Summary
Vi presenterar en metod för att kvantifiera DNA-metylering baserat på 5-metylcytosin (5-mC) dot blot. Vi bestämde 5-mC-nivåerna vid chondrocyt dedifferentiering. Denna enkla teknik kan användas för att snabbt bestämma kondrocytfenotypen vid ACI-behandling.
Abstract
Differentiering av hyalinkondrocyter i fibroblastiska kondrocyter följer ofta monoskiktsexpansion av kondrocyter in vitro . Den globala DNA-metyleringsnivån av kondrocyter anses vara en lämplig biomarkör för förlusten av kondrocytfenotypen. Resultaten baserade på olika experimentella metoder kan emellertid vara inkonsekventa. Därför är det viktigt att fastställa en exakt, enkel och snabb metod för att kvantifiera globala DNA-metyleringsnivåer under kondrocytdifferentiering.
Aktuella genomomfattande metyleringsanalysstekniker bygger i stor utsträckning på genom-sekvensering av bisulfit. På grund av DNA-nedbrytning under bisulfitomvandling kräver dessa förfaranden vanligen en stor provvolym. Andra metoder som används för att kvantifiera globala DNA-metyleringsnivåer innefattar högprestandad vätskekromatografi (HPLC). HPLC kräver emellertid fullständig digestion av genomiskt DNA. Dessutom är den förbjudna höga kostnaden för HPLC iStruments begränsar HPLCs bredare tillämpning.
I denna studie extraherades genomiskt DNA (gDNA) från humana kondrocyter odlade med varierande antal passager. GDNA-metyleringsnivån detekterades med användning av en metyleringsspecifik dot-blot-analys. I detta dot-blot-tillvägagångssätt upptäcktes en gDNA-blandning innehållande det metylerade DNA som skulle detekteras direkt på ett N + -membran som en punkt i ett tidigare ritat cirkulärt mallmönster. Jämfört med andra gelelektroforesbaserade blottingsmetoder och andra komplexa blottningsförfaranden sparar dot blot-metoden betydande tid. Dessutom kan prickfläckar detektera den totala DNA-metyleringsnivån med användning av en kommersiellt tillgänglig 5-mC antikropp. Vi fann att DNA-metyleringsnivån skilde sig mellan monoskiktets subkulturer och kunde därför spela en nyckelroll vid kondondrocytdifferentiering. 5-mC dot blot är en pålitlig, enkel och snabb metod för att detektera den allmänna DNA-metyleringsnivån för att utvärderaE kondrocytfenotyp.
Introduction
Autolog chondrocytimplantation (ACI) är ett relativt nytt, state-of-the-art-förfarande för behandling av ledbroskfel 1 , 2 . Ett av de avgörande stegen i ACI är amplifiering av kondrocyter via monolagskultur in vitro . Under amplifiering förlorar hyalinkondrocyterna lätt sin fenotyp och blir dedifferentierad, vilket är oönskat för ACI-behandling 3 , 4 . För att optimera resultatet av ACI-behandling, bör graden av kondrocyt dedifferentiering bestämmas före replantering. Det är absolut nödvändigt att etablera ett ekonomiskt och snabbt sätt att bestämma kondrocyternas status. Nyligen har associeringen mellan DNA-metylering och kondrocytdifferentiering dragit stor uppmärksamhet 4 , 5 , 6 . DNA-metylering är en process av whMetylgrupperna sättes till DNA, vilket resulterar i omvandling av cytosinrester till 5-metylcytosin (5-mC).
För att belysa biologin för DNA-metylering vid kondondrocytdifferentiering är det första steget att utvärdera DNA-metyleringsnivån av kondrocyter, som hittills har visat sig utmanande. Bisulfit genomisk sekvensering är den mest använda tekniken för att analysera DNA-metylering 7 , 8 . I denna analys orsakar bisulfitomvandling DNA-nedbrytning och således måste en väsentlig mängd prov tillhandahållas för analysen. Högprestandad vätskekromatografi (HPLC) har också använts för att kvantifiera globala DNA-metyleringsnivåer 9 , 10 . HPLC-analys kräver emellertid genomisk DNA-digestion. Vidare krävs avancerade och dyra experimentella instrument. Därför är förutom de höga kostnaderna dessa experimentella förfaranden tidsavbrottuming. Anti-5-mC antikroppar har nu blivit kommersiellt tillgängliga, vilket har skapat möjligheten för immunblottning av 5-mC-innehållande genomiskt DNA från komplexa genomer.
