Summary
DNA metilasyonunu 5-metilsitozin (5-mC) nokta leke bazında ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Kondrosit farklılaşması sırasında 5-mC düzeylerini saptadık. Bu basit teknik ACI tedavisinde kondrosit fenotipini hızlı bir şekilde belirlemek için kullanılabilir.
Abstract
Hiyalin kondrositlerin fibroblastik kondrositlere ayrılması, genellikle in vitro olarak tek katlı kondrosit genişlemesine eşlik eder. Kondrositlerin küresel DNA metilasyon seviyesi, kondrosit fenotipinin kaybedilmesi için uygun bir biyolojik belirteç olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, farklı deneysel yöntemlere dayanan sonuçlar tutarsız olabilir. Bu nedenle, kondrosit farklılaşması sırasında küresel DNA metilasyon seviyelerini ölçmek için kesin, basit ve hızlı bir yöntem oluşturmak önemlidir.
Mevcut genom geniş metillendirme analiz teknikleri büyük oranda bisülfit genomik dizilemesine dayanmaktadır. Bisülfit dönüşümü sırasında DNA bozunumundan ötürü, bu yöntemler tipik olarak büyük bir numune hacmi gerektirir. Küresel DNA metilasyon seviyelerini ölçmek için kullanılan diğer yöntemler arasında, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) bulunur. Bununla birlikte, HPLC, genomik DNA'nın tam sindirimini gerektirir. Ek olarak, HPLC'nin yasakça yüksek maliyetiStrength, HPLC'nin daha geniş bir uygulama alanını sınırlar.
Bu çalışmada, genetik DNA (gDNA) çeşitli geçiş sayılarıyla kültürlenen insan kondrositlerinden ekstrakte edilmiştir. GDNA metilasyon seviyesi bir metilasyona özel dot blot testi kullanılarak tespit edildi. Bu dot blot yaklaşımında, tespit edilecek metile DNA'yı içeren bir gDNA karışımı, daha önce çizilmiş bir dairesel kalıp şablonunun içindeki bir nokta olarak bir N + membranına doğrudan lekelenmiştir. Diğer jel elektroforez esaslı lekelendirme yaklaşımları ve diğer kompleks lekelenme prosedürleri ile karşılaştırıldığında, nokta leke yöntemi önemli zaman kazandırır. Ayrıca, nokta lekeleri, piyasada bulunan bir 5-mC antikor kullanılarak genel DNA metilasyon seviyesini algılayabilir. DNA metilasyon seviyesinin tek katmanlı alt-kültürler arasında farklılaştığını ve bu nedenle kondrosit ayrımlaştıncılığında önemli bir rol oynayabileceğini bulduk. 5-mC nokta leke, genel DNA metilasyon seviyesinin değerlendirilmesi için güvenilir, basit ve hızlı bir yöntemdirKondrosit fenotipi.
Introduction
Otolog kondrosit implantasyonu (ACI), eklem kıkırdak defekti 1 , 2'yi tedavi etmek için nispeten yeni ve en gelişmiş yöntemdir. ACI'da önemli adımlardan biri , in vitro tek katlı kültür yoluyla kondrositlerin çoğaltılmasıdır. Yükseltme sırasında, hiyalin kondrositler fenotiplerini kolayca kaybederler ve difuzensiz hale gelirler; bu ACI tedavisi için istenmeyen 3 , 4'tür . ACI tedavisinin sonucunu optimize etmek için replantasyondan önce kondrosit farklılaşmasının derecesi belirlenmelidir. Kondrositlerin durumunu belirlemek için ekonomik ve hızlı bir yol oluşturmak zorunludur. Son zamanlarda, DNA metilasyonu ve kondrosit ayrımı ayırma arasındaki ilişki çok dikkat çekti 4 , 5 , 6 . DNA metilasyonu,Ich metil grupları DNA'ya ilave edilir ve sonuçta sitozin kalıntılarının 5-metilcytosine (5-mC) dönüştürülmesi sağlanır.
Kondrosit ayrımcılığında DNA metilasyon biyolojisini aydınlatmak için ilk adım şimdiye kadar zorlu olduğu kondrositlerin DNA metilasyon seviyesini değerlendirmektir. Bisülfit genomik sekanslama, DNA metilasyonunu analiz etmek için en yaygın kullanılan tekniktir 7 , 8 . Bu deneyde, bisülfit dönüşümü DNA bozunumuna neden olur ve bu nedenle tahlil için önemli miktarda numune sağlanmalıdır. Ayrıca, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) küresel DNA metilasyon seviyelerini 9 , 10'u ölçmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, HPLC analizi genomik DNA sindirimini gerektirir. Ayrıca ileri ve pahalı deneysel araçlar gereklidir. Bu nedenle, yüksek maliyetin yanı sıra, bu deneysel prosedürler zaman kazandırıcı niteliktedirharcanmasına neden olur. Anti-5-mC antikorlar, şimdi karmaşık genomlardan 5-mC içeren genomik DNA'nın bağışıklık lekelenmesi imkânı yaratan ticari olarak piyasaya sürülmüştür.
