Summary
Vi præsenterer en metode til kvantificering af DNA-methylering baseret på 5-methylcytosin (5-mC) dot blot. Vi fastslog 5-mC niveauerne under chondrocyt dedifferentiering. Denne enkle teknik kunne bruges til hurtigt at bestemme chondrocytfænotypen ved ACI-behandling.
Abstract
Den dedifferentiering af hyalinkondrocytter i fibroblastiske chondrocytter følger ofte monolagsudvidelse af chondrocytter in vitro . Det globale DNA-methyleringsniveau for chondrocytter betragtes som en egnet biomarkør for tabet af chondrocytfænotypen. Resultater baseret på forskellige eksperimentelle metoder kan imidlertid være inkonsekvente. Derfor er det vigtigt at etablere en præcis, enkel og hurtig metode til at kvantificere globale DNA-methyleringsniveauer under chondrocyt dedifferentiering.
Nuværende genomiske brede methyleringsanalyseteknikker afhænger i vid udstrækning af bisulfit genomisk sekventering. På grund af DNA-nedbrydning under bisulfit-omdannelse kræver disse fremgangsmåder typisk et stort prøvevolumen. Andre metoder anvendt til at kvantificere globale DNA-methyleringsniveauer indbefatter højtydende væskekromatografi (HPLC). HPLC kræver imidlertid fuldstændig fordøjelse af genomisk DNA. Derudover er de uforholdsmæssigt høje omkostninger ved HPLC iStruments begrænser HPLCs bredere anvendelse.
I dette studie blev genomisk DNA (gDNA) ekstraheret fra humane chondrocytter dyrket med varierende antal passager. GDNA-methyleringsniveauet blev detekteret under anvendelse af et methyleringsspecifik dot-blot-assay. I denne dot blot-tilgang blev en gDNA-blanding indeholdende det methylerede DNA, der skal detekteres, plettet direkte på en N + -membran som en prikk inde i et tidligere udtrukket cirkulært template-mønster. Sammenlignet med andre gelelektroforese-baserede blottingsmetoder og andre komplekse blottingsprocedurer sparer dot blot-metoden signifikant tid. Dot blots kan desuden detektere det overordnede DNA-methyleringsniveau ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt 5-mC antistof. Vi fandt ud af, at DNA-methyleringsniveauet varierede mellem monolag-subkulturerne og kunne derfor spille en central rolle i chondrocyt dedifferentiering. 5-mC dot blot er en pålidelig, enkel og hurtig metode til at detektere det generelle DNA-methyleringsniveau for at evaluereE chondrocytfænotype.
Introduction
Autolog chondrocytimplantation (ACI) er en forholdsvis ny, state-of-the-art procedure til behandling af ledbruskdefekter 1 , 2 . Et af de afgørende trin i ACI er amplifikation af chondrocytter via monolagskultur in vitro . Under amplifikation mister hyalinkondrocytterne let deres fænotype og bliver dedifferentierede, hvilket er uønsket for ACI-behandling 3 , 4 . For at optimere udfaldet af ACI-behandling bør omfanget af chondrocyt dedifferentiering bestemmes før genplantning. Det er afgørende at etablere en økonomisk og hurtig måde at bestemme kondrocytternes status på. For nylig har forbindelsen mellem DNA-methylering og chondrocyt dedifferentiering tiltrukket meget opmærksomhed 4 , 5 , 6 . DNA-methylering er en proces af whIch methylgrupper tilsættes til DNA, hvilket resulterer i omdannelsen af cytosinrester til 5-methylcytosin (5-mC).
For at belyse DNA-methylationens biologi ved chondrocyt dedifferentiering er det første trin at evaluere DNA-methyleringsniveauet af chondrocytter, som hidtil har vist sig at være udfordrende. Bisulfit genomisk sekventering er den mest anvendte teknik til analyse af DNA-methylering 7 , 8 . I denne analyse forårsager bisulfitomdannelse DNA-nedbrydning, og således skal der tilvejebringes en væsentlig mængde prøve til analysen. Højeffektive væskekromatografi (HPLC) har også været anvendt til at kvantificere globale DNA-methyleringsniveauer 9 , 10 . HPLC-analyse kræver imidlertid genomisk DNA-fordøjelse. Desuden kræves avancerede og dyre eksperimentelle instrumenter. Derfor ud over de høje omkostninger er disse eksperimentelle procedurer tidsforbruguming. Anti-5-mC antistoffer er nu blevet kommercielt tilgængelige, hvilket har skabt muligheden for immun blotting af 5-mC-holdigt genomisk DNA fra komplekse genomer.
