En 5-mC prikkblot-analyse Kvantifisering av DNA-metyleringsnivået av kondrocyt-diffusjon Published: May 17, 2017 doi: 10.3791/55565

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Zhaofeng Jia^1,2, Yujie Liang³, Bin Ma^4,5, Xiao Xu^2,6, Jianyi Xiong², Li Duan², Daping Wang^1,2

¹Guangzhou Medical University, ²Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopeadic Engineering, Department of Orthopedics, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), ³Department of Chemistry, The Chinese University of Hong Kong, ⁴School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, ⁵Renji Hospital Clinical Stem Cell Research Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ⁶Shantou University Medical College

Summary

Vi presenterer en metode for å kvantifisere DNA-metylering basert på 5-metylcytosin (5-mC) dot blot. Vi bestemte oss for 5-mC nivåene under chondrocyt dedifferentiering. Denne enkle teknikken kan brukes til å raskt bestemme kondrocytfenotypen ved ACI-behandling.

Abstract

Den dedifferentiering av hyalinkondrocytter til fibroblastiske kondrocytter følger ofte monolag-ekspansjon av kondrocytter in vitro . Det globale DNA-metyleringsnivået for kondrocyter anses å være en egnet biomarkør for tap av kondrocytfenotypen. Imidlertid kan resultater basert på forskjellige eksperimentelle metoder være inkonsekvente. Derfor er det viktig å etablere en presis, enkel og rask metode for å kvantifisere globale DNA-metyleringsnivåer under kondrocyt dedifferensiering.

Aktuelle genom-brede metyleringsanalyse teknikker bygger i stor grad på bisulfitt genomisk sekvensering. På grunn av DNA-nedbrytning under bisulfittomdannelse krever disse metodene typisk et stort prøvevolum. Andre metoder som brukes til å kvantifisere globale DNA-metyleringsnivåer inkluderer høyytelsesvæskekromatografi (HPLC). HPLC krever imidlertid fullstendig fordøyelse av genomisk DNA. I tillegg er forbudt høye kostnader for HPLC iStruments begrenser HPLCs bredere anvendelse.

I denne studien ble genomisk DNA (gDNA) ekstrahert fra humane kondrocyter dyrket med varierende antall passasjer. GDNA-metyleringsnivået ble detektert under anvendelse av en metyleringsspesifikk dot-blot-analyse. I denne dot blot-tilnærmingen ble en gDNA-blanding inneholdende det metylerte DNA som skal detekteres, spottet direkte på en N ⁺ -membran som en prikk inne i et tidligere tegnet sirkulært malemønster. Sammenlignet med andre gelelektroforese-baserte blotting-tilnærminger og andre komplekse blottingprosedyrer sparer dot blot-metoden betydelig tid. I tillegg kan dotblots detektere det totale DNA-metyleringsnivå ved bruk av et kommersielt tilgjengelig 5-mC antistoff. Vi fant at DNA-metyleringsnivået varierte mellom monolag-subkulturer, og kunne derfor spille en nøkkelrolle i kondondrocyt dedifferentiering. 5-mC dot blot er en pålitelig, enkel og rask metode for å oppdage det generelle DNA-metyleringsnivået for å evaluereE kondrocyt fenotype.

Introduction

Autolog chondrocytimplantasjon (ACI) er en relativt ny, state-of-the-art prosedyre for behandling av leddbruskdefekter ^{1 , 2} . En av de avgjørende trinnene i ACI er amplifisering av kondrocytter via monolagskultur in vitro . Under amplifisering, taper hyalinkondrocytterene lett sin fenotype og blir dedifferentiert, noe som er uønsket for ACI-behandling ^{3 , 4} . For å optimalisere utfallet av ACI-behandling, bør omfanget av kondrocyt dedifferentiering bestemmes før genplantning. Det er viktig å etablere en økonomisk og rask måte å bestemme kondrocytternes status på. Foreningen mellom DNA-metylering og kondrocyt dedifferentiering har nylig tiltrukket seg mye oppmerksomhet ^{4 , 5 , 6} . DNA-metylering er en prosess av whI metylgrupper tilsettes DNA, noe som resulterer i omdannelse av cytosinrester til 5-metylcytosin (5-mC).