I denna rapport extraherades vi genomiskt DNA från kondrocyter odlade i en serie monolagskulturer. Vi använde en dot blot-analys för att utvärdera 5-mC-innehållet i humana kondrocyter med olika antal passager. Vi fann att 5-mC-innehållet ökades i starkt dedifferentierade kondrocyter jämfört med kondrocyter med låg gradig dedifferentiering. Dessutom identifierade vi ett förhållande mellan dedifferentiation status och 5-mC nivåer. Slutligen rapporterade vi att förändringarna i 5-mC-innehåll associerades med kondrocytfenotypen. Därför är 5-mC dot blot-analysen en pålitlig, enkel och snabb metod för att detektera DNA-metyleringsnivån i kondrocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av Human Ethics Committee i Shenzhen Second People's Hospital.
1. Mänsklig bröstkärlsvevssamling och krondrocytkultur
- Framställning av material
- Förbered Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) -medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin. Förbered 1 mg / ml kollagenas II, 0,25% trypsin-EDTA, fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och en cellfilm (40 μm nylon).
- Humant artikulär broskvävnadsuppsamling
- Isolera ledbrusk från knäskarv från givarpatienter efter trauma. Hämta informerat samtycke från alla deltagare.
- Tärna brosket i 1-2 mm 3 stycken med en steril skalpell och smälta kondrocyter från det malet brosket med 1 mg / ml kollagenas II i DMEM vid 37 ° C i 12-16 timmar.
- Filtrera den resulterande cellenL suspension genom en cellfilm (40 | im) och tvätta två gånger med PBS.
- Räkna celler med en hemocytometer och frö vid en densitet av 20 000-30 000 celler / cm 2 i DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin.
- Kultur i en inkubator vid 37 ° C.
- Monolayer kondrocyt expansion
- Skördesubkonfluenta celler med användning av 0,25% trypsin-EDTA och omplattning vid en densitet av 6 600 celler / cm 2 . Byt mediet två gånger i veckan.
- Kultur kondrocyter i monolayers för upp till sex passager och bedömer i avsnitt 1, 2, 3, 4 och 5.
2. Genomisk DNA (gDNA) extraktion
- Samla celler och resuspendera i 500 μl lysisbuffert (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 | ig / ml RNas A) per 10 miljoner celler. Resuspendera celler genom pipettering och snabb inversion och inkubera sedan i 1 h vid 37 ° C.
- enDd-proteinas K vid en koncentration av 160 | ig / ml celllysat och invertera blandningen kraftigt. Inkubera 6 timmar vid 55 ° C.
- Tillsätt en volym Tris pH 7,9 mättad fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) till provet. Vortex eller skaka provet med hand noggrant i ca 20 s.
- Centrifugera provet vid rumstemperatur i 5 min vid 13 000 x g. Ta bort den övre vattenfasen och överför skiktet till ett nytt rör.
- Extrahera med en lika stor volym kloroform för att avlägsna fenol och överföra den övre vattenhaltiga fasen till ett nytt rör.
- Precipitera DNA genom att tillsätta 0,1 provvolym 3 M natriumacetat pH 8,0 och 2 volymer 100% etanol.
- Förvara röret vid -20 ° C över natten för att fälla ut gDNA.
- Centrifugera provet vid 4 ° C i 10 minuter vid 16 000 xg till pellets gDNA.
- Tvätta provet tre gånger med 70% etanol och centrifugera vid 4 ° C under 2 min vid 13 000 x g.
- Ta bort supernatanenT försiktigt och lufttorka sedan. Resuspendera DNA: t i 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.