I denne rapport ekstraherede vi genomisk DNA fra chondrocytter dyrket i en række monolagskulturer. Vi brugte et dot blot assay til at evaluere 5-mC indholdet i humane chondrocytter med forskellige antal passager. Vi fandt ud af, at 5-mC indhold blev forøget i stærkt dedifferentierede chondrocytter sammenlignet med chondrocytter med lav grad dedifferentiering. Derudover identificerede vi et forhold mellem dedifferentiation status og 5-mC niveauer. Endelig rapporterede vi, at ændringerne i 5-mC-indhold var forbundet med chondrocytfænotypen. Derfor er 5-mC dot blot-analysen en pålidelig, enkel og hurtig metode til at detektere DNA-methyleringsniveauet i chondrocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af Human Ethics Committee i Shenzhen Second People's Hospital.
1. Human articular cartilage Tissue Collection og chondrocyte Culture
- Fremstilling af materialer
- Forbered Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. Klargør 1 mg / ml collagenase II, 0,25% trypsin-EDTA, phosphatpufret saltopløsning (PBS) og en cellefilter (40 μm nylon).
- Humant leddbruskvævssamling
- Isolér ledbrusk fra knæledene hos donorpatienter efter traume. Hent informeret samtykke fra alle deltagere.
- Tør brusket i 1-2 mm 3 stykker ved hjælp af en steril skalpæl og fordøj chondrocytter fra den hakket brusk med 1 mg / ml collagenase II i DMEM ved 37 ° C i 12-16 timer.
- Filtrer den resulterende celleL suspension gennem en cellefilter (40 μm) og vask to gange med PBS.
- Grev celler med et hæmocytometer og frø ved en tæthed på 20.000-30.000 celler / cm2 i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin.
- Kultur i en inkubator ved 37 ° C.
- Monolag kondrocyt ekspansion
- Høst-subkonfluente celler ved anvendelse af 0,25% trypsin-EDTA og genplade ved en densitet på 6.600 celler / cm2. Skift mediet to gange om ugen.
- Kultur chondrocytter i monolayers for op til seks passager og vurder i passager 1, 2, 3, 4 og 5.
2. Genomisk DNA (gDNA) ekstraktion
- Saml celler og resuspender i 500 μl lysisbuffer (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μg / ml RNase A) pr. 10 millioner celler. Resuspender celler ved pipettering og hurtig inversion og inkuber derefter i 1 time ved 37 ° C.
- ENDd proteinase K ved en koncentration på 160 μg / ml cellelysat og omvendt blandingen kraftigt. Inkubér 6 timer ved 55 ° C.
- Tilsæt et volumen Tris pH 7,9 mættet phenol: chloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) til prøven. Vortex eller ryst prøven med hånden grundigt i ca. 20 s.
- Centrifuger prøven ved stuetemperatur i 5 minutter ved 13.000 x g. Fjern den øvre vandige fase og overfør laget til et nyt rør.
- Ekstraher med et lige stort volumen chloroform for at fjerne phenol og overfør den øverste vandige fase til et frisk rør.
- Præcipiterer DNA ved tilsætning af 0,1 prøvevolumen 3 M natriumacetat pH 8,0 og 2 volumener 100% ethanol.
- Opbevar røret ved -20 ° C natten over for at udfælde gDNA'et.
- Centrifugere prøven ved 4 ° C i 10 minutter ved 16.000 xg til pellet gDNA.
- Vask prøven tre gange med 70% ethanol og centrifuger ved 4 ° C i 2 minutter ved 13.000 x g.
- Fjern supernatanenT omhyggeligt og derefter lufttørre. Resuspender DNA'et i 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.
