Summary
אנו מציגים שיטה לכמת מתילציה דנ"א מבוסס על 5-methylcytosine (5-mC) כתם נקודה. קבענו את רמות 5-mC במהלך dedondferentiation chondrocyte. טכניקה פשוטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע במהירות את הפנוטיפ chondrocyte בטיפול ACI.
Abstract
Dedifferentiation של chondrocytes hyaline לתוך chondrocytes fibroblastic מלווה לעתים קרובות הרחבת monolayer של chondrocytes במבחנה . רמת מתילציה דנ"א גלובלית של chondrocytes נחשבת ביומרקר מתאים לאובדן פנוטיפ chondrocyte. עם זאת, התוצאות על בסיס שיטות ניסיוניות שונות יכול להיות עקבי. לכן, חשוב להקים שיטה מדויקת, פשוטה, מהירה לכמת רמות מתילציה דנ"א העולמי במהלך dedondferentiation chondrocyte.
גנום רחב מתילציה ניתוח טכניקות רחב להסתמך בעיקר על רצף גנומי bisulfite. בשל השפלה דנ"א במהלך המרה bisulfite, שיטות אלה בדרך כלל דורשים נפח מדגם גדול. שיטות אחרות המשמשות לכמת רמות מתילציה דנ"א עולמיות כוללות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). עם זאת, HPLC דורש עיכול שלם של DNA גנומי. בנוסף, עלות גבוהה באופן בלתי נמנע של HPLC בStruments מגבילה את היישום הרחב יותר של HPLC.
במחקר זה, DNA גנומי (gDNA) הופק מן chondrocytes האדם מתורבת עם מספר משתנה של מעברים. רמת מתילציה gDNA זוהה באמצעות assay כתם methylation ספציפיים כתם. בגישה זו כתם נקודה, תערובת gDNA המכיל את ה- DNA methylated להיות מזוהים זוהה ישירות על קרום N + כנקודת בתוך תבנית תבנית מעגלית בעבר. לעומת ג 'ל אחרים מבוססי אלקטרופורזה גישות מתקדמות נהלים מסובכים אחרים, שיטת כתם נקודה חוסך זמן משמעותי. בנוסף, כתמים נקודה יכול לזהות את רמת מתילציה DNA הכולל באמצעות נוגדן זמין מסחרית 5-mC. מצאנו כי רמת מתילציה דנ"א נבדלה בין תת תרבויות monolayer, ולכן יכול לשחק תפקיד מפתח chondrocyte dedifferentiation. הכתם 5-mC נקודה היא שיטה אמינה, פשוטה, מהירה כדי לזהות את רמת מתילציה DNA הכללית להערכתהפונטיפ chondrocyte.
Introduction
השתלת chondrocyte אוטולוגי (ACI) הוא חדש יחסית, המדינה- of-the-art הליך לטיפול מומים סחוס מפרקי 1 , 2 . אחד הצעדים החשובים ב- ACI הוא הגברה של chondrocytes באמצעות תרבות monolayer במבחנה . במהלך הגברה, chondrocytes hyaline בקלות לאבד פנוטיפ שלהם ולהפוך dedifferentiated, וזה לא רצוי לטיפול ACI 3 , 4 . כדי למטב את התוצאה של טיפול ACI, יש לקבוע את מידת ההסתגלות של כונדרוציטים לפני החזרה. זה הכרחי להקים דרך כלכלית מהירה לקבוע את המעמד של chondrocytes. לאחרונה, הקשר בין מתילציה DNA ו dedifferentiation chondrocyte משכה תשומת לב רבה 4 , 5 , 6 . מתילציה דנ"א הוא תהליך של WHIch קבוצות מתיל מתווסף DNA, וכתוצאה מכך המרה של שאריות ציטוזין ל 5-methylcytosine (5-mC).
כדי להבהיר את הביולוגיה של מתילציה דנ"א ב dedifferentiation chondrocyte, הצעד הראשון הוא להעריך את רמת מתילציה DNA של chondrocytes, אשר עד כה הוכיחה אתגר. Bisulfite גנומי רצף היא הטכניקה הנפוצה ביותר לנתח מתילציה DNA 7 , 8 . ב assay זה, המרה bisulfite גורם השפלה DNA, ולכן כמות משמעותית של המדגם חייב להינתן assay. כמו כן, ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) שימשה לכימות רמות מתילציה דנ"א העולמי 9 , 10 . עם זאת, ניתוח HPLC דורש עיכול דנ"א גנומי. בנוסף, נדרשים מכשירים ניסיוניים מתקדמים ויקרים. לכן, בנוסף עלות גבוהה, הליכים אלה הם ניסיוני חסרונות זמןUming. נוגדנים אנטי-5-mC הפכו כעת זמינים מסחרית, אשר יצרה את האפשרות לחסינות חיסונית של דנ"א גנומי 5-cc המכיל גנומים מורכבים.
