Summary
Apresentamos um método para quantificar a metilação do DNA com base na mancha ponto 5-metilcitosina (5-mC). Determinamos os níveis de 5-mC durante a desdiferenciação de condrócitos. Esta técnica simples poderia ser usada para determinar rapidamente o fenótipo condrócito em tratamento com ACI.
Abstract
A desdiferenciação de condrócitos hialinos em condrócitos fibroblásticos acompanha frequentemente a expansão monocamada de condrócitos in vitro . O nível global de metilação do ADN dos condrócitos é considerado um biomarcador adequado para a perda do fenótipo dos condrócitos. No entanto, resultados baseados em diferentes métodos experimentais podem ser inconsistentes. Portanto, é importante estabelecer um método preciso, simples e rápido para quantificar os níveis globais de metilação do DNA durante a desdiferenciação dos condrócitos.
As técnicas atuais de análise de metilação do genoma abrangem amplamente o seqüenciamento genômico do bisulfito. Devido à degradação do ADN durante a conversão de bissulfito, estes métodos requerem tipicamente um grande volume de amostra. Outros métodos utilizados para quantificar os níveis globais de metilação do DNA incluem a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). No entanto, a HPLC requer a digestão completa do ADN genómico. Além disso, o custo proibitivamente alto de HPLC emLimita a aplicação mais ampla da HPLC.
Neste estudo, o ADN genómico (gDNA) foi extraído de condrócitos humanos cultivados com número variável de passagens. O nível de metilação de gDNA foi detectado utilizando um ensaio dot blot de metilação específica. Nesta abordagem dot blot, uma mistura de gDNA contendo o ADN metilado a ser detectado foi manchada directamente sobre uma membrana N + como um ponto dentro de um padrão de molde circular previamente desenhado. Em comparação com outras abordagens de blotting baseadas em electroforese em gel e outros processos de transferência de blot, o método dot blot economiza tempo significativo. Além disso, as transferências de pontos podem detectar o nível geral de metilação do ADN utilizando um anticorpo 5-mC comercialmente disponível. Descobrimos que o nível de metilação do DNA diferiu entre as subcultações monocamadas e, portanto, poderia desempenhar um papel chave na desdiferenciação dos condrócitos. A mancha ponto 5-mC é um método confiável, simples e rápido para detectar o nível geral de metilação do DNA para avaliarE fenótipo condrócito.
Introduction
O implante de condrócitos autólogos (IAC) é um procedimento relativamente novo e de última geração para o tratamento de defeitos da cartilagem articular 1 , 2 . Um dos passos cruciais no ACI é a amplificação de condrócitos através da cultura monocamada in vitro . Durante a amplificação, os condrócitos hialinos perdem facilmente o seu fenótipo e se tornam desdiferenciados, o que é indesejável para o tratamento com ACI 3 , 4 . Para optimizar o resultado do tratamento com ACI, a extensão da desdiferenciação dos condrócitos deve ser determinada antes da replantação. É imperativo estabelecer uma maneira econômica e rápida de determinar o status dos condrócitos. Recentemente, a associação entre metilação do DNA e desdiferenciação de condrócitos atraiu muita atenção 4 , 5 , 6 . A metilação do DNA é um processoGrupos metilo são adicionados ao ADN, resultando na conversão de resíduos de citosina em 5-metilcitosina (5-mC).
Para elucidar a biologia da metilação do DNA na desdiferenciação dos condrócitos, o primeiro passo é avaliar o nível de metilação do DNA dos condrócitos, que até agora tem se mostrado desafiador. A sequenciação genômica do bisulfito é a técnica mais utilizada para analisar a metilação do DNA 7 , 8 . Neste ensaio, a conversão de bisulfito provoca a degradação do ADN, e assim uma quantidade substancial de amostra deve ser proporcionada para o ensaio. Além disso, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi utilizada para quantificar os níveis globais de metilação do DNA 9,10. No entanto, a análise por HPLC requer digestão com ADN genómico. Além disso, são necessários instrumentos experimentais avançados e caros. Portanto, além do alto custo, esses procedimentos experimentais são contra-tempoUming Os anticorpos anti-5-mC tornaram-se agora comercialmente disponíveis, o que criou a possibilidade de imunotransferência de ADN genómico contendo 5 mC a partir de genomas complexos.
