Summary
Ici, nous présentons une hydrolyse efficace et une protection Fmoc ultérieure d'un acide aminé isolé à partir d'un complexe à base de Ni-Schiff. Les conditions d'hydrolyse présentées ici sont appropriés pour une utilisation lors de la rétention des groupes protecteurs de chaîne latérale d'acide-labile est nécessaire. Cette technique peut être adaptée à une variété de substrats d'acides aminés non naturels.
Abstract
acides aminés non naturels, des acides aminés contenant des fonctionnalités de chaîne latérale non couramment observés dans la nature, sont de plus en plus trouvent dans des séquences de peptides synthétiques. Synthèse de certains acides aminés non naturels comprennent souvent l'utilisation d'un précurseur constitué d'une base de Schiff stabilisée par un cation de nickel. Unnatural chaînes latérales peuvent être installés sur un acide aminé squelette retrouvé dans cette base de Schiff complexe. L'acide aminé non naturel qui en résulte peut alors être isolé à partir de ce complexe en utilisant l'hydrolyse de la base de Schiff, typiquement en utilisant un reflux dans une solution fortement acide. Ces conditions fortement acides peuvent éliminer les groupes protecteurs de chaîne latérale labile acide nécessaire pour les acides aminés non naturels à utiliser dans la synthèse des peptides en phase solide assistée par micro-ondes. Dans ce travail, nous présentons une hydrolyse efficace et une protection Fmoc ultérieure d'un acide aminé isolé à partir d'un complexe à base de Ni-Schiff. Les conditions d'hydrolyse présentées dans ce travail sont adaptés à la rétention de l'acide s-labilesles groupes protecteurs de chaîne ide et peuvent être adaptable à une variété de substrats d'acides aminés non naturels.
Introduction
Les acides aminés non naturels de chaînes latérales d'appui (SAU) de variant de celles des vingt acides aminés naturels trouvés dans la nature ont trouvé une utilité dans une large gamme d'applications. peut être difficile cependant, la synthèse de ces années SAU, en fonction de la structure des chaînes latérales et la stéréochimie du squelette d'acide aminé. Activation de la liaison CH de glycine dans le contexte d'un complexe de nickel-base de Schiff a été utilisé pour produire une variété de dérivés d'acides aminés , y compris α, des acides ß-diamino 1 et le palier de SAU fluoré 2 ou hétérocycliques chaînes latérales. 3
Après addition de chaînes latérales non naturelles, fonctionnalisés SAU de sont typiquement éliminés du complexe de base de Schiff par reflux dans de l' acide chlorhydrique 4 et sont ensuite isolés en utilisant une Chromatographie par échange d'ions. Bien que généralement efficace, ce protocole génère unmino acides qui peuvent être inappropriés pour une utilisation dans la synthèse de peptides en phase solide (SPPS). La nature de SPPS nécessite la présence de groupes protecteurs de chaîne latérale labile en milieu acide et de la nature fortement acide de conditions typiques de décomposition Ni-base de Schiff empêche l'isolement de la SAU de ces groupes protecteurs intacts. À notre connaissance, seul un procédé de décomposition de remplacement a été rapporté: utilisation de l' acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et de l' hydrazine à des températures élevées, 5 des conditions qui eux - mêmes peuvent ne pas convenir à certains groupes protecteurs de chaîne latérale comme phtalimides.
Figure 1: Synthèse de Ni-PBP-Gly parmi Ni 2+, PBP, et Glycine (Gly). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Ici, nous rapportons un procédé pour l' hydrolyse d'un complexe à base de Ni-Schiff, Ni-PBP-Gly (Figure 1). Ce complexe, dérivé de Ni 2+, de la glycine et la pyridine-2-carboxylique (2-benzoyl-phényl) -amide (PBP), 6 a été démontrée comme étant une plate - forme utile pour la synthèse d'une variété de de SAU et est facilement accessible en utilisant une voie de synthèse en deux étapes. 7 Synthèse de ce complexe est la littérature avec un rendement élevé nombreux précédents. 6 Les résultats décrits ci - dessous démontrent l'applicabilité des conditions d'hydrolyse en utilisant de l' EDTA à modérément acide à des conditions de pH neutres appropriés pour être utilisés avec des groupes protecteurs à chaîne latérale d'acide-labile de palier SAU. Après l' hydrolyse, la solution aqueuse résultante peut être isolée et soumise immédiatement à des conditions de protection Fmoc standard pour permettre un acide aminé protégé par Fmoc (figure 2).
