Summary
Мы представляем метод количественного метилирования ДНК на основе 5-methylcytosine (5-mC) дот-блоттинга. Мы определили уровни 5 мкС во время дедифференцировки хондроцитов. Этот простой метод может быть использован для быстрого определения фенотипа хондроцита при лечении ACI.
Abstract
Дедифференцировка гиалиновых хондроцитов в фибробластные хондроциты часто сопровождает монослое экспансии хондроцитов in vitro . Глобальный уровень метилирования ДНК хондроцитов считается подходящим биомаркером для потери фенотипа хондроцита. Однако результаты, основанные на различных экспериментальных методах, могут быть непоследовательными. Поэтому важно установить точный, простой и быстрый метод количественного определения уровней глобального метилирования ДНК во время дедифференцировки хондроцитов.
Современные методы анализа метилирования по всему геному в значительной степени основаны на геномном секвенировании бисульфита. Из-за деградации ДНК во время конверсии бисульфита эти методы обычно требуют большого объема образца. Другие методы, используемые для количественной оценки уровней глобального метилирования ДНК, включают высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Однако ВЭЖХ требует полного переваривания геномной ДНК. Кроме того, непомерно высокая стоимость ВЭЖХ вИнструменты ограничивают широкое применение ВЭЖХ.
В этом исследовании геномную ДНК (гДНК) экстрагировали из человеческих хондроцитов, культивируемых с различным количеством пассажей. Уровень метилирования gDNA определяли с использованием специфического для метилирования теста дот-блоттинга. В этом методе дот-блоттинга смесь gDNA, содержащая метилированную ДНК, которая должна быть обнаружена, была обнаружена непосредственно на мембране N + в виде точки внутри ранее нарисованного кругового шаблона шаблона. По сравнению с другими методами блоттинга на основе гель-электрофореза и другими сложными методиками блоттинга метод дот-блоттинга экономит значительное время. Кроме того, дот-блоты могут обнаруживать общий уровень метилирования ДНК с использованием коммерчески доступного антитела с 5 мК. Мы обнаружили, что уровень метилирования ДНК различается между однослойными субкультурами и поэтому может играть ключевую роль в дедифференцировании хондроцитов. 5-МТ дот-блот является надежным, простым и быстрым методом для определения общего уровня метилирования ДНК для оценкиФенотип хондроцитов.
Introduction
Аутологичная имплантация хондроцитов (ACI) - относительно новая, современная методика лечения дефектов суставного хряща 1 , 2 . Одним из важнейших этапов ACI является амплификация хондроцитов посредством монослойной культуры in vitro . Во время амплификации гиалиновые хондроциты легко теряют свой фенотип и становятся дедифференцированными, что нежелательно для лечения ACI 3 , 4 . Чтобы оптимизировать результаты лечения ACI, степень дедифференцировки хондроцитов должна быть определена перед реплантацией. Крайне важно установить экономичный и быстрый способ определения статуса хондроцитов. Недавно ассоциация между метилированием ДНК и дедифференцировкой хондроцитов привлекла большое внимание 4 , 5 , 6 . Метилирование ДНК - это процесс by whМетильные группы добавляют к ДНК, приводя к превращению остатков цитозина в 5-метилцитозин (5-mC).
Чтобы выяснить биологию метилирования ДНК в дедифференцировке хондроцитов, первым шагом является оценка уровня метилирования ДНК хондроцитов, который до сих пор оказался сложным. Бисульфитное геномное секвенирование является наиболее широко используемым методом анализа метилирования ДНК 7 , 8 . В этом анализе конверсия бисульфита вызывает деградацию ДНК, и поэтому для анализа необходимо предоставить значительное количество образца. Кроме того, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется для количественной оценки уровней глобального метилирования ДНК 9 , 10 . Однако анализ ВЭЖХ требует переваривания геномной ДНК. Кроме того, необходимы передовые и дорогостоящие экспериментальные приборы. Поэтому, помимо высокой стоимости, эти экспериментальные процедуры являются временными минусамиели. Анти-5-mC-антитела стали коммерчески доступными, что создало возможность иммунного блоттинга геномной ДНК, содержащей 5 мкл, из сложных геномов.