Neste relatório, extraímos DNA genômico de condrócitos cultivados em uma série de culturas monocamadas. Utilizou-se um ensaio dot blot para avaliar o teor de 5-mC em condrócitos humanos com diferentes números de passagens. Verificou-se que o teor de 5-mC foi aumentado em condrócitos altamente desdiferenciados em comparação com condrócitos com desdiferenciação de baixo grau. Além disso, identificamos uma relação entre o status de desdiferenciação e os níveis de 5-mC. Finalmente, relatamos que as alterações no conteúdo de 5 mC foram associadas ao fenótipo condrócito. Deste modo, o ensaio de dot blot de 5 mC é um método fiável, simples e rápido para detectar o nível de metilação do ADN em condrócitos.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana do Segundo Hospital Popular de Shenzhen.
1. Coleção de Tecidos de Cartilagem Articular Humana e Cultura de Condrócitos
- Preparação de materiais
- Preparar meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-estreptomicina. Preparar 1 mg / mL de colagenase II, 0,25% de tripsina-EDTA, solução salina tamponada com fosfato (PBS) e um filtro de células (nylon 40 μm).
- Coleção de tecido da cartilagem articular humana
- Isolar a cartilagem articular das articulações do joelho dos pacientes doadores após o trauma. Obter o consentimento informado de todos os participantes.
- Corte a cartilagem em 1-2 mm 3 pedaços usando um bisturi estéril e digerir condrócitos da cartilagem picada com 1 mg / ml de colagenase II em DMEM a 37 ° C durante 12-16 h.
- Filtrar o resultado celL de suspensão através de um filtro de células (40 μm) e lavagem duas vezes com PBS.
- Contar as células com um hemocitómetro e semente a uma densidade de 20.000-30.000 células / cm 2 em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
- Cultura em incubadora a 37 ° C.
- Expansão de condrócitos monocamadas
- Colheita de células sub-confluentes usando 0,25% de tripsina-EDTA e re-placa a uma densidade de 6,600 células / cm 2 . Alterar o meio duas vezes por semana.
- Cultura de condrócitos em monocamadas para até seis passagens e avaliar nas passagens 1, 2, 3, 4 e 5.
2. Extração de DNA genômico (gDNA)
- Recolher as células e ressuspender em 500 μL de tampão de lise (Tris 15 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, pH 8,0, SDS a 0,5%, RNase A 200 μg / mL) por 10 milhões de células. Ressuspender as células por pipetagem e rápida inversão e, em seguida, incubar durante 1 h a 37 ° C.
- UMADd proteinase K a uma concentração de 160 μg / mL de lisado celular e inverter a mistura vigorosamente. Incubar 6 h a 55 ° C.
- Adicionar um volume de Tris pH 7,9 saturado fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1) para a amostra. Vortex ou agitar a amostra cuidadosamente à mão durante aproximadamente 20 s.
- Centrifugar a amostra à temperatura ambiente durante 5 min a 13 000 x g. Remover a fase aquosa superior e transferir a camada para um tubo fresco.
- Extrair com um volume igual de clorofórmio para remover fenol e transferir a fase aquosa superior para um tubo fresco.
- Precipitar o ADN adicionando 0,1 volume de amostra de acetato de sódio 3 M pH 8,0 e 2 volumes de etanol a 100%.
- Armazenar o tubo a -20 ° C durante a noite para precipitar o gDNA.
- Centrifugar a amostra a 4 ° C durante 10 min a 16000 xg para sedimentar gDNA.
- Lavar a amostra três vezes com etanol a 70% e centrifugar a 4 ° C durante 2 min a 13 000 x g.
- Remover o supernatanT cuidadosamente e depois secar ao ar. Ressuspender o ADN em Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM.