Bu raporda, bir dizi tek katmanlı kültür içinde yetiştirilen kondrositlerden genomik DNA çıkardık. İnsanlardaki kondrositlerdeki 5-mC içeriğini farklı sayıda pasajla değerlendirmek için bir nokta blot testi kullandık. Düşük ayrıştırılmış kondrositlerde, düşük dereceli ayrımcılığa sahip kondrositlere kıyasla 5-mC içeriğinin arttığını tespit ettik. Ayrıca, ayrımlaşma durumu ile 5-mC düzeyleri arasında bir ilişki olduğunu tespit ettik. Son olarak, 5-mC içeriğindeki değişikliklerin kondrosit fenotipi ile ilişkili olduğunu bildirdik. Bu nedenle, 5-mC nokta leke testi, kondrositlerdeki DNA metilasyon seviyesini tespit etmek için güvenilir, basit ve hızlı bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Shenzhen İkinci Halklar Hastanesi İnsan Ahlakı Komitesi tarafından onaylandı.
1. İnsan Eklem Kıkırdak Doku Koleksiyonu ve Kondrosit Kültürü
- Malzemelerin hazırlanması
- Dulbecco'nun% 10 sığır fetüsü serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş modifiye kartal ortamı (DMEM) ortamı hazırlayın. 1 mg / mL kollajenaz II,% 0.25 tripsin-EDTA, fosfat tamponlu salin (PBS) ve bir hücre süzgeci (40 μm naylon) hazırlayın.
- İnsan eklem kıkırdak doku koleksiyonu
- Eklem kıkırdağı travma sonrası donör hastaların diz eklemlerinden ayırın. Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onam almak.
- Kıkırdak, 1-2 mm 3 parçaya steril bir neşter kullanarak ve DMEM'de 1 mg / mL kolajenaz II ile kıyılmış kıkırdaktan digest kondrositler 37 ° C'de 12-16 saat boyunca kesilir.
- Ortaya çıkan cel filtrelemeL süspansiyonu, bir hücre süzgeci (40 um) vasıtasıyla süspansiyon haline getirildi ve PBS ile iki kez yıkandı.
- % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomis ile takviye edilmiş DMEM'de bir hemositometre ve tohum yoğunluğunda 20,000-30,000 hücre / cm2 olan hücreleri sayın.
- 37 ° C'de inkübatörde kültür
- Tek katmanlı kondrosit genişlemesi
- % 0,25 tripsin-EDTA kullanarak alt birleşik hücreleri hasat edin ve 6,600 hücre / cm2'lik bir yoğunluğa getirin. Ortamı haftada iki kez değiştirin.
- Tekli tabakalarda altı kanala kadar kondrosit kültür edin ve 1, 2, 3, 4 ve 5. pasajları değerlendirin.
2. Genomik DNA (gDNA) Ekstraksiyonu
- Toplama hücreleri ve 10 milyon hücre başına 500 μL liziz tamponu (15 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0,% 0.5 SDS, 200 μg / mL RNaz A) içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Pipetleme ve hızlı inversiyon ile hücreleri tekrar süspanse edin ve daha sonra 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- birDd proteinase K'yi 160 ug / mL hücre lisat konsantrasyonunda kurutun ve karışım şiddetle tersine çevirin. 6 saat 55 ° C'de inkübe edin.
- Bir hacim Tris pH 7.9 doymuş fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1) numuneye ekleyin. Vorteks veya numuneyi elle yaklaşık 20 s boyunca iyice çalkalayın.
- Numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüjleyin. Üst sulu fazı çıkarın ve katmanı yeni bir tüp haline getirin.
- Fenolü çıkarmak için eşit hacimde kloroform ile özütleyin ve üstteki sulu fazı yeni bir tüpe aktarın.
- 0,1 numune hacmi 3 M sodyum asetat pH 8.0 ve 2 hacim% 100 etanol ilave ederek DNA'yı çökeltin.
- GDNA'yı çöktürmek için tüpü gece boyunca -20 ° C'de saklayın.
- Numuneyi pellet gDNA'ya 16,000 xg'de 10 dakika 4 ° C'de santrifüjleyin.
- Numuneyi% 70 etanol ile üç kez yıkayın ve 13.000 x g'de 4 ° C'de 2 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarT dikkatle ve daha sonra havayla kurutun. DNA'yı 10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA içinde tekrar süspanse edin.