3. DNA Methylering Profilering
- Brug et DNA-methyleringskit til at udføre bisulfitomdannelsesreaktionen under anvendelse af i alt 500 ng af det genomiske DNA ifølge producentens protokol. Eluer i 10 μl elueringsbuffer (50 ng / μl).
- Udfør DNA-methyleringsprofilering ved hjælp af et kommercielt kit ifølge producentens protokol.
4. Dot Blot Analysis
- Denaturer det isolerede DNA (1 mg pr. Prøve) i 0,1 M NaOH i 10 minutter ved 95 ° C. Neutraliser DNA'et med 1 M NH 4 OAc på is og fortynd derefter to gange. Spot 2 μL af det serielle fortyndede genomiske DNA på en N + -membran.
- Blot membranen ved 80 ° C i 30 minutter.
- Bloker ikke-specifikke antistofbindingssteder ved blødning af N + -membranen i 5% BSA i TBS-T i 1 time. Brug en 10 cm petriskål som reaktionIonkammer ved stuetemperatur.
- Efter vask 5 minutter tre gange i TBST inkuberes membranen med et monoklonalt antistof mod 5-methylcytosin (5: mC) monoklonalt antistof (1: 1000) i TBS-T ved 4 ° C natten over.
- Vask membranen i 5 minutter tre gange i TBS-T og inkuber derefter med et sekundært antistof, HRP-konjugeret får-anti-mus-immunoglobulin-G (IgG) (1: 5000) i TBS-T i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask membranen i 5 minutter tre gange i TBS-T.
- Tilsæt enzym substratet til membranen og inkuber i 5-10 minutter. Visualiser det sekundære antistofsignal ved brug af et kemiluminescenssæt ifølge producentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chondrocytter blev dyrket i et monolag op til passage 6 (P6). Chondrocytter udviste progressive fænotypiske ændringer med successive passager i monolagskulturen. P0-chondrocytemorfologien var runde, mens cellerne blev stærkt klæbet og fladt med successive passager op til P6 ( Figur 1 ). Denne morfologiske forandring er typisk for chondrocyt dedifferentieringsprocessen. I mellemtiden viste resultaterne af varmekortet, at det generelle methyleringsniveau for CpG-steder steg med længerevarende subkultur. 5-mC dot blot-analysen viste yderligere, at højere CpG-methyleringsniveauer ledsagede kondrocytudbredelsen ( figur 2 ). Disse resultater foreslog en sammenhæng mellem generelt forøgede methyleringsniveauer og chondrocyt dedifferentiering.
Figur 2: 5-mC-specifik dot blot-analyse af gDNA af chondrocytter. Genomisk DNA blev isoleret fra chondrocytter efter varierende antal passager. Der blev observeret progressivt forhøjede 5-mC-niveauer. 200 ng, 100 ng, 50 ng og 25 ng gDNA blev fyldt pr. Punkt. ( A ) Billede af 5-mC-specifik dot blot; ( B ) Dotintensitetsanalyse af ImageJ. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chondrocyt dedifferentiation in vitro alvorligt kompromitterer resultatet af ACI i behandlingen af brusk fejl reparation 11 , 12 . For at optimere ACI-resultatet er det afgørende at undgå anvendelse af dedifferentierede chondrocytter 13 . Undersøgelser har antydet, at det generelle DNA-methyleringsniveau er forbundet med omfanget af chondrocyt dedifferentiation 4 , 6 . Det er således afgørende at etablere en pålidelig og hurtig metode til at detektere den generelle DNA-methyleringsstatus for chondrocyterne inden den kliniske anvendelse.