3. Perfis de metilação de ADN
- Utilizar um kit de metilação de ADN para realizar a reacção de conversão de bissulfito utilizando um total de 500 ng do ADN genómico, de acordo com o protocolo do fabricante. Eluir em 10 μL de tampão de eluição (50 ng / μL).
- Realizar o perfilamento de metilação do DNA usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Dot Blot Analysis
- Desnaturação do ADN isolado (1 mg por amostra) em NaOH 0,1 M durante 10 min a 95 ° C. Neutralize o DNA com NH4OAc 1 M em gelo e depois dilua duas vezes. Spot 2 μL do DNA genômico diluído em série em uma membrana N + .
- Misturar a membrana a 80 ° C durante 30 min.
- Bloquear locais de ligação a anticorpos não específicos por imersão da membrana N + em BSA a 5% em TBS-T durante 1 h. Use uma placa de Petri de 10 cm comoCâmara de iões à temperatura ambiente.
- Após lavagem de 5 min três vezes em TBST, incubar a membrana com um anticorpo monoclonal de rato anti-5-metilcitosina (5: mC) (1: 1000) em TBS-T a 4 ° C de um dia para o outro.
- Lavar a membrana durante 5 min três vezes em TBS-T, e depois incubar com um anticorpo secundário, imunoglobulina-G (IgG) de ovelha conjugada com HRP (1: 5000) em TBS-T durante 1 h à temperatura ambiente.
- Lavar a membrana durante 5 min três vezes em TBS-T.
- Adicionar o substrato enzimático à membrana e incubar durante 5-10 min. Visualize o sinal de anticorpo secundário utilizando um kit de quimioluminescência de acordo com as instruções do fabricante.
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Representative Results
Os condrócitos foram cultivados numa monocamada até à passagem 6 (P6). Os condrócitos mostraram alterações fenotípicas progressivas com passagens sucessivas da cultura monocamada. A morfologia dos condrócitos P0 foi redonda, enquanto que as células tornaram-se altamente comprimidas e achatadas com passagens sucessivas até P6 ( Figura 1 ). Esta alteração morfológica é típica do processo de desdiferenciação dos condrócitos. Entretanto, os resultados do mapa de calor indicaram que o nível de metilação geral dos locais CpG aumentou com a subcultura prolongada. A análise de dot-blot a 5 mC demonstrou ainda que níveis mais elevados de metilação de CpG acompanharam a propagação dos condrócitos ( Figura 2 ). Estes resultados sugerem uma associação entre níveis de metilação geralmente aumentados e desdiferenciação de condrócitos.
Figura 2: ensaio de mancha ponto 5-mC específico de gDNA de condrócitos. O ADN genómico foi isolado a partir de condrócitos após número variável de passagens. Foram observados níveis progressivamente elevados de 5-mC. 200 ng, 100 ng, 50 ng e 25 ng de gDNA foram carregados por ponto. ( A ) Imagem de dot-blot 5-mC-specific; ( B ) Análise de intensidade de pontos pelo ImageJ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A desdiferenciação de condrócitos in vitro compromete gravemente o desfecho da ACI no tratamento da reparação de defeitos da cartilagem 11,12. Para otimizar o resultado do ACI, é crucial evitar o uso de condrócitos desdiferenciados 13 . Estudos sugeriram que o nível geral de metilação do DNA está associado à extensão da desdiferenciação dos condrócitos 4,6. Assim, é imperativo estabelecer um método fiável e rápido para detectar o estado geral de metilação do ADN dos condrócitos antes da sua aplicação clínica.