3. DNA Metilasyon Profillemesi
- Üreticinin protokolüne göre, toplam 500 ng genomik DNA kullanarak bisülfit dönüştürme reaksiyonunu gerçekleştirmek için bir DNA metilasyon kiti kullanın. 10 uL elüsyon tamponunda (50 ng / μL) elute edin.
- Üreticinin protokolüne göre ticari bir kit kullanarak DNA metilasyon profillemesini gerçekleştirin.
Dot Blot Analizi
- İzole edilen DNA'yı (örnek başına 1 mg) 0.1 M NaOH içinde 95 ° C'de 10 dakika boyunca denature edin. DNA'yı buz üzerinde 1 M NH4OAc ile nötralize edin ve sonra iki kat seyreltin. N + membranda seri seyreltilmiş genomik DNA'nın 2 μL'sini spotlayın.
- Memeyi 80 ° C'de 30 dakika blot edin.
- N + membranı TBS-T'de% 5 BSA içinde 1 saat ıslatılarak spesifik olmayan antikor bağlanma yerlerini bloke edin. Reaksiyon olarak 10 cm'lik bir Petri kabı kullanınOda sıcaklığında iyon odası.
- TBST'de beş dakika 5 kez yıkadıktan sonra membranı bir gece boyunca 4 ° C'de TBS-T'de bir fare anti-5-metilcytozin (5-mC) monoklonal antikor (1: 1000) ile inkübe edin.
- Membranı TBS-T içinde üç kez beş kez yıkayın ve sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBS-T'de ikincil bir antikor, HRP-konjuge koyun anti-fare immünoglobülin-G (IgG) (1: 5000) ile inkübe edin.
- Membranı TBS-T içinde üç kez 5 dakika yıkayın.
- Enzim substratını membrana ekleyin ve 5-10 dakika inkübe edin. Üreticinin talimatlarına göre bir kemilüminesans kiti kullanarak ikincil antikor sinyalini görselleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kondrositler, pasaj 6'ya kadar tek tabaka halinde kültürlendi (P6). Kondrositler tek katmanlı kültürün ardışık geçişlerinde ilerleyici fenotipik değişiklikler gösterdi. P0 kondrosit morfolojisi yuvarlak iken, hücreler P6'ya kadar ardışık pasajlarla son derece sıkıştı ve düzleşti ( Şekil 1 ). Bu morfolojik değişiklik, kondrosit ayrım ayırma işleminin tipik bir örneğidir. Bu arada ısı haritasının sonuçları CpG sitelerinin genel metilasyon seviyesinin uzun süreli altkültür ile birlikte arttığını gösterdi. 5-mC nokta leke analizi ayrıca, daha yüksek CpG metilasyon seviyelerinin kondrosit yayılımına eşlik ettiğini göstermiştir ( Şekil 2 ). Bu sonuçlar genel olarak artmış metilasyon seviyeleri ile kondrosit farklılaşması arasında bir ilişki olduğunu düşündürmektedir.
Şekil 2: Kondrositlerin gDNA'sının 5-mC'ye spesifik nokta blot testi. Genomik DNA, değişen sayıda pasajdan sonra kondrositlerden izole edildi. Progresif olarak yükselmiş 5-mC seviyeleri gözlendi. Nokta başına 200 ng, 100 ng, 50 ng ve 25 ng gDNA yüklenmiştir. ( A ) 5-mC'ye özel nokta leke resmi; ( B ) ImageJ tarafından nokta yoğunluğu analizi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro kondrosit farklılaşması, kıkırdak defekti onarımı tedavisinde ACI sonuçlarını ciddi şekilde tehlikeye atar 11,12. ACI sonuçlarını optimize etmek için ayrılmamış kondrositlerin kullanılmasını önlemek çok önemlidir 13 . Çalışmalar, genel DNA metilasyon seviyesinin kondrosit dediferansiyasyonunun derecesi ile ilişkili olduğunu ileri sürdü4,6. Bu nedenle, klinik uygulamasından önce kondrositlerin genel DNA metilasyon durumunu saptamak için güvenilir ve hızlı bir yöntem oluşturmak zorunludur.