בדו"ח זה, אנו חילוץ DNA גנומי chondrocytes גדל בסדרה של תרבויות monolayer. השתמשנו assay כתם נקודה כדי להעריך את התוכן 5-mC ב chondrocytes האדם עם מספר שונה של מעברים. מצאנו כי 5-mC התוכן היה גדל chondrocytes מאוד dediferentiated לעומת chondrocytes עם dedifferentiation ברמה נמוכה. בנוסף, זיהינו מערכת יחסים בין מצב דיפוזיציה לבין רמות 5-mC. לבסוף, דיווחנו כי השינויים בתוכן 5-mC היו קשורים הפנוטיפ chondrocyte. לכן, 5-mC נקודה כתם assay היא שיטה אמינה, פשוטה, מהירה כדי לזהות את רמת מתילציה DNA chondrocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה האנושית של בית החולים העממי השני של שנזן.
1. האדם הסחוס ארטיקולרים רקמות אוסף ותרבות chondrocyte
- הכנת חומרים
- הכן בינוני השתנה Dulbecco בינוני (DMEM) בינוני בתוספת 10% בסרום שור עוברית 1% פניצילין סטרפטומיצין. הכן 1 מ"ג / מ"ל collagenase II, 0.25% טריפסין- EDTA, פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), מסננת התא (40 מיקרומטר ניילון).
- אוסף רקמות המפרק האנושי
- בידוד הסחוס המפרקי ממפרקי הברך של חולי התורם לאחר טראומה. קבל הסכמה מדעת מכל המשתתפים.
- הקוביות הסחוס לתוך 1-2 מ"מ 3 חתיכות באמצעות אזמל סטרילי ו chondrocytes לעכל מן הסחוס טחון עם 1 מ"ג / מ"ל collagenase II ב DMEM ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות.
- סינון cel שהתקבלL ההשעיה באמצעות מסננת התא (40 מיקרומטר) ולשטוף פעמיים עם PBS.
- ספירת תאים עם hemocytometer וזרע בצפיפות של 20,000-30,000 תאים / ס"מ 2 ב DMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין סטרפטומיצין.
- תרבות באינקובטור ב 37 ° C.
- התפשטות chondrocyte Monolayer
- קציר תת תאים confluent באמצעות 0.25% טריפסין- EDTA מחדש צלחת בצפיפות של 6,600 תאים / ס"מ 2 . שנה את המדיום פעמיים בשבוע.
- תרבות chondrocytes ב monolayers עד שישה מעברים להעריך במעברים 1, 2, 3, 4 ו - 5.
2. גנומי DNA (gDNA) מיצוי
- איסוף תאים resuspend במאגר 500 תמוגה μL (15 מ"מ טריס pH 8.0, 10 מ"מ EDTA pH 8.0, 0.5% SDS, 200 מיקרוגרם / מ"ל RNase A) לכל 10 מיליון תאים. תאים Resuspend ידי pipetting והיפוך מהיר, ולאחר מכן דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
- אDd proteinase K בריכוז של 160 מיקרוגרם / מ"ל של lysate התא ולהפוך את התערובת במרץ. דגירה 6 שעות ב 55 מעלות צלזיוס.
- הוסף נפח אחד של טריס pH 7.9 רווי פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25: 24: 1) למדגם. וורטקס או לנער את המדגם ביד ביסודיות במשך כ 20 שניות.
- צנטריפוגה המדגם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ב 13,000 × גרם. הסר את השלב מימית העליון ולהעביר את השכבה לצינור טרי.
- חלץ עם נפח שווה של כלורופורם כדי להסיר פנול ולהעביר את השלב מימית העליון צינור חדש.
- ד.ר.לזרז ידי הוספת 0.1 נפח המדגם של 3 M חומצת אצטט pH 8.0 ו 2 כרכים של אתנול 100%.
- חנות הצינור ב -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להאיץ את gDNA.
- צנטריפוגה המדגם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב XG 16,000 כדי gDNA גלולה.
- שטפו את המדגם שלוש פעמים עם אתנול 70%, צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב 13,000 x גרם.
- הסר את supernatanלא בזהירות ולאחר מכן יבש. Resuspend את ה- DNA ב -10 מ"מ טריס pH 8.0, 0.1 מ"מ EDTA.