Para detectar os níveis gerais de metilação do DNA em condrócitos humanos desdiferenciados, poderíamos medir o nível de 5 mC em condrócitos passados em série. 5-mC é resistente à desaminação por tratamento com bissulfito. Esta propriedade foi explorada para analisar padrões de metilação de citosinaAbordagem de sequenciação de bisulfito 14 . A sequenciação genômica do bisulfito e a digestão por restrição sensível à metilação têm sido consideradas tecnologias padrão-ouro para a detecção da metilação do DNA 15,16. Essas abordagens podem identificar 5 mC com resolução de pares de bases únicos. No entanto, o maior inconveniente da sequenciação de bisulfito é a degradação do ADN durante a conversão de bissulfito. Se esta abordagem fosse utilizada para avaliar a desdiferenciação dos condrócitos, resultaria no desperdício dos condrócitos propagados para a ACI. A HPLC é outro método praticável para quantificar os níveis globais de metilação do ADN, mas é apenas adequado para laboratórios com equipamento de HPLC. Assim, a necessidade de volumes de amostra maiores ou equipamento moderno torna estas abordagens impraticáveis para testes de nível de 5-mC de rotina em laboratórios clínicos típicos.
A disponibilidade comercial de anticorpos 5-mC proporciona a possibilidade de detectarNíveis gerais de metilação do ADN utilizando um ensaio dot blot. Em comparação com outras técnicas de mancha, a mancha ponto 5-mC é um procedimento mais fácil, que não requer grandes quantidades de gDNA nem eletroforese. Além disso, os instrumentos estão disponíveis em laboratórios moderadamente equipados. Portanto, o método de mancha ponto 5-mC deve ser aplicável como uma abordagem alternativa do ensaio de metilação do DNA.
Neste relatório, identificamos uma associação entre níveis mais altos de 5 mC e desdiferenciação de condrócitos; Os níveis de 5-mC aumentaram com o aumento da passagem da subcultura. Nossos achados sugerem que a 5-mC pode estar intimamente envolvida na desdiferenciação causada por condições de expansão de condrócitos monocamadas. Importante, encontramos maiores níveis de 5-mC foram associados com a perda do fenótipo condrócito, o que impede ampla aplicação de ACI para reparar defeitos de cartilagem. Por conseguinte, os resultados do nosso estudo sugerem que a transferência de pontos de 5 mC pode ser uma forma fiável deDesdiferenciação de condrócitos, em particular quando se pretende analisar um maior número de amostras e quantidades menores de ADN g.
Para aplicar os métodos dot blot à análise de metilação do DNA, a questão-chave que deve ser considerada é a qualidade da amostra de DNA. Portanto, o passo crítico na detecção de 5 mC através de dot blot é o passo de extracção genómica de gDNA. Sugerimos que os pesquisadores usem um kit de extração de gDNA comercialmente disponível para maximizar a concentração e a pureza do gDNA. Além disso, a amostra de ADN deve ser carregada numa membrana de nylon. Outra questão importante é garantir que a amostra de DNA tenha sido imobilizada e totalmente absorvida pela membrana de nylon.
A técnica que descrevemos aqui nos dá a oportunidade de realizar ensaios múltiplos ao menor custo. Uma vantagem adicional desta abordagem é a sua dependência de equipamento simples e acessível para realizar o ensaio e interpretar os resultados. Além disso, ele pode ser usado para compararDiferenças nos níveis de metilação global entre 2 ou mais amostras. Contudo, este ensaio não pode ser utilizado para quantificação precisa dos níveis de metilação do ADN nem para determinar o estado de metilação de CpG de uma sequência de ADN específica. Além disso, este método tem sensibilidade limitada, uma vez que o estado de metilação não pode ser detectado com exactidão em amostras de gDNA abaixo de 50 ng. Embora este método forneça uma análise qualitativa da metilação global do DNA, pode dar origem a resultados falso-positivos se for executado indevidamente.
Em resumo, a mancha ponto 5-mC é um método confiável, simples e rápido para detectar o nível geral de metilação do DNA para avaliar o fenótipo condrócito.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelas seguintes subvenções: Natural Science Foundation of China (No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460); Fundação de ciência natural da província de Guangdong, China (No. 2015A030313772); Projeto financiado da fundação da ciência de Postdoctoral de China (No. 2013M530385); A Fundação de Pesquisa Médica da Província de Guangdong, China (No. A2016314); Shenzhen Science and Technology Projects (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
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