В этом сообщении мы извлекли геномную ДНК из хондроцитов, выращенных в серии монослойных культур. Мы использовали дот-блот-анализ для оценки содержания 5 мК в человеческих хондроцитах с различным количеством проходов. Мы обнаружили, что содержание 5-мС увеличилось в сильнодедифференцированных хондроцитах по сравнению с хондроцитами с низкодифференцированной дедифференцировкой. Кроме того, мы установили связь между статусом дедифференцировки и уровнем 5 мкС. Наконец, мы сообщили, что изменения в содержании 5 мкС были связаны с фенотипом хондроцитов. Таким образом, 5-МЦ дот-блот-анализ является надежным, простым и быстрым методом для определения уровня метилирования ДНК в хондроцитах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено Комитетом по этике человека Шэньчжэньской народной больницы.
1. Сбор ткани суставного хряща человека и культура хондроцитов
- Подготовка материалов
- Подготовьте среду модифицированного орлиного носителя Дульбекко (DMEM), дополненную 10% эмбриональной бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицином. Готовят 1 мг / мл коллагеназы II, 0,25% трипсина-ЭДТА, фосфатно-солевой буфер (PBS) и клеточный фильтр (нейлон 40 мкм).
- Сбор суставной хрящевой ткани человека
- Изолируйте суставной хрящ от коленных суставов донорских пациентов после травмы. Получите информированное согласие от всех участников.
- Наденьте хрящ на 1-2 мм 3 части с помощью стерильного скальпеля и переваривайте хондроциты из фарша хряща с 1 мг / мл коллагеназы II в DMEM при 37 ° C в течение 12-16 часов.
- Отфильтруйте полученный объектЛ суспензии через сито-ячейку (40 мкм) и дважды промывают PBS.
- Считайте клетки с гемоцитометром и семенами с плотностью 20 000-30 000 клеток / см 2 в DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином.
- Культура в инкубаторе при 37 ° C.
- Однослойное расширение хондроцитов
- Урожай субконфлюэнтных клеток с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА и повторно пластины с плотностью 6 600 клеток / см 2 . Меняйте среду два раза в неделю.
- Культура хондроцитов в монослоях на срок до шести пассажей и оценить на проходы 1, 2, 3, 4 и 5.
2. Извлечение геномной ДНК (gDNA)
- Собирают клетки и ресуспендируют в 500 мкл буфера для лизиса (15 мМ Tris pH 8,0, 10 мМ EDTA с pH 8,0, 0,5% SDS, 200 мкг / мл РНКазы А) на 10 миллионов клеток. Ресуспендируют клетки пипетированием и быстрой инверсией, а затем инкубируют в течение 1 часа при 37 ° C.
- Dd-протеиназой K в концентрации 160 мкг / мл клеточного лизата и энергично переворачивают смесь. Инкубируйте 6 часов при 55 ° C.
- Добавьте к образцу один объем трис-насыщенного фенола Tris с pH 7,9: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1). Встряхните или встряхните образец вручную в течение приблизительно 20 с.
- Центрифуга образца при комнатной температуре в течение 5 мин при 13000 g. Удалите верхнюю водную фазу и перенесите слой на новую пробирку.
- Экстрагируют равным объемом хлороформа для удаления фенола и переносят верхнюю водную фазу в свежую пробирку.
- Осаждают ДНК добавлением 0,1 объема образца 3 М ацетата натрия pH 8,0 и 2 объемов 100% этанола.
- Храните пробирку при -20 ° С на ночь для осаждения гДНК.
- Центрифуга образца при 4 ° С в течение 10 мин при 16000 мкг на гранулу кДНК.
- Промывают образец три раза с 70% этанола и центрифугируют при 4 ° С в течение 2 мин при 13000 х g.
- Удалить супернатанT тщательно, а затем на воздухе. Ресуспендируют ДНК в 10 мМ Tris pH 8,0, 0,1 мМ EDTA.