Figure 2: Hydrolyse et Fmoc-protection d'un acide aminé isolé à partir de Ni-PBP-Gly. Conditions de réaction: i. EDTA (12 équiv), pH 4,5; ii. acétate d'éthyle lavage et ajustement à un pH de 7; iii. Fmoc-OSu (1 équiv), NaHCO 3 (2 équiv). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Protocol
1. L'hydrolyse du complexe Ni-base de Schiff
- Dissoudre 1 mmol du complexe à base de Ni-PBP-Schiff dans 40 ml de N, N - diméthylformamide (DMF) sous agitation dans un ballon à fond rond de 250 ml à la température ambiante.
- Ajouter 60 ml de 0,2 M de solution aqueuse d'EDTA, pH 4,5.
- L'utilisation d'un barreau d'agitation magnétique et de la plaque sous agitation, agitation pendant une nuit la solution combinée. Comme le complexe base de Schiff est hydrolysé, la couleur passera d'un rouge profond au blanc.
- Après achèvement de la réaction, comme indiqué par l'absence d'une coloration rouge, transférer la réaction dans une ampoule à décanter de 250 mL.
- Ajouter 50 ml de dichlorométhane, plafonner l'ampoule à décanter, et mélanger. Vidanger le lavage organique dans un bécher de déchets. Répéter cette opération trois fois pour éliminer PBP et tout complexe Ni-PBP-base de Schiff résiduelle. Recueillir la phase aqueuse restante dans un ballon à fond rond de 250 mL.
2. Protection de Fmoc hydrolysée acides aminés
- Ajouter 168 mg de bicarbonate de sodium (2,00 mmol, 2 équiv) à la solution et on agite en utilisant un barreau d'agitation magnétique et de la plaque sous agitation.
- Dissoudre 337 mg de Fmoc N - hydroxysuccinimide ester (1,00 mmol, 1 équivalent) dans une quantité minimale de dioxanne (environ 4 ou 5 mL) dans un flacon de 10 mL. Transférer cette solution dans la solution aqueuse et agiter pendant une nuit.
- Après avoir laissé la réaction sous agitation jusqu'au lendemain, on acidifie la solution résultante à pH 2 avec de l'acide chlorhydrique 1 M. Vérifier le pH en utilisant périodiquement des bandelettes de test de pH.
- Transférer la réaction dans une ampoule à décanter de 250 ml et ajouter 50 ml d'acétate d'éthyle. Cap l'ampoule à décanter, bien mélanger et recueillir la couche organique dans un Erlenmeyer de 250 ml. Répéter ce procédé deux fois de plus, en combinant les extraits organiques. Sécher les extraits organiques combinés avec environ 3 g de sulfat de magnésiume.
- On concentre les extraits organiques combinés à l'aide d'un évaporateur rotatif pour donner le produit brut de l'acide aminé protégé par Fmoc.
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Representative Results
Nous émettons l' hypothèse que le retrait du Ni 2+ du complexe Ni-PBP-Gly pourrait permettre à une hydrolyse aqueuse efficace de la base de Schiff , sans la nécessité de conditions de pH difficiles. Comme EDTA est un agent chélatant peu coûteux et bien étudié, 10 nous avons supposé que l' addition d'EDTA à une solution de Ni-PBP-Gly faciliterait la chélation des ions Ni 2+, favorisant ainsi l' hydrolyse du complexe.
Pour tester seul notre théorie selon laquelle l'EDTA pourrait effectivement favoriser l'hydrolyse du complexe, nous avons soumis une solution de Ni-PBP-Gly dans le DMF à la température ambiante à des équivalents de plus en plus d'EDTA à pH 4,5 solution aqueuse, le pH non ajusté de la solution de sel de disodium aqueuse d'EDTA . Les progrès de la réaction d'hydrolyse peut être contrôlée par l'observation de la couleur de la solution; qui n'a pas réagi dans la solution de Ni-PBP-Gly affiche une couleur rouge intense tout en isolé PBPde ce complexe est blanc. Nous avons suivi le déroulement de la réaction d'hydrolyse en surveillant le changement de couleur de la solution du rouge au blanc (tableau 1). Les réactions impliquant moins de huit équivalents ont montré une certaine transition de coloration du rouge au blanc, mais la réaction a été incomplète dans chaque cas. Aucun changement de couleur était évident pour des conditions sans EDTA.