For å belyse biologien av DNA-metylering i kondrocyt dedifferentiering, er det første trinnet å evaluere DNA-metyleringsnivået av kondrocytter, som hittil har vist seg å være utfordrende. Bisulfitt genomisk sekvensering er den mest brukte teknikken for å analysere DNA-metylering ^{7 , 8} . I denne analysen forårsaker bisulfitt-omdannelse DNA-nedbrytning, og således må det tilveiebringes en vesentlig mengde prøve for analysen. Dessuten har høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) blitt brukt til å kvantifisere globale DNA-metyleringsnivåer ^{9 , 10} . HPLC-analyse krever imidlertid genomisk DNA-fordøyelse. Videre kreves avanserte og dyre eksperimentelle instrumenter. Derfor, i tillegg til den høye prisen, er disse eksperimentelle prosedyrene tidsforstyrrelseruming. Anti-5-mC antistoffer har nå blitt kommersielt tilgjengelige, noe som har skapt muligheten for immunblotting av 5-mC-holdig genomisk DNA fra komplekse genomer.

I denne rapporten ekstrahente vi genomisk DNA fra kondrocyter dyrket i en serie av monolagskulturer. Vi brukte en dot blot-analyse for å evaluere 5-mC innholdet i humane kondrocyter med forskjellige antall passasjer. Vi fant at 5-mC innhold ble økt i svært dedifferentierte kondrocytter sammenlignet med kondrocytter med lavverdig dedifferentiering. I tillegg identifiserte vi et forhold mellom dedifferentiation status og 5-mC nivåer. Endelig rapporterte vi at endringene i 5-mC innhold var assosiert med kondrocyt fenotypen. Derfor er 5-mC dot blot-analysen en pålitelig, enkel og rask metode for å oppdage DNA-metyleringsnivået i kondrocytter.

Protocol

Denne studien ble godkjent av Human Ethics Committee i Shenzhen Second People's Hospital.

1. Human Articular Cartilage Tissue Collection og Chondrocyte Culture

1. Fremstilling av materialer
   1. Forbered Dulbeccos modifiserte eagle medium (DMEM) medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin streptomycin. Klargjør 1 mg / ml kollagenase II, 0,25% trypsin-EDTA, fosfatbuffert saltvann (PBS) og en cellefilter (40 μm nylon).
2. Humant leddbruskvevssamling
   1. Isoler leddbrusk fra kneleddene fra giverpatienter etter traumer. Få informert samtykke fra alle deltakere.
   2. Dice brusk i 1-2 mm ³ stykker ved hjelp av en steril skalpell og fordøye kondrocyter fra hakket brusk med 1 mg / ml kollagenase II i DMEM ved 37 ° C i 12-16 timer.
   3. Filtrer den resulterende cellenL suspensjon gjennom en cellefilter (40 μm) og vask to ganger med PBS.
   4. Telle celler med et hemocytometer og frø med en tetthet på 20.000-30.000 celler / cm2 i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin streptomycin.
   5. Kultur i en inkubator ved 37 ° C.
3. Monolayer kondrocyt ekspansjon
   1. Høst-subkonfluente celler ved bruk av 0,25% trypsin-EDTA og omplater ved en tetthet på 6 600 celler / cm ² . Bytt mediet to ganger i uken.
   2. Kultur kondrocytter i monolag for opptil seks passasjer og vurder ved passasjer 1, 2, 3, 4 og 5.

2. Genomisk DNA (gDNA) Ekstraksjon

1. Samle celler og resuspender i 500 μl lysisbuffer (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μg / ml RNase A) per 10 millioner celler. Resuspender celler ved pipettering og rask inversjon, og inkuber deretter i 1 time ved 37 ° C.
2. ENDd proteinase K ved en konsentrasjon på 160 ug / ml cellysalat og inverter blandingen kraftig. Inkuber 6 timer ved 55 ° C.
3. Tilsett et volum Tris pH 7,9 mettet fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) til prøven. Vortex eller rist prøven med hånden grundig i ca 20 s.
4. Sentrifuger prøven ved romtemperatur i 5 minutter ved 13.000 x g. Fjern den øvre vandige fasen og overfør laget til et nytt rør.
5. Ekstraher med et lik volum kloroform for å fjerne fenol og overfør den øverste vandige fasen til et friskt rør.
6. Precipitere DNA ved å tilsette 0,1 prøvevolum av 3 M natriumacetat pH 8,0 og 2 volumer 100% etanol.
7. Oppbevar røret ved -20 ° C over natten for å utfelle gDNA.
8. Sentrifuger prøven ved 4 ° C i 10 minutter ved 16.000 xg til pellet gDNA.
9. Vask prøven tre ganger med 70% etanol og sentrifuger ved 4 ° C i 2 minutter ved 13.000 x g.
10. Fjern supernatanenT forsiktig og lufttørk deretter. Resuspender DNA i 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.