3. Профилирование метилирования ДНК
- Используйте набор для метилирования ДНК для проведения реакции конверсии бисульфита с использованием в общей сложности 500 нг геномной ДНК в соответствии с протоколом производителя. Элюируйте в 10 мкл буфера для элюции (50 нг / мкл).
- Профилирование метилирования ДНК с использованием коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя.
4. Точечный блот-анализ
- Выделяют изолированную ДНК (1 мг на образец) в 0,1 М NaOH в течение 10 мин при 95 ° С. Нейтрализовать ДНК с 1 М NH 4 OAc на льду, а затем развести в два раза. Пятно 2 мкл серийной разбавленной геномной ДНК на мембране N + .
- Промокните мембрану при 80 ° С в течение 30 мин.
- Блокировать сайты неспецифического связывания антител путем впитывания мембраны N + в 5% BSA в TBS-T в течение 1 часа. Используйте 10 см чашку Петри в качестве реакцииИонной камере при комнатной температуре.
- После трехминутной промывки в TBST три раза инкубируйте мембрану с моноклональным антителом против 5-метилцитозина (5-mC) мыши (1: 1000) в TBS-T при 4 ° C в течение ночи.
- Промывают мембрану в течение 5 мин три раза в TBS-T и затем инкубируют с вторичным антителом, HRP-конъюгированным овечьим иммуноглобулином-G (IgG) овец мыши (1: 5000) в TBS-T в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Промывают мембрану в течение 5 мин три раза в TBS-T.
- Добавляют ферментный субстрат к мембране и инкубируют в течение 5-10 мин. Визуализируйте вторичный сигнал антитела, используя набор хемилюминесценции в соответствии с инструкциями производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хондроциты культивировали в монослое до прохода 6 (Р6). Хондроциты показали прогрессивные фенотипические изменения с последовательными переходами монослойной культуры. Морфология хондроцитов P0 была круглой, тогда как клетки сильно сжались и сплющивались с последовательными переходами до Р6 ( рис. 1 ). Это морфологическое изменение характерно для процесса дедифференцировки хондроцитов. Между тем, результаты тепловой карты показали, что общий уровень метилирования CpG-сайтов увеличивается с длительной субкультурой. Анализ 5-mC дот-блоттинга также показал, что более высокие уровни метилирования CpG сопровождают распространение хондроцитов ( рисунок 2 ). Эти результаты указывают на связь между обычно повышенными уровнями метилирования и дедифференцировкой хондроцитов.
Рисунок 2: 5-mC-специфичный дот-блот анализ gDNA хондроцитов. Геномную ДНК выделяли из хондроцитов после различного количества пассажей. Наблюдались прогрессивно повышенные уровни 5 мкл. 200 нг, 100 нг, 50 нг и 25 нг гДНК загружали на точку. ( A ) Изображение 5-mC-специфического дот-блота; ( B ) Анализ интенсивности точек по ImageJ. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Дедифференцировка хондроцитов in vitro сильно компрометирует результаты ACI при лечении дефектов хрящевых дефектов 11 , 12 . Для оптимизации результатов ACI крайне важно избегать использования дедифференцированных хондроцитов 13 . Исследования показали, что общий уровень метилирования ДНК связан с степенью дедифференцировки хондроцитов 4 , 6 . Таким образом, крайне важно установить надежный и быстрый метод для определения общего статуса метилирования ДНК хондроцитов перед его клиническим применением.
Для определения общих уровней метилирования ДНК в дедифференцированных человеческих хондроцитах мы могли бы измерить уровень 5 мкС в последовательно расположенных пассированных хондроцитах. 5-mC устойчив к дезаминированию обработкой бисульфитом. Это свойство было использовано для анализа образцов метилирования ДНК цитозина с использованием tПодход, основанный на использовании бисульфитного упорядочения 14 . Бисульфитное геномное секвенирование и чувствительное к метилированию рестрикционное расщепление считаются золотыми стандартными технологиями для обнаружения метилирования ДНК 15 , 16 . Эти подходы могут идентифицировать 5-mC с разрешением одной базовой пары. Однако самым большим недостатком бисульфитного секвенирования является деградация ДНК во время конверсии бисульфита. Если бы этот подход использовался для оценки дедифференцировки хондроцитов, это привело бы к расточительству размножаемых хондроцитов для ACI. ВЭЖХ - еще один практический метод для количественной оценки уровней глобального метилирования ДНК, но он подходит только для лабораторий с оборудованием для ВЭЖХ. Таким образом, необходимость больших объемов выборки или современного оборудования делает эти подходы нецелесообразными для рутинного 5-мС уровня тестирования в типичных клинических лабораториях.
