, bununla birlikte, bir yöntem olup, endojen ekdisteoidlerden görselleştirmek için. Anti-ekdisteroid antikor immün için hazır olduğunda, ekdisteroid biyosentez alt hücre lokalizasyonu ve ekdisteroid taşıma gelecekte araştırılabilir. Diğer bir kısıtlama ecdysteroidogenesis zamansal dinamikleri tespit edilmiş olan dokularda araştırılamaz olmasıdır. ekdisteroid titresi gelişim aşamalarında boyunca dalgalandı düşünüldüğünde, ecdysteroidogenic organları ve projelendirme nöronların aktivitesi geçici çeşitli çevresel uyaranlara yanıt olarak düzenlenmelidir. Yeni yapılan bir çalışmada CA canlı görüntüleme teknikleri 37 kullanılarak PG hücrelerinin 2+ dinamiklerini takip. Gelecekteki uygulamalar için, şu anda PG ya da projelendirme nöronlar ile birlikte kültürlü yumurtalıkların canlı görüntüleme için bir protokol geliştiriyorlar. Mevcut metotlar ile ilgili olarak, bu yeni protokol aynı anda nöronların ve bunların hedef organların aktivitesini görselleştirmek amaçlamaktadır. Nöron aktivitesi Ca2 + gösterge GCaMP veya Cameleon 38 ile izlenebilir sonra, uygun bir zamanda Optogenetic veya thermogenetic yaklaşımlarla manipüle edilebilir39 s. Bu yöntemler bir steroid hormon biyosentezi kapsamlı bir anlayış ve nöronal düzenleyici mekanizma katkıda bulunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu iş için kendi teknik destek için Reiko Kise ve Tomotsune Ameku teşekkür ederim. Ayrıca Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stok Merkezi, KYOTO Stok Merkezi (DGRC) ve hisse senedi ve reaktifler için Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası minnettarız. Bu çalışma JSPS KAKENHI Grant Numarası 16K20945, Naito Vakfı ve Inoue Bilim Araştırma Ödülü dan ysn bağışları ile desteklenmiştir; ve mext KAKENHI Hibe Numarası 16H04792 dan RN bir hibe ile.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
References
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
- Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
- Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
- Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
- Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
- Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
- Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
- Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
- Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
- Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
- Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
- Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
- Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
- Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
- Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
- Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
- Parvy, J. -P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
- Li, H. -H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
- Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
- Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
- Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
- Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
- Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
- Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
- Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).
