Summary
Wij presenteren een methode om DNA-methylering te kwantificeren op basis van de 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We bepalen de 5-mC niveaus tijdens chondrocyten dedifferentiatie. Deze eenvoudige techniek kan gebruikt worden om snel het chondrocytfenotype in ACI-behandeling te bepalen.
Abstract
De dedifferentiatie van hyalinechondrocyten in fibroblastische chondrocyten begeleidt vaak monolaaguitbreiding van chondrocyten in vitro . Het globale DNA-methyleringsniveau van chondrocyten wordt beschouwd als een geschikte biomarker voor het verlies van het chondrocytfenotype. Echter, resultaten op basis van verschillende experimentele methodes kunnen inconsistent zijn. Daarom is het belangrijk om een precieze, eenvoudige en snelle methode vast te stellen om globale DNA-methyleringsniveaus te kwantificeren tijdens chondrocytedifferentiatie.
Huidige genoomwijdte methyleeringsanalyse technieken vertrouwen grotendeels op bisulfiet genomische sequencing. Door DNA-afbraak tijdens de bisulfietomzetting, hebben deze methoden typisch een groot monstervolume nodig. Andere methoden die gebruikt worden om globale DNA-methyleringsniveaus te kwantificeren, omvatten hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC). HPLC vereist echter volledige vertering van genomisch DNA. Bovendien, de onvoorziene hoge kosten van HPLC inStruments beperkt HPLC's breder applicatie.
In deze studie werd genomisch DNA (gDNA) geëxtraheerd uit menselijke chondrocyten die werden gekweekt met verschillende aantal passages. Het gDNA-methyleringsniveau werd gedetecteerd onder gebruikmaking van een methyleringspecifieke dot blot analyse. Bij deze dot blot-aanpak werd een gDNA-mengsel dat het gemeten DNA bevat dat gedetecteerd werd, direct op een N + -membraan gezien als een punt in een eerder getekend cirkelvormig sjabloonpatroon. In vergelijking met andere gel-elektroforese gebaseerde blotting benaderingen en andere complexe blotting procedures, bespaart de dot blot methode significante tijd. Daarnaast kunnen dotbots het totale DNA-methyleringsniveau detecteren onder gebruikmaking van een in de handel verkrijgbaar 5-mC-antilichaam. We vonden dat het DNA-methyleringsniveau verschilde tussen de monolaagse subculturen en zou daarom een sleutelrol kunnen spelen bij chondrocytedifferentiatie. De 5-mC dot blot is een betrouwbare, eenvoudige en snelle methode om het algemene DNA-methyleringsniveau te detecteren om te evaluerenE chondrocyt fenotype.
Introduction
Autologe chondrocyt implantatie (ACI) is een relatief nieuwe, state-of-the-art procedure voor het behandelen van articulair kraakbeen defecten 1 , 2 . Een van de cruciale stappen in ACI is de amplificatie van chondrocyten via de monolagcultuur in vitro . Tijdens amplificatie verlielen de hyaline chondrocyten hun fenotype gemakkelijk en worden gedifferentieerd, wat ongewenst is voor ACI-behandeling 3 , 4 . Om de uitkomst van ACI-behandeling te optimaliseren, moet de mate van chondrocytedifferentiatie worden bepaald voor replantatie. Het is essentieel om een economische en snelle manier vast te stellen om de status van chondrocyten te bepalen. Onlangs heeft de associatie tussen DNA methylatie en chondrocyt dedifferentiatie veel aandacht aangetrokken 4 , 5 , 6 . DNA methylering is een proces van whDe methylgroepen worden toegevoegd aan DNA, wat resulteert in de omzetting van cytosine residuen naar 5-methylcytosine (5-mC).
Om de biologie van DNA-methylering bij chondrocytedifferentiatie te verduidelijken, is de eerste stap het DNA-methyleringsniveau van chondrocyten, dat tot nu toe uitdagend is, te evalueren. Bisulfiet genomische sequencing is de meest gebruikte techniek om DNA-methylering 7 , 8 te analyseren. Bij deze analyse veroorzaakt bisulfietomzetting DNA-afbraak en moet dus een substantiële hoeveelheid monster voor de bepaling worden verschaft. Ook is een high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) gebruikt om de globale DNA-methyleringsniveaus 9 , 10 te kwantificeren. HPLC analyse vereist echter genomische DNA-vertering. Bovendien zijn geavanceerde en dure experimentele instrumenten nodig. Daarom zijn deze experimentele procedures naast de hoge kosten tijdsverschillenuming. Anti-5-mC-antilichamen zijn nu in de handel verkrijgbaar, wat de mogelijkheid tot immuun blotting van 5-mC-bevattend genoom DNA van complexe genen heeft gecreëerd.