Коммерческая доступность 5-mC-антитела обеспечивает возможность обнаруженияОбщие уровни метилирования ДНК с использованием дот-блот-анализа. По сравнению с другими методами блоттинга, 5-МЦ дот-блот является более простой процедурой, которая не требует ни большого количества гДНК, ни электрофореза. Кроме того, инструменты имеются в лабораториях с умеренной стоимостью. Таким образом, метод 5-mC дот-блоттинга должен применяться в качестве альтернативного метода анализа метилирования ДНК.
В этом сообщении мы идентифицировали связь между более высокими уровнями 5 мкМ и дедифференцировкой хондроцитов; Уровень 5-mC увеличивался с увеличением прохождения субкультуры. Наши результаты свидетельствуют о том, что 5-мК может быть непосредственно вовлечено в дедифференцировку, вызванную условиями монослоя хондроцита. Важно отметить, что мы обнаружили, что более высокие уровни 5 мкл были связаны с потерей фенотипа хондроцита, что предотвращает широкое применение ACI для восстановления дефектов хряща. Таким образом, результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что 5-МТ-дот-блоттинг может быть надежным способом измерения степениХондроцитов, в частности, когда необходимо анализировать большее количество образцов и меньшие количества gDNA.
Чтобы применить методы дот-блоттинга к анализу метилирования ДНК, ключевым вопросом, который необходимо учитывать, является качество образца ДНК. Таким образом, критический шаг в обнаружении 5 мкл путем дот-блоттинга - это этап выделения геномной гДНК. Мы предлагаем исследователям использовать коммерчески доступный набор для экстракции гДНК, чтобы максимизировать концентрацию и чистоту гДНК. Кроме того, образец ДНК должен быть загружен на нейлоновую мембрану. Другая важная проблема заключается в том, чтобы гарантировать, что образец ДНК был иммобилизован и полностью поглощен нейлоновой мембраной.
Методика, которую мы здесь описываем, дает нам возможность проводить несколько анализов с наименьшими затратами. Дополнительным преимуществом такого подхода является его зависимость от простого и доступного оборудования для проведения анализа и интерпретации результатов. Кроме того, его можно использовать для сравнения относительныхРазличия в уровнях глобального метилирования между 2 и более образцами. Однако этот анализ нельзя использовать для точной количественной оценки уровней метилирования ДНК или для определения статуса метилирования CpG конкретной последовательности ДНК. Кроме того, этот метод имеет ограниченную чувствительность, так как уровень метилирования не может быть точно обнаружен в образцах гДНК ниже 50 нг. Несмотря на то, что этот метод обеспечивает качественный анализ глобального метилирования ДНК, он может давать ложноположительные результаты, если они выполняются неправильно.
Таким образом, 5-МТ дот-блот является надежным, простым и быстрым методом для определения общего уровня метилирования ДНК для оценки фенотипа хондроцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана следующими грантами: Фонд естественных наук Китая (№ 81572198, № 81260161, № 81000460); Фонд естественных наук провинции Гуандун, Китай (№ 2015A030313772); Финансируемый Китаем научный фонд (№ 2013М530385); Фонд медицинских исследований провинции Гуандун, Китай (№ A2016314); Шэньчжэньский научно-технический проект (№ JCYJ20160301111338144, № JSGG20151030140325149; № JSGG20140519105550503; №GJHZ20130412153906739; № JCYJ20140414170821160; №JCYJ20140414170821200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