L'effet du pH sur l'hydrolyse a été évaluée de façon similaire. Assujettissement des conditions d'hydrolyse complexe Ni-PBP-Gly à l'aide de 12 équivalents d'EDTA pendant une nuit à la variation du pH à la température ambiante a montré une hydrolyse réussie du complexe se produit dans des conditions de pH allant de 4,5 à 7,5. Cela démontre la flexibilité d'hydrolyse EDTA; Le pH peut être augmenté pour tenir compte de plusieurs groupes protecteurs de la chaîne latérale sensible aux acides.
| Condition | pH de la solution d'EDTA | achèvement du jour au lendemain | |
| 1 | 0 | 4.5 | Aucun |
| 2 | 2 | 4.5 | Partiel |
| 3 | 4 | 4.5 | Partiel |
| 4 | 6 | 4.5 | Partiel |
| 5 | 8 | 4.5 | Plein |
| 6 | dix | 4.5 | Plein |
| 7 | 12 | 4.5 | Plein |
| 8 | 12 | 5.0 | Plein |
| 9 | 12 | 5.5 | Plein |
| dix | 12 | 6.0 | Plein |
| 11 | 12 | 6.5 | Plein |
| 12 | 12 | 7.0 | Plein |
| 13 | 12 | 7.5 | Plein |
| 14 | 12 | 8.0 | Partiel |
Tableau 1: Ni-PBP-Gly Conditions d' hydrolyse.
Pour vérifier que l'hydrolyse était complète en utilisant la condition la plus efficace, 7, on a extrait la réaction trois fois avec du dichlorométhane, combinées et séchées les couches organiques et analysé le résidu résultant en utilisant une spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN). Le spectre RMN a montré aucune preuve de Ni-PBP-Gly dans l'échantillon; les seules résonances trouvées dans le spectre de la littérature en correspondance des rapports de PBP, ce qui suggère une hydrolyse complète du complexe.
Nous avons examiné la faisabilité de nos conditions d'hydrolyse optimales avec les acides aminés contiennenting une gamme de groupes protecteurs de chaîne latérale. Des échantillons de Fmoc-acide L-glutamique 5 d' ester tertiobutylique (Fmoc-Glu (t Bu) -OH), Fmoc - O - tert - butyl-L-thréonine (Fmoc-Thr (tBu) -OH), Fmoc - O - tert - butyl-L-tyrosine (-OH Fmoc-Tyr (Bu t)), et N (in) N - Boc - α-Fmoc L-tryptophane (-OH Fmoc-Trp (Boc)) ont été dissous dans du DMF et on le soumet à une hydrolyse à la température ambiante en utilisant 12 équivalents de l'EDTA à pH 4,5. Après avoir été laissé sous agitation pendant une nuit, les solutions ont été extraites avec du dichlorométhane et analysés par RMN. Un représentant RMN est inclus pour -OH Fmoc-Glu (tBu) (Figure 3). Dans chaque cas, les données spectrales ont montré la rétention complète des groupes protecteurs de chaîne latérale. 11, 12, 13
Figure 3: RMN représentatif d'un Fmoc-monomère portant une chaîne latérale d' acide-labile protecteur de groupe après avoir été soumis à une hydrolyse Conditions.
Le groupe protecteur de la chaîne latérale de l'acide-labile est mis en évidence avec une boîte bleue. les valeurs d'intégration arrondies pour les signaux de proton de ce composé sont inclus entre parenthèses. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Après hydrolyse et extraction organique, la phase aqueuse restante contenant l'acide aminé libre avec des ions EDTA résiduel et Ni 2+. Pour veiller à ce que la présence de ces substances ne serait pas interférer avec la protection Fmoc ultérieure de l'acide aminé libre, nous avons réalisé une réaction d'essai par dissolution de la glycine dans une solution aqueuse contenant des ions EDTA et Ni 2+ avec des concentrations semblables à l' entrée d'hydrolyse 7. We soumet ensuite cette solution à une protection Fmoc standard aqueux. 8 Après l' achèvement de la réaction et traitement final, on a déterminé la réaction a donné un rendement de 25% de glycine protégée par Fmoc. Ce rendement en pour cent est pas surprenant compte tenu de la concentration diluée de la réaction et donne à penser que la présence d'ions Ni 2+ et EDTA ne pas interférer avec une réaction de protection Fmoc standard.