In dit rapport hebben we genomisch DNA uit chondrocyten geëxtraheerd in een serie monolagenculturen geëxtraheerd. We gebruikten een dot blot analyse om het 5-mC gehalte in humane chondrocyten met verschillende aantallen passages te evalueren. We hebben geconstateerd dat 5-mC-inhoud is verhoogd in sterk gedifferentieerde chondrocyten in vergelijking met chondrocyten met laagwaardige dedifferentiatie. Daarnaast identificeerden we een relatie tussen dedifferentiatiestatus en 5-mC-niveaus. Tenslotte hebben we gemeld dat de veranderingen in 5-mC-inhoud geassocieerd zijn met het chondrocytfenotype. Daarom is de 5-mC dot blot-analyse een betrouwbare, eenvoudige en snelle methode om het DNA-methyleringsniveau in chondrocyten te detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door het Human Ethics Committee van Shenzhen Second People's Hospital.
1. Menselijke Gewrichtskraakbeen Weefsel Verzameling en Chondrocytecultuur
- Bereiding van materialen
- Bereid Dulbecco's gemodificeerde arend medium (DMEM) medium aangevuld met 10% foetaal runder serum en 1% penicilline streptomycine. Bereid 1 mg / ml collagenase II, 0,25% trypsine-EDTA, fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en een celzeef (40 μm nylon).
- Menselijke articulair kraakbeen weefsel collectie
- Isolate gewrichtskraakbeen uit de kniegewrichten van donorpatiënten na trauma. Verkrijg geïnformeerde toestemming van alle deelnemers.
- Dobbel het kraakbeen in 1-2 mm 3 stukken met een steriele scalpel en verteer chondrocyten uit de gehakte kraakbeen met 1 mg / ml collagenase II in DMEM bij 37 ° C gedurende 12-16 uur.
- Filter de resulterende celL suspensie door een celfilter (40 μm) en tweemaal wassen met PBS.
- Tel cellen met een hemocytometer en zaad met een dichtheid van 20.000-30.000 cellen / cm2 in DMEM aangevuld met 10% foetaal runder serum (FBS) en 1% penicilline streptomycine.
- Cultuur in een incubator bij 37 ° C.
- Monolayer chondrocyt expansie
- Oog-sub-confluente cellen die 0,25% trypsine-EDTA gebruiken en opnieuw platen bij een dichtheid van 6.600 cellen / cm2. Verander het medium tweemaal per week.
- Cultuur chondrocyten in monolayers voor maximaal zes passages en beoordelen in de afdelingen 1, 2, 3, 4 en 5.
2. Genomische DNA (gDNA) Extractie
- Verzamel cellen en resuspendeer in 500 μl lysisbuffer (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μg / ml RNase A) per 10 miljoen cellen. Resuspen cellen door pipettering en snelle inversie, en incubeer vervolgens gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- EENDd eiwitase K bij een concentratie van 160 μg / ml cellysaat en omkeer het mengsel krachtig. Incubeer 6 uur bij 55 ° C.
- Voeg een volume Tris pH 7,9 verzadigd fenol toe: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) aan het monster. Vortex of schud het monster grondig voor ongeveer 20 s.
- Centrifugeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten bij 13.000 × g. Verwijder de bovenste waterige fase en laat de laag overbrengen naar een frisse buis.
- Uittrekken met een gelijke hoeveelheid chloroform om fenol te verwijderen en de bovenste waterige fase over te brengen naar een frisse buis.
- Neerslaan DNA door 0,1 monstervolume van 3 M natriumacetaat pH 8,0 en 2 volumes 100% ethanol toe te voegen.
- Bewaar de buis bij -20 ° C 's nachts om het gDNA te precipiteren.
- Centrifugeer het monster bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 16.000 xg tot pellet gDNA.
- Was het monster driemaal met 70% ethanol en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 2 minuten bij 13.000 x g.
- Verwijder de supernatanT zorgvuldig en dan luchtdrogen. Resuspendeer het DNA in 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.