3. פרופיל מתילציה DNA
- השתמש ערכת מתילציה DNA לבצע את התגובה המרה bisulfite באמצעות סך של 500 ng של הדנ"א הגנומי, על פי פרוטוקול של היצרן. Elute μL 10 של חיץ elution (50 ng / μL).
- בצע את המתילציה DNA פרופיל באמצעות ערכת מסחרי על פי פרוטוקול של היצרן.
4. נקודה כתם ניתוח
- דנו את ה- DNA בודד (1 מ"ג לכל מדגם) ב 0.1 M NaOH במשך 10 דקות ב 95 ° C. לנטרל את ה- DNA עם 1 M NH 4 OAc על הקרח, ולאחר מכן לדלל פי שניים. במקום 2 μL של הדנ"א הגנומי סדרתי על קרום N + .
- כתם את הממברנה על 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לחסום שאינם ספציפיים אתרי נוגדן נוגד על ידי השריית N + קרום ב 5% BSA ב TBS-T עבור 1 שעות. השתמש צלחת 10 פטרי ס"מ כמו להגיבתא יון בטמפרטורת החדר.
- לאחר שטיפה 5 דקות שלוש פעמים ב TBST, דגירה את הממברנה עם עכבר anti-5-methylcytosine (5-mC) נוגדן חד שבטי (1: 1,000) ב TBS-T ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשטוף את הקרום במשך 5 דקות שלוש פעמים ב TBS-T, ולאחר מכן דגירה עם נוגדנים משני, HRP מצומדות כבשים נגד עכבר immunoglobulin- G (IgG) (1: 5,000) ב TBS-T במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הממברנה במשך 5 דקות שלוש פעמים TBS-T.
- מוסיפים את המצע אנזים על הממברנה ו דגירה של 5-10 דקות. דמיינו את אות נוגדנים משני באמצעות ערכת chemiluminescence בהתאם להוראות היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chondrocytes היו מתורבת monolayer עד המעבר 6 (P6). Chondrocytes הראו שינויים פנוטיפיים מתקדמת עם מעברים רצופים של התרבות monolayer. P0 chondrocyte מורפולוגיה היה עגול, בעוד התאים הפך צבוט מאוד שטוח עם מעברים רצופים עד P6 ( איור 1 ). שינוי מורפולוגיה זה אופייני לתהליך הפירוק של הכונדרוציטים. בינתיים, התוצאות של המפה החום עולה כי רמת מתילציה כללית של אתרים CpG גדל עם תת תרבות ממושכת. ניתוח 5-mC נקודה כתם נוסף הראה כי רמות מתילציה CpG גבוה מלווה את התפשטות chondrocyte ( איור 2 ). תוצאות אלו הראו קשר בין רמות מתילציה מוגברת באופן כללי לבין ניתוק של כונדרוציטים.
איור 2: 5-mC ספציפי נקודה כתם assay של gDNA של chondrocytes. הדנ"א הגנומי היה מבודד מ chondrocytes לאחר מספר משתנה של מעברים. רמות גבוהות יותר של 5-mC נצפו. 200 ng, 100 ng, 50 ng ו 25 ng של gDNA הועמסו לכל נקודה. ( א ) תמונה של כתם 5-mc ספציפי נקודה; ( ב ) ניתוח עוצמת נקודה על ידי ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chondrocyte dedifferentiation במבחנה פוגעת קשות את התוצאה של ACI בטיפול תיקון פגם סחוס 11 , 12 . כדי לייעל את התוצאה ACI, חשוב כדי למנוע את השימוש chondrocytes dediferentiated 13 . מחקרים הראו כי רמה כללית מתילציה דנ"א קשורה במידה של dedondferentiation chondrocyte 4 , 6 . לכן, יש צורך להקים שיטה אמינה ומהירה כדי לזהות את מצב מתילציה DNA הכללית של chondrocytes לפני היישום הקליני שלה.
כדי לזהות רמות מתילציה דנ"א כלליות ב chondrocytes האדם dededferentates, נוכל למדוד את רמת 5-mC ב chondrocytes passaged סדרתי. 5-mC עמיד בפני דימינציה על ידי טיפול bisulfite. מאפיין זה נוצל כדי לנתח דפוסי cytosine דגימת cytosine באמצעות tהוא בגישה bisulfite רצף 14 . Bisulfite גנומי רצף ו מתילציה רגיש עיכול הגבלה נחשבו כמו זהב סטנדרטיים טכנולוגיות לזיהוי מתילציה DNA 15 , 16 . גישות אלה יכולות לזהות 5-mC עם רזולוציה זוגית בודדת. עם זאת, החיסרון הגדול ביותר של רצף bisulfite הוא השפלה דנ"א במהלך המרה bisulfite. אם גישה זו שימשה להערכת dedondferentiation chondrocycy, זה יגרום לבזבוז של chondrocytes מופצות עבור ACI. HPLC היא שיטה מעשית נוספת לכמת רמות מתילציה דנ"א עולמיות, אבל זה מתאים רק למעבדות עם ציוד HPLC. לפיכך, הצורך בכמויות גדולות יותר של מדגם או בציוד מודרני הופך את הגישות הללו לבלתי מעשיות עבור בדיקות שגרתיות של 5-mC ברמת מעבדות קליניות אופייניות.