Preuves à l'appui que chaque composant de notre méthodologie (hydrolyse, l'isolement de l'acide aminé libre, et la protection Fmoc) est possible, nous avons réalisé une expérience de preuve de concept en utilisant Ni-PBP-Gly. Nous avons évalué la viabilité des conditions d'hydrolyse décrites ci - dessus et de protection Fmoc ultérieure en utilisant un protocole standard 8 pour donner un acide aminé protégé par Fmoc avec un rendement raisonnable. A une solution agitée de Ni-PBP-Gly (404 mg, 0,971 mmol, 1 équivalent) dans 40 ml de DMF à la température ambianteérature a ajouté une solution 0,2 M d'EDTA à pH 4,5 (65 mL, 13 mmol, 13 équiv). On a laissé la réaction sous agitation pendant la nuit, puis lavé quatre fois avec du dichlorométhane. La couche aqueuse a été ensuite ajusté à pH 7 en utilisant du bicarbonate de sodium solide. A la couche aqueuse on a ajouté du bicarbonate de sodium (163 mg, 1,93 mmol, 2 équiv) et de Fmoc-OSu (327 mg, 0,971 mmol, 1 équivalent) dissous dans une quantité minimale de dioxanne. On a laissé la réaction sous agitation pendant une nuit, puis acidifié avec de l'acide chlorhydrique 1 M et extraite trois fois avec de l'acétate d'éthyle. Les extraits organiques ont été combinées, lavées six fois avec de la saumure, concentrée, séchée avec du sulfate de magnésium, et on les sèche sous vide pour donner un mélange de non réagi Fmoc-OSu et Fmoc-Gly-OH (160 mg, 0,540 mmol, 54% de rendement). Les données spectrales en correspondance précédemment publiés spectres de Fmoc-Gly-OH. 9 Cette dernière expérience indique qu'il est possible d'isoler la glycine libre du complexe Ni-PBP-Gly et le reporter à son Fmoc-protforme ète.
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Discussion
Le protocole décrit ci-dessus est utile pour sa capacité à faciliter l'isolement d'un squelette d'acides aminés à partir d'un complexe Ni-base de Schiff dans des conditions de pH doux et protection Fmoc subséquente de cet acide aminé isolé par deux étapes essentielles. La première étape consiste à agiter une solution de DMF / eau contenant de l'EDTA pour faciliter la libération de l'acide aminé à partir du complexe. Des sous-produits résiduels complexes ou organiques peuvent être facilement enlevés par extraction. La deuxième étape de ce protocole implique une protection Fmoc de l'acide aminé présent dans la phase aqueuse après séparation par extraction dans la première étape. Nous avons démontré la possibilité de modifier cette procédure dans un intervalle de pH de 4.5 à 7.5, ce qui permet une grande souplesse qui peut être nécessaire pour certains groupes protecteurs de la chaîne latérale sensible au pH.
Une limitation potentielle de cette technique est la faible concentration de réaction de la protection Fmoc de l'acide aminé isolé. En facilitant ehydrolyse FFICIENT nécessite plusieurs équivalents de l'EDTA par rapport au substrat, les conditions de réaction exigent une solution de quantité d'EDTA aqueuse significative (60 mL pour une réaction de 1 mmol-échelle). L'utilisation de ce volume de solvant en résulte une protection Fmoc en une concentration relativement faible (~ 0,015 M) de réactifs. Alors qu'une réaction de preuve de concept en utilisant ces conditions produit offertes dans un rendement prometteur de 55% malgré les conditions de la réaction diluée, il peut être nécessaire d'augmenter cette concentration lors de l'utilisation des acides aminés avec réduction nucleophilicty par rapport à la glycine résultant de masse stérique accrue.
En résumé, nous avons démontré l'utilité de l'EDTA pour favoriser l'hydrolyse d'un complexe de base Ni-Schiff généralement utilisée pour la synthèse de la SAU de. Ces conditions d'hydrolyse ne nécessitent pas la condition fortement acide typique de ces hydrolyses, ce qui permet la rétention des groupes protecteurs de chaîne latérale d'acide-labile. Les expériences futures devraient se concentrer sur l'application tsa stratégie générale à une variété de substrats d'acides aminés non naturels. Les travaux à cette fin est en cours.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Le financement fourni par Slippery Rock University. Nous tenons à remercier T. Boron III (Slippery Rock University) et C. Haney (Université de Pennsylvanie) pour leurs idées.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
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