3. DNA Methylation Profiling
- Gebruik een DNA-methyleringskit om de bisulfietomzettingsreactie uit te voeren met een totaal van 500 ng van het genomische DNA volgens het protocol van de fabrikant. Vervolgens in 10 μl elutiebuffer (50 ng / μl).
- Voer het DNA-methyleringprofiel uit met behulp van een commerciele kit volgens het protocol van de fabrikant.
4. Dot Blot Analysis
- Denatureer het geïsoleerde DNA (1 mg per monster) in 0,1 M NaOH gedurende 10 minuten bij 95 ° C. Neutraliseer het DNA met 1 M NH 4 OAc op ijs, en verdun vervolgens tweevoudig. Spot 2 μL van het seriële verdunde genomische DNA op een N + membraan.
- Zet het membraan bij 80 ° C gedurende 30 minuten.
- Blok de niet-specifieke antilichaam bindingsplaatsen door het N + -membraan in 5% BSA in TBS-T gedurende 1 uur aan te slikken. Gebruik een 10 cm Petri-schotel als reactieIonkamer bij kamertemperatuur.
- Na het wassen van 5 minuten driemaal in TBST, incubeer het membraan met een muis anti-5-methylcytosine (5-mC) monoklonaal antilichaam (1: 1000) in TBS-T bij 4 ° C overnacht.
- Was het membraan gedurende 5 minuten driemaal in TBS-T en daarna gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een secundair antilichaam incubatie met HRP-geconjugeerde schaap anti-muis immunoglobuline-G (IgG) (1: 5000) in TBS-T.
- Was het membraan gedurende 5 minuten driemaal in TBS-T.
- Voeg het enzym substraat toe aan het membraan en incubeer gedurende 5-10 minuten. Visualiseer het secundaire antilichaam signaal met behulp van een chemiluminescentie kit volgens de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chondrocyten werden gekweekt in een monolaag tot passage 6 (P6). Chondrocyten vertoonden progressieve fenotypische veranderingen met opeenvolgende passages van de monolaagkweek. De P0 chondrocytemorfologie was rond, terwijl de cellen sterk geknipt en plat werden met opeenvolgende passages tot P6 ( Figuur 1 ). Deze morfologische verandering is kenmerkend voor het chondrocyt dedifferentiatie proces. Ondertussen blijkt uit de warmtekaart dat het algemene methyleringsniveau van CpG-plaatsen verhoogd is met langdurige subcultuur. De 5-mC dot blot analyse heeft verder aangetoond dat hogere CpG methyleringsniveaus de chondrocytepropagatie vergezellen ( Figuur 2 ). Deze resultaten suggereerden een associatie tussen algemeen verhoogde methyleringsniveaus en chondrocytedifferentiatie.
Figuur 2: 5-mC-specifieke dot blot analyse van gDNA van chondrocyten. Genomisch DNA werd geïsoleerd uit chondrocyten na verschillende passages. Progressief verhoogde 5-mC-niveaus werden waargenomen. 200 ng, 100 ng, 50 ng en 25 ng gDNA werden per punt geladen. ( A ) Afbeelding van 5-mC-specifieke dot blot; ( B ) Dotintensiteitsanalyse door de ImageJ. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chondrocyten dedifferentiation in vitro compromiseert het resultaat van ACI ernstig in de behandeling van kraakbeen defect reparatie 11 , 12 . Om het ACI-resultaat te optimaliseren is het van cruciaal belang om het gebruik van gedifferentieerde chondrocyten 13 te vermijden. Studies hebben aangetoond dat algemeen DNA methyleringsniveau geassocieerd wordt met de mate van chondrocytedifferentiatie 4 , 6 . Zo is het van essentieel belang om een betrouwbare en snelle methode vast te stellen om de algemene DNA-methyleringsstatus van de chondrocyten te detecteren voor de klinische toepassing ervan.