For at detektere generelle DNA-methyleringsniveauer i dedifferentierede humane chondrocytter kunne vi måle 5-mC-niveauet i serielt passerede chondrocytter. 5-mC er resistent over for deaminering ved behandling med bisulfit. Denne egenskab blev udnyttet til analyse af DNA-cytosinmethyleringsmønstre ved anvendelse af tHan-bisulfit-sekventeringsmetode 14 . Bisulfit genomisk sekventering og methyleringskänslig restriktionsfordøjelse er blevet betragtet som guldstandardteknologier til påvisning af DNA-methylering 15 , 16 . Disse fremgangsmåder kan identificere 5-mC med enkeltbasepar opløsning. Den største ulempe ved bisulfit-sekventering er imidlertid DNA-nedbrydning under bisulfit-omdannelse. Hvis denne fremgangsmåde blev anvendt til at vurdere chondrocyt dedifferentiering, ville det resultere i spild af de formerede chondrocytter for ACI. HPLC er en anden anvendelig metode til kvantificering af globale DNA-methyleringsniveauer, men det er kun egnet til laboratorier med HPLC-udstyr. Behovet for større prøvevolumener eller moderne udstyr gør således disse fremgangsmåder upraktiske til rutinemæssig 5-mC niveau test i typiske kliniske laboratorier.
Den kommercielle tilgængelighed af 5-mC antistof giver mulighed for at detektereGenerelle DNA-methyleringsniveauer ved anvendelse af et dot blot-assay. Sammenlignet med andre blottingsteknikker er 5-mC dot blot en lettere procedure, som hverken kræver store mængder gDNA eller elektroforese. Derudover er instrumenterne tilgængelige i moderat udstyrede laboratorier. Derfor bør 5-mC dot blot-metoden anvendes som en alternativ tilgang til DNA-methyleringsassay.
I denne rapport identificerede vi en sammenhæng mellem højere 5-mC niveauer og chondrocyt dedifferentiation; 5-mC niveauer steg med stigende subkultur passage. Vores resultater tyder på, at 5-mC kunne være tæt involveret i dedifferentiation forårsaget af monolayer chondrocyt ekspansion betingelser. Vigtigt fandt vi højere 5-mC-niveauer var forbundet med tab af chondrocytfænotypen, hvilket forhindrer bred anvendelse af ACI til reparation af bruskdefekter. Derfor viser vores undersøgelsesresultater, at 5-mC dot blotting kan være en pålidelig måde at måle omfanget afChondrocyt dedifferentiering, især når større antal prøver og mindre mængder gDNA skal analyseres.
For at anvende dot blot metoder til DNA methylation analyse, er det centrale spørgsmål, der skal overvejes, kvaliteten af DNA-prøven. Derfor er det kritiske trin i 5-mC detektion via dot blot det genomiske gDNA ekstraktionstrin. Vi foreslår, at forskere bruger et kommercielt tilgængeligt gDNA-ekstraktionskit til at maksimere gDNA-koncentration og renhed. Desuden bør DNA-prøven lægges på en nylonmembran. Et andet vigtigt spørgsmål er at sikre, at DNA-prøven er blevet immobiliseret og fuldt absorberet af nylonmembranen.
Teknikken vi beskriver her giver os mulighed for at udføre flere analyser til den laveste pris. En yderligere fordel ved denne tilgang er dets afhængighed af simpelt og overkommeligt udstyr til at udføre analysen og fortolke resultaterne. Det kan også bruges til at sammenligne relativForskelle i globale methyleringsniveauer mellem 2 eller flere prøver. Imidlertid kan dette assay ikke anvendes til præcis kvantificering af DNA-methyleringsniveauer eller for at bestemme CpG-methyleringsstatus for en specifik DNA-sekvens. Derudover har denne metode begrænset følsomhed, da methyleringsstatus ikke kan påvises nøjagtigt i gDNA-prøver under 50 ng. Selvom denne metode giver en kvalitativ analyse af global DNA-methylering, kan det give anledning til falske positive resultater, hvis de udføres ukorrekt.
Sammenfattende er 5-mC dot blot en pålidelig, enkel og hurtig metode til at detektere det generelle DNA-methyleringsniveau for at evaluere chondrocytfænotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud: Naturvidenskabsfonden i Kina (nr. 81572198; nr. 81260161; nr. 81000460); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr. 2015A030313772); Kina Postdoktorvidenskabelige Foundation Funded Project (nr. 2013M530385); Medical Research Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr. A2016314); Shenzhen Videnskab og Teknologi Projekter (Nr. JCYJ20160301111338144; Nr. JSGG20151030140325149; Nr. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