3. DNA Methylering Profiling

1. Bruk et DNA-metyleringskit til å utføre bisulfittomdannelsesreaksjonen ved å bruke totalt 500 ng av det genomiske DNA, i henhold til produsentens protokoll. Avløp i 10 μl elueringsbuffer (50 ng / μl).
2. Utfør DNA-metyleringsprofilering ved hjelp av et kommersielt sett i henhold til produsentens protokoll.

4. Dot Blot Analysis

1. Denaturer det isolerte DNA (1 mg pr. Prøve) i 0,1 M NaOH i 10 minutter ved 95 ° C. Nøytraliser DNA med 1 M NH ₄ OAc på is, og fortynn deretter to ganger. Spot 2 μL av det serielle fortynnede genomiske DNA på en N ⁺ -membran.
2. Blot membranen ved 80 ° C i 30 minutter.
3. Blokker ikke-spesifikke antistoffbindingssteder ved å suge N ⁺ -membranen i 5% BSA i TBS-T i 1 time. Bruk en 10 cm petriskål som en reaksjonIonkammer ved romtemperatur.
4. Etter vask 5 min tre ganger i TBST, inkuber membranen med et monoklonalt anti-5-metylcytosin (5: mC) monoklonalt antistoff (1: 1000) i TBS-T ved 4 ° C over natten.
5. Vask membranen i 5 minutter tre ganger i TBS-T, og inkuber deretter med et sekundært antistoff, HRP-konjugert får-antimusimmunglobulin-G (IgG) (1: 5000) i TBS-T i 1 time ved romtemperatur.
6. Vask membranen i 5 minutter tre ganger i TBS-T.
7. Legg enzymsubstratet til membranen og inkuber i 5-10 minutter. Visualiser det sekundære antistoffsignalet ved hjelp av et kjemiluminescenssett ifølge produsentens instruksjoner.

Representative Results

Chondrocytter ble dyrket i et monolag opp til passasje 6 (P6). Kondrocytter viste progressive fenotypiske endringer med suksessive passasjer av monolagskulturen. P0-kondrocytemorfologien var rund, mens cellene ble svært klemt og flatet med suksessive passasjer opp til P6 ( Figur 1 ). Denne morfologiske forandringen er typisk for kondrocyt dedifferentieringsprosessen. I mellomtiden indikerte resultatene av varmekartet at det generelle metyleringsnivået for CpG-steder økte med langvarig subkultur. 5-mC dot-blot-analysen viste videre at høyere CpG-metyleringsnivåer fulgte kondrocytutbredelsen ( figur 2 ). Disse resultatene foreslo en sammenheng mellom generelt økte metyleringsnivåer og kondrocyt dedifferensiering.

Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: 5-mC-spesifikk dot blot-analyse av gDNA av kondrocytter. Genomisk DNA ble isolert fra kondrocyter etter varierende antall passasjer. Progressivt forhøyede 5-mC-nivåer ble observert. 200 ng, 100 ng, 50 ng og 25 ng gDNA ble lastet per prikk. ( A ) Bilde av 5-mC-spesifikk dot blot; ( B ) Dotintensitetsanalyse av ImageJ. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Chondrocyt dedifferentiation in vitro kompromitterer svært utfallet av ACI i behandlingen av brusk defekt reparasjon ^{11 , 12} . For å optimalisere ACI-utfallet er det avgjørende å unngå bruk av dedifferentierte kondrocytter ¹³ . Studier har antydet at generelt DNA-metyleringsnivå er assosiert med omfanget av kondrocyt dedifferensiering ^{4 , 6} . Det er således avgjørende å etablere en pålitelig og rask metode for å oppdage den generelle DNA-metyleringsstatusen for kondrocytene før den kliniske applikasjonen.

For å oppdage generelle DNA-metyleringsnivåer i dedifferentierte humane kondrocytter kunne vi måle 5-mC-nivået i serielt passerte chondrocytter. 5-mC er resistent mot deaminering ved bisulfittbehandling. Denne egenskapen ble utnyttet for å analysere DNA-cytosinmetyleringsmønstre ved bruk av tHan-bisulfitt-sekvenseringsmetode ¹⁴ . Bisulfitt genomisk sekvensering og metyleringsfølsom restriksjonsfordøyelse har blitt betraktet som gullstandardteknologi for påvisning av DNA-metylering ^{15 , 16} . Disse tilnærmingene kan identifisere 5-mC med enkeltbasepar resolusjon. Den største ulempen ved bisulfitt-sekvensering er imidlertid DNA-nedbrytning under bisulfitt-omdannelse. Hvis denne tilnærmingen ble brukt til å vurdere kondrocyt dedifferensiering, ville det resultere i sløsing med forplantede kondrocytter for ACI. HPLC er en annen praktisk metode for å kvantifisere globale DNA-metyleringsnivåer, men det er bare egnet for laboratorier med HPLC-utstyr. Behovet for større prøvevolumer eller moderne utstyr gjør dermed disse tilnærmingene upraktiske for rutinemessig 5-mC-nivå testing i typiske kliniske laboratorier.

