A 5-ماك دوت بلوت الفحص تحديد مستوى الحمض النووي ميثيلاتيون من تشوندروسيت التفرق<em&gt; في المختبر</em

Zhaofeng Jia; Yujie Liang; Bin Ma; Xiao Xu; Jianyi Xiong; Li Duan; Daping Wang

doi:10.3791/55565

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

A 5-ماك دوت بلوت الفحص تحديد مستوى الحمض النووي ميثيلاتيون من تشوندروسيت التفرق

16.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55565

⸱

مايو 17, 2017

Zhaofeng Jia¹^,² , Yujie Liang³ , Bin Ma⁴^,⁵ , Xiao Xu²^,⁶ , Jianyi Xiong² , Li Duan² , Daping Wang¹^,²

¹Guangzhou Medical University, ²Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopeadic Engineering, Department of Orthopedics, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), ³Department of Chemistry, The Chinese University of Hong Kong, ⁴School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, ⁵Renji Hospital Clinical Stem Cell Research Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ⁶Shantou University Medical College

في هذه المقالة

ملخص

نقدم طريقة لقياس مثيلة الحمض النووي على أساس 5-ميثيلسيتوسين (5-مك) نقطة لطخة. لقد حددنا مستويات 5-مك خلال ديدفيرنتياتيون غضروفي. ويمكن استخدام هذه التقنية البسيطة لتحديد بسرعة النمط الظاهري غضروفي في علاج إسي.

الملخص

و ديديفرنتياتيون من غضروفية هيالين في غضروفية الليفية غالبا ما يرافق التوسع أحادي الطبقة من غضروفية في المختبر . ويعتبر مستوى مثيلة الحمض النووي العالمي من غضروفية لتكون علامة بيولوجية مناسبة لفقدان النمط الظاهري غضروفي. ومع ذلك، فإن النتائج التي تستند إلى أساليب تجريبية مختلفة يمكن أن تكون غير متناسقة. ولذلك، فمن المهم لوضع طريقة دقيقة وبسيطة وسريعة لتحديد مستويات الحمض النووي العالمية خلال ديدفيرنتياتيون غضروفي.

تعتمد تقنيات تحليل المثيلة الحالية على نطاق الجينوم إلى حد كبير على تسلسل الجينوم ثنائي الكبريت. بسبب تدهور الحمض النووي أثناء تحويل ثنائي الكبريت، هذه الطرق تتطلب عادة حجم عينة كبيرة. وتشمل الأساليب الأخرى المستخدمة لتحديد مستويات مثيلة الحمض النووي العالمية عالية الأداء اللوني السائل (هبلك). ومع ذلك، يتطلب هبلك هضم كامل من الحمض النووي الجيني. بالإضافة إلى ذلك، فإن ارتفاع تكلفة باهظة من هبلك فيسترومنتس حدود تطبيق هبلك على نطاق أوسع.

في هذه الدراسة، تم استخراج الحمض النووي الجيني (غنا) من تشوندروسيتس الإنسان مثقف مع عدد متفاوت من الممرات. تم الكشف عن مستوى مثيلة غنا باستخدام مقايسة محددة نقطة لطخة مقايسة. في هذا النهج نقطة وصمة عار، ورصدت خليط غنا تحتوي على الحمض النووي ميثليته ليتم الكشف عنها مباشرة على غشاء N ⁺ كنقطة داخل نمط قالب دائري رسمها سابقا. وبالمقارنة مع غيرها من نهج النشاف القائم على الرحل الكهربائي وغيرها من إجراءات النشاف المعقدة، وطريقة نقطة وصمة عار يوفر وقتا كبيرا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن البقع نقطة الكشف عن مستوى مثيلة الحمض النووي الشامل باستخدام المتاحة تجاريا 5-مك الأجسام المضادة. وجدنا أن مستوى مثيلة الحمض النووي تختلف بين الثقافات الفرعية أحادي الطبقة، وبالتالي يمكن أن تلعب دورا رئيسيا في ديفيدفيرنتياتيون غضروفي. و 5-مك نقطة لطخة هو وسيلة موثوقة وبسيطة وسريعة للكشف عن مستوى مثيلة الحمض النووي العام ل إيفالواتالنمط الظاهري غضروفي.

المقدمة

زرع خلية غضروفي الذاتي (إسي) هو جديد نسبيا، للدولة من بين الفن الإجراء لعلاج عيوب الغضروف المفصلي ¹ ^، ² . واحدة من الخطوات الحاسمة في إسي هو التضخيم من غضروفية عن طريق ثقافة أحادي الطبقة في المختبر . خلال التضخيم، غضروفية هيالين تفقد بسهولة النمط الظاهري وتصبح ديديفيرنتياتد، وهو أمر غير مرغوب فيه لعلاج إسي ³ ^، ⁴ . لتحسين نتيجة العلاج إسي، ينبغي تحديد مدى ديفيدفيرنتياتيون غضروفية قبل إعادة الزرع. لا بد من إنشاء وسيلة اقتصادية وسريعة لتحديد حالة غضروفية. في الآونة الأخيرة، وقد اجتذب الارتباط بين مثيلة الح....