3. DNA-metyleringsprofilering
- Använd en DNA-metyleringskit för att utföra bisulfitomvandlingsreaktionen med användning av totalt 500 ng av det genomiska DNA, enligt tillverkarens protokoll. Eluera i 10 jil elueringsbuffert (50 ng / jil).
- Utför DNA-metyleringsprofilering med hjälp av ett kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll.
4. Dot Blot Analysis
- Denaturera det isolerade DNA (1 mg per prov) i 0,1 M NaOH i 10 minuter vid 95 ° C. Neutralisera DNA med 1 M NH4 OAc på is och späd sedan tvåfaldigt. Ställ 2 μl av det seriella utspädda genomiska DNA på ett N + -membran.
- Blott membranet vid 80 ° C under 30 minuter.
- Blockera icke-specifika antikroppsbindningsställen genom att blötlägga N + -membranet i 5% BSA i TBS-T under 1 h. Använd en 10 cm petriskål som en reaktionJonkammare vid rumstemperatur.
- Efter tvätt 5 min tre gånger i TBST inkuberas membranet med en mus anti-5-metylcytosin (5-mC) monoklonal antikropp (1: 1000) i TBS-T vid 4 ° C över natten.
- Tvätta membranet i 5 minuter tre gånger i TBS-T och inkubera sedan med en sekundär antikropp, HRP-konjugerad får-anti-musimmunoglobulin-G (IgG) (1: 5 000) i TBS-T i 1 h vid rumstemperatur.
- Tvätta membranet i 5 min tre gånger i TBS-T.
- Tillsätt enzymets substrat i membranet och inkubera i 5-10 minuter. Visualisera sekundär antikroppsignalen med hjälp av ett kemiluminescenssats enligt tillverkarens instruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kondrocyter odlades i ett monoskikt upp till passage 6 (P6). Kondrocyter uppvisade progressiva fenotypiska förändringar med successiva passager i monoskiktskulturen. P0-kondrocytmorfologin var rund, medan cellerna blev mycket klämda och planade med successiva passager upp till P6 ( Figur 1 ). Denna morfologiska förändring är typisk för kondrocyt dedifferentieringsprocessen. Under tiden indikerade resultat från värmekartan att den allmänna metyleringsnivån av CpG-ställen ökade med förlängd subkultur. 5-mC-dot-blot-analysen visade vidare att högre CpG-metyleringsnivåer följde kondrocytutbredningen ( Figur 2 ). Dessa resultat föreslog en koppling mellan allmänt ökade metyleringsnivåer och kondrocytdifferentiering.
Figur 2: 5-mC-specifik dot-blot-analys av gDNA av kondrocyter. Genomiskt DNA isolerades från kondrocyter efter varierande antal passager. Progressivt förhöjda 5-mC-nivåer observerades. 200 ng, 100 ng, 50 ng och 25 ng gDNA laddades per punkt. ( A ) Bild av 5-mC-specifik dot blot; ( B ) Dotintensitetsanalys av ImageJ. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chondrocyt dedifferentiering in vitro kompromissar allvarligt resultatet av ACI vid behandling av bruskdefekter 11 , 12 . För att optimera ACI-resultatet är det avgörande att undvika användningen av dedifferentierade kondrocyter 13 . Studier har föreslagit att den allmänna DNA-metyleringsnivån är associerad med graden av kondrocytdifferentiering 4 , 6 . Det är således absolut nödvändigt att upprätta en tillförlitlig och snabb metod för att detektera den allmänna DNA-metyleringsstatusen för kondrocyterna före dess kliniska tillämpning.