Den kommersielle tilgjengeligheten av 5-mC antistoff gir muligheten til å detektereGenerelle DNA-metyleringsnivåer ved bruk av en dot blot-analyse. Sammenlignet med andre blotting teknikker, er 5-mC dot blot en enklere prosedyre, som ikke krever verken store mengder gDNA eller elektroforese. I tillegg er instrumentene tilgjengelige i moderat utstyrt laboratorier. Derfor bør 5-mC dot blot-metoden brukes som en alternativ tilnærming til DNA-metyleringsanalyse.

I denne rapporten identifiserte vi en sammenheng mellom høyere 5-mC nivåer og kondrocyt dedifferentiering; 5-mC-nivåene økte med økende subkulturpassasje. Våre funn tyder på at 5-mC kan være nært involvert i dedifferentiering forårsaket av monolayer kondrocyt ekspansjonsforhold. Viktigst, vi fant høyere 5-mC nivåer var assosiert med tap av kondrocyt fenotype, som forhindrer bred anvendelse av ACI for å reparere bruskdefekter. Derfor viser studienesultatene at 5-mC dot blotting kan være en pålitelig måte å måle omfanget avChondrocyt dedifferensiering, spesielt når større antall prøver og mindre mengder gDNA skal analyseres.

For å kunne anvende dot blot-metoder til DNA-metyleringsanalyse, er nøkkelproblemet som må vurderes, kvaliteten på DNA-prøven. Derfor er det kritiske trinnet i 5-mC-deteksjon via dot blot det genomiske gDNA-ekstraksjonstrinnet. Vi foreslår at forskere bruker et kommersielt tilgjengelig gDNA-ekstraksjonssett for å maksimere gDNA-konsentrasjon og renhet. I tillegg bør DNA-prøven lastes på en nylonmembran. Et annet viktig problem er å sikre at DNA-prøven har blitt immobilisert og absorbert fullt av nylonmembranen.

Teknikken vi beskriver her gir oss muligheten til å utføre flere analyser til laveste pris. En ytterligere fordel med denne tilnærmingen er dens avhengighet av enkelt og rimelig utstyr for å utføre analysen og tolke resultatene. Det kan også brukes til å sammenligne slektningerForskjeller i globale metyleringsnivåer mellom 2 eller flere prøver. Imidlertid kan denne analysen ikke brukes for presis kvantifisering av DNA-metyleringsnivåer eller for å bestemme CpG-metyleringsstatusen for en spesifikk DNA-sekvens. I tillegg har denne metoden begrenset følsomhet, da metyleringsstatusen ikke kan nøyaktig detekteres i gDNA-prøver under 50 ng. Selv om denne metoden gir en kvalitativ analyse av global DNA-metylering, kan det føre til falske positive resultater hvis det utføres feil.

Sammendrag 5-mC dot blot er en pålitelig, enkel og rask metode for å detektere det generelle DNA-metyleringsnivået for å evaluere kondrocytfenotypen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Gibco Inc.	11965–092	Warm in 37 °C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
FBS	Gibco Inc.	10099-141
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056
1% Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122
Chloroform	Mallinckrodt	4440
Isoamyl Alcohol	Sigma	I-3643
Phenol	Gibco BRL	15513-039
Proteinase K	Gibco BRL	24568-2
TAE buffer	Bio Whittaker	16-011V
Distilled Water	Gibco BRL	15230-170
1 M Tris-HCl	Biosharp Inc.	BL514A
Tween20	Biotopped Inc.	C58H114O26
BSA	Proliant Inc.	68700
Collagenase, Type II	Sigma-Aldrich	C6885

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001
Falcon 100 mm dish	Corning	353003
Centrifuge Tubes	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R
ThermoMixer	MIULAB	MTH-100
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111
Chemi-imaging Analyse System	UVITEC Cambridge	ALLIANCE