Ayrışık insan kondrositlerinde genel DNA metilasyon seviyelerini saptamak için, seri geçişli kondrositlerdeki 5-mC seviyesini ölçebiliriz. 5-mC, bisülfit ile deaminasyona dirençlidir. Bu özellik, DNA sitozin metilasyon modellerini tBisülfit sıralama yaklaşımı 14 . Bisülfit genomik sekanslama ve metilasyona duyarlı kısıtlama sindirimi, DNA metilasyonunun tespiti için altın standart teknolojiler olarak kabul edilmiştir 15,16. Bu yaklaşımlar 5-mC'yi tekli baz çiftli çözünürlükle tanımlayabilir. Bununla birlikte, bisülfit diziliminin en büyük dezavantajı, bisülfit dönüşümü sırasında DNA bozunmasıdır. Bu yaklaşım kondrosit ayrımını değerlendirmek için kullanılıyorsa, ACI için yayılmış kondrositlerin boşa gitmesine neden olur. HPLC, küresel DNA metilasyon seviyelerini ölçmek için uygulanabilir bir başka yöntemdir, ancak sadece HPLC ekipmanı olan laboratuarlar için uygundur. Bu nedenle, daha büyük numune hacimleri veya modern teçhizata duyulan ihtiyaç, bu yaklaşımları tipik klinik laboratuvarlarda rutin 5-mC düzey testleri için pratik yapmaz hale getirmektedir.
5-mC antikorun ticari olarak bulunabilirliği,Bir dot blot tahlili ile genel DNA metilasyon seviyeleri. Diğer lekelenme teknikleriyle karşılaştırıldığında, 5-mC nokta leke, büyük miktarda gDNA veya elektroforez gerektirmeyen daha kolay bir prosedürdür. Buna ek olarak, cihazlar orta derecede donanımlı laboratuarlarda mevcuttur. Dolayısıyla, DNA metilasyon tahlilinin alternatif bir yaklaşımı olarak 5-mC nokta leke yöntemi uygulanabilir olmalıdır.
Bu raporda, yüksek 5-mC seviyeleri ile kondrosit ayrımlaşması arasında bir ilişki tespit ettik; 5-mC düzeyleri alt kültür geçişleri arttıkça artmıştır. Bulgularımız, 5-mC'nin tek katmanlı kondrosit genişleme koşullarının neden olduğu ayrımlaşmaya neden olabileceğini düşündürmektedir. Daha da önemlisi, yüksek 5-mC düzeyleri, kıkırdak kusurlarını onarmak için ACI'nın geniş bir şekilde uygulanmasını engelleyen, kondrosit fenotipi kaybıyla ilişkili olduğunu bulduk. Bu nedenle, çalışma sonuçlarımız, 5-mC nokta lekeleme işleminin,Kondrosit ayrımcılığı, özellikle de çok sayıda numune ve daha küçük gDNA miktarı analiz edildiğinde.
Nokta leke yöntemlerini DNA metilasyon analizine uygulamak için dikkate alınması gereken en önemli husus, DNA örneğinin kalitesidir. Bu nedenle, nokta leke yoluyla 5-mC tespitinde kritik adım, genomik gDNA ekstraksiyon basamağıdır. Araştırmacılar, gDNA konsantrasyonunu ve saflığını en üst düzeye çıkarmak için piyasada bulunan bir gDNA ekstraksiyon kiti kullanmanızı öneririz. Buna ek olarak, DNA numunesi bir naylon zar üzerine yüklenmelidir. Bir diğer önemli husus, DNA numunesinin naylon membranla hareketsiz kılınmasını ve tamamen emilmesini sağlamaktır.
Burada anlattığımız teknik, bize en düşük maliyetle birden fazla tahlil yapma fırsatı verir. Bu yaklaşımın ilave bir avantajı, testi gerçekleştirmek ve sonuçları yorumlamak için basit ve uygun fiyatlı ekipmana güvenmesidir. Ayrıca, göreli karşılaştırmak için kullanılabilir2 veya daha fazla numune arasındaki küresel metilasyon seviyelerindeki farklılıklar. Bununla birlikte, bu tahlil, DNA metilasyon seviyelerinin hassas bir şekilde ölçülmesi için veya belirli bir DNA sekansının CpG metilasyon durumunu belirlemek için kullanılamaz. Ayrıca, 50 ng'nin altındaki gDNA örneklerinde metilasyon durumu doğru olarak tespit edilemediğinden, bu yöntem sınırlı hassasiyete sahiptir. Bu yöntem, küresel DNA metilasyonunun niteliksel bir analizini yapsa da, uygunsuz bir şekilde uygulandığında yanlış-pozitif sonuçlara neden olabilir.
Özetle, 5-mC nokta leke, kondrosit fenotipini değerlendirmek için genel DNA metilasyon seviyesinin saptanması için güvenilir, basit ve hızlı bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.
Acknowledgments
Bu çalışma aşağıdaki hibeler tarafından desteklenmiştir: Çin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81572198, No. 81260161, No. 81000460); Guangdong Eyaleti, Çin Doğal Bilimler Vakfı (No. 2015A030313772); Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı Finanse Projesi (No. 2013M530385); Çin'in Guangdong Eyaletindeki Tıbbi Araştırma Kurumu (No. A2016314); Shenzhen Bilim ve Teknoloji Projeleri (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