För att detektera generella DNA-metyleringsnivåer i dedifferentierade humana kondrocyter kunde vi mäta 5-mC-nivån i seriekänsliga kondrocyter. 5-mC är resistent mot deaminering genom bisulfitbehandling. Denna egenskap utnyttjades för att analysera DNA-cytosinmetyleringsmönster med användning av tHan-bisulfit-sekvenseringsmetoden 14 . Bisulfit genomisk sekvensering och metyleringskänslig restriktionsmältning har betraktats som guldstandardteknologi för detektering av DNA-metylering 15 , 16 . Dessa tillvägagångssätt kan identifiera 5-mC med enkelbasparupplösning. Den största nackdelen med bisulfit-sekvensering är emellertid DNA-nedbrytning under bisulfitomvandling. Om detta tillvägagångssätt användes för att bedöma kondrocytdifferentiering skulle det resultera i slöseri med de propagerade kondrocyterna för ACI. HPLC är en annan praktisk metod för att kvantifiera globala DNA-metyleringsnivåer, men det är endast lämpligt för laboratorier med HPLC-utrustning. Behovet av större provvolymer eller modern utrustning gör således dessa metoder opraktiska för rutinmässig 5-mC-nivåtestning i typiska kliniska laboratorier.
Den kommersiella tillgängligheten av 5-mC antikroppar ger möjlighet att detekteraAllmänna DNA-metyleringsnivåer med användning av en dot-blot-analys. Jämfört med andra blottingstekniker är 5-mC dot blot ett enklare förfarande, vilket inte kräver varken stora mängder gDNA eller elektrofores. Instrumentet finns dessutom tillgängligt i måttligt utrustade laboratorier. Därför bör 5-mC dot blot-metoden användas som ett alternativt tillvägagångssätt för DNA-metyleringsanalys.
I denna rapport identifierade vi en koppling mellan högre 5-mC nivåer och kondrocyt dedifferentiering; 5-mC-nivåer ökade med ökande subkulturpassage. Våra resultat tyder på att 5-mC kan vara intimt involverad i dedifferentiering orsakad av monolayer kondrocyt expansion. Viktigt, vi fann att högre 5-mC-nivåer var associerade med förlust av kondrocytfenotypen, vilket förhindrar bred tillämpning av ACI för att reparera broskfel. Därför tyder våra studieresultat på att 5-mC-punktering kan vara ett tillförlitligt sätt att mäta omfattningen avKondrocyt dedifferentiering, i synnerhet när större antal prover och mindre mängder gDNA ska analyseras.
För att tillämpa dot blot-metoder för DNA-metyleringsanalys är den centrala frågan som måste beaktas kvaliteten på DNA-provet. Därför är det kritiska steget i 5-mC detektion via dot blot det genomiska gDNA-extraktionssteget. Vi föreslår att forskare använder ett kommersiellt tillgängligt gDNA-extraktionssats för att maximera gDNA-koncentrationen och renheten. Dessutom bör DNA-provet laddas på ett nylonmembran. En annan viktig fråga är att säkerställa att DNA-provet har immobiliserats och absorberats fullständigt av nylonmembranet.
Tekniken vi beskriver här ger oss möjlighet att genomföra flera analyser till lägsta kostnad. En ytterligare fördel med detta tillvägagångssätt är dess tillit till enkel och prisvärd utrustning för att utföra analysen och tolka resultaten. Det kan också användas för att jämföra relativSkillnader i globala metyleringsnivåer mellan 2 eller fler prover. Denna analys kan emellertid inte användas för exakt kvantifiering av DNA-metyleringsnivåer eller för bestämning av CpG-metyleringsstatusen för en specifik DNA-sekvens. Dessutom har denna metod begränsad känslighet, eftersom metyleringsstatusen inte kan detekteras exakt i gDNA-prover under 50 ng. Även om denna metod ger en kvalitativ analys av global DNA-metylering, kan det ge upphov till falskt positiva resultat om det utförts felaktigt.
Sammanfattningsvis är 5-mC dot blot en tillförlitlig, enkel och snabb metod för att detektera den allmänna DNA-metyleringsnivån för att utvärdera kondrocytfenotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av följande bidrag: Kinas naturvetenskapliga fonden (nr 81572198; nr 81260161; nr 81000460); Naturvetenskapliga fonden i Guangdong-provinsen, Kina (nr 2015A030313772); Kina Postdoctoral Science Foundation Funded Project (nr 2013M530385); Medical Research Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr A2016314); Shenzhen Vetenskap och teknik Projekt (Nr JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