הזמינות המסחרית של נוגדן 5-mC מספק את האפשרות לזהותרמות מתילציה דנ"א כללי באמצעות assay כתם נקודה. לעומת טכניקות אחרות סופג, 5-mC נקודה כתם הוא הליך קל יותר, אשר דורש לא כמויות גדולות של gDNA ולא אלקטרופורזה. בנוסף, המכשירים זמינים במעבדות מאובזרות. לכן, שיטת 5-mC נקודה כתם צריך להיות ישים כגישה חלופית של assay מתילציה DNA.
בדו"ח זה, זיהינו קשר בין רמות 5-mC גבוהות יותר לבין דידו-דיפרנציאציה של כונדרוציטים; 5-mC רמות גדל עם המעבר לתת-גוברת. הממצאים שלנו מראים כי 5-mC עשוי להיות מעורב אינטימי ב dedifferentiation שנגרם על ידי תנאי הרחבה chondrocyte monolayer. חשוב לציין, מצאנו רמות גבוהות יותר 5-mC היו קשורים עם אובדן של פנוטיפ chondrocyte, אשר מונע יישום רחב של ACI לתקן פגמים סחוס. לכן, תוצאות המחקר שלנו מציעות כי 5-mC dot סופג יכול להיות דרך אמינה למדוד את היקףChondrocyte dedifferentiation, במיוחד כאשר מספר גדול יותר של דגימות כמויות קטנות יותר של gDNA הם להיות מנותח.
על מנת ליישם שיטות כתם נקודה כדי ניתוח מתילציה DNA, סוגיית המפתח זה חייב להיחשב היא איכות דגימת DNA. לכן, השלב הקריטי ב 5-mC איתור באמצעות נקודה כתם הוא שלב gDNA גנומי החילוץ. אנו מציעים לחוקרים להשתמש בערכה זמינה gDNA זמין מסחרית כדי למקסם את ריכוז gDNA וטוהר. בנוסף, מדגם DNA צריך להיות נטען על קרום ניילון. נושא חשוב נוסף הוא להבטיח כי דגימת ה- DNA כבר משותק ונקלט במלואו על ידי קרום ניילון.
הטכניקה שאנו מתארים כאן נותן לנו את ההזדמנות לבצע מבחני מרובים במחיר הנמוך ביותר. יתרון נוסף של גישה זו היא הסתמכות על ציוד פשוט ובמחיר סביר לבצע את assay ולפרש את התוצאות. כמו כן, ניתן להשתמש בו כדי להשוות יחסיתהבדלים ברמות מתילציה עולמיות בין 2 דגימות או יותר. עם זאת, assay זה אינו יכול לשמש כימות מדויק של רמות מתילציה DNA או לקבוע את מצב מתילציה CpG של רצף DNA ספציפי. בנוסף, שיטה זו יש רגישות מוגבלת, כמו מצב המתילציה לא ניתן לזהות במדויק ב gDNA דגימות מתחת 50 ng. למרות שיטה זו מספקת ניתוח איכותי של מתילציה דנ"א העולמי, זה יכול לגרום לתוצאות חיוביות כוזב אם ביצע בצורה לא נכונה.
לסיכום, הכתם 5-mC נקודה היא שיטה אמינה, פשוטה, מהירה כדי לזהות את רמת מתילציה DNA הכללית להעריך את הפנוטיפ chondrocyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים: קרן המדע הטבעי של סין (מס '81572198, מס' 81260161, מס '81000460); הקרן למדעי הטבע של גואנגדונג, סין (No. 2015A030313772); סין פרויקט קרן פוסט-דוקטורט של קרן המדע הפוסט-דוקטורט (מס '2013M530385); קרן המחקר הרפואי של פרובינציית גואנגדונג, סין (מס 'A2016314); שנזן מדע וטכנולוגיה פרוייקטים (מס 'JCYJ20160301111338144, מס' JSGG20151030140325149, מס 'JSGG20140519105550503, No.GJHZ20130412153906739, מס' JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