Om algemene DNA-methyleringsniveaus in gedifferentieerde menselijke chondrocyten te detecteren, konden we het 5-mC-niveau in seriële passaged chondrocyten meten. 5-mC is bestand tegen deaminatie door behandeling met bisulfiet. Deze eigenschap werd geëxploiteerd om DNA cytosine methylatie patronen te analyseren met behulp van tHij bisulfiet sequencing aanpak 14 . Bisulfiet genomische sequencing en methylatie-gevoelige restrictie vertering zijn beschouwd als gouden standaard technologieën voor de detectie van DNA methylering 15 , 16 . Deze benaderingen kunnen 5-mC identificeren met een enkele basisparenresolutie. Het grootste nadeel van bisulfietsequentiebepaling is echter DNA-afbraak tijdens de omzetting van bisulfiet. Als deze benadering werd gebruikt om chondrocyten dedifferentiatie te beoordelen, zou het resulteren in verspilling van de gepropageerde chondrocyten voor ACI. HPLC is een andere praktische methode om globale DNA-methyleringsniveaus te kwantificeren, maar is alleen geschikt voor laboratoria met HPLC-apparatuur. Zo maakt de behoefte aan grotere monstervolumes of moderne apparatuur deze praktijken onpraktisch voor routine 5-mC-niveau testen in typische klinische laboratoria.
De commerciële beschikbaarheid van 5-mC antilichamen biedt de mogelijkheid om te detecterenAlgemene DNA-methyleringsniveaus met behulp van een dot blot analyse. In vergelijking met andere blottingtechnieken is 5-mC dot blot een makkelijkere procedure, die geen grote hoeveelheden gDNA of elektroforese vereist. Daarnaast zijn de instrumenten verkrijgbaar in matig uitgeruste laboratoria. Daarom moet de 5-mC dot blot methode toepasbaar zijn als een alternatieve aanpak van DNA methylatie assay.
In dit rapport identificeerden we een associatie tussen hogere 5-mC-niveaus en chondrocyten dedifferentiatie; 5-mC-niveaus namen toe met toenemende subcultuur passage. Onze bevindingen suggereren dat 5-mC nauw betrokken kan zijn bij de dedifferentiatie veroorzaakt door monolayer chondrocyt expansie condities. Belangrijk, we vonden dat hogere 5-mC-niveaus werden geassocieerd met verlies van het chondrocyt fenotype, waardoor voorkomende toepassing van ACI wordt voorkomen om kraakbeenafwijkingen te repareren. Daarom wijzen onze onderzoeksresultaten erop dat 5-mC dot blotting een betrouwbare manier kan zijn om de omvang van te metenChondrocyten dedifferentiatie, in het bijzonder wanneer grotere aantallen monsters en kleinere hoeveelheden gDNA geanalyseerd moeten worden.
Om dot blot methoden toe te passen op DNA methylation analyse, is het belangrijkste probleem dat moet worden overwogen, de kwaliteit van het DNA monster. Daarom is de kritische stap in 5-mC detectie via dot blot de genomische gDNA extractie stap. Wij stellen voor dat onderzoekers een commercieel verkrijgbare gDNA-extractie kit gebruiken om de gDNA-concentratie en zuiverheid te maximaliseren. Daarnaast moet het DNA monster op een nylon membraan geladen worden. Een ander belangrijk probleem is ervoor te zorgen dat het DNA-monster geïmmobiliseerd en volledig geabsorbeerd is door het nylonmembraan.
De techniek die we hier beschrijven, geven ons de mogelijkheid om meerdere analyses uit te voeren tegen de laagste kosten. Een bijkomend voordeel van deze aanpak is het vertrouwen op eenvoudige en betaalbare apparatuur om de test uit te voeren en de resultaten te interpreteren. Ook kan het worden gebruikt om relatieve te vergelijkenVerschillen in globale methyleringsniveaus tussen 2 of meer monsters. Deze analyse kan echter niet worden gebruikt voor nauwkeurige kwantificering van DNA-methyleringsniveaus of om de CpG-methyleringsstatus van een specifieke DNA-sequentie te bepalen. Bovendien heeft deze methode een beperkte gevoeligheid aangezien de methyleringsstatus niet nauwkeurig kan worden gedetecteerd in gDNA-monsters onder 50 ng. Hoewel deze methode een kwalitatieve analyse van mondiale DNA-methylering levert, kan dit leiden tot valse positieve resultaten als deze onjuist wordt uitgevoerd.
Samengevat is de 5-mC dot blot een betrouwbare, eenvoudige en snelle methode om het algemene DNA-methyleringsniveau te detecteren om het chondrocytfenotype te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies: Stichting Natuurwetenschappen van China (nr. 81572198; nr. 81260161; nr. 81000460); Stichting Natuurwetenschappen van de provincie Guangdong, China (nr. 2015A030313772); China Postdoctoral Science Foundation Funded Project (nr. 2013M530385); De medische onderzoeksstichting van de provincie Guangdong, China (nr. A2016314); Shenzhen Science and Technology Projects (Nr. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
