Summary
Aqui, nós apresentamos uma hidrólise eficiente e subsequente protecção Fmoc de um aminoácido isolado a partir de um complexo de Ni-base de Schiff. As condições de hidrólise aqui apresentados são adequados para utilização quando é necessária a retenção de grupos protectores de cadeia lateral lábil a ácidos. Esta técnica pode ser adaptável a uma variedade de substratos de aminoácidos não naturais.
Abstract
Os aminoácidos não naturais, os aminoácidos contendo funcionalidades de cadeia lateral que não são normalmente vistos na natureza, são cada vez mais encontrada em sequências de péptidos sintéticos. Síntese de alguns aminoácidos não naturais muitas vezes inclui a utilização de um precursor constituído por uma base de Schiff estabilizada por um catião de níquel. Unnatural cadeias laterais pode ser instalado sobre um esqueleto de aminoácidos encontrados neste complexo de base de Schiff. O aminoácido não natural resultante pode então ser isolado a partir deste complexo usando hidrólise da base de Schiff, tipicamente pelo emprego de refluxo em solução fortemente ácida. Estas condições altamente ácidas podem remover-lábil ácido grupos de protecção necessária da cadeia lateral para os aminoácidos não naturais a serem utilizados na síntese de péptidos em fase sólida assistida por microondas. Neste trabalho, nós apresentamos uma hidrólise eficiente e subsequente protecção Fmoc de um aminoácido isolado a partir de uma base de complexo de Ni-Schiff. As condições de hidrólise apresentados neste trabalho são adequados para a retenção de s ácido-lábeis-Cadeia ide grupos de protecção e podem ser adaptável a uma variedade de substratos de aminoácidos não naturais.
Introduction
Os aminoácidos não naturais cadeias laterais de rolamento (de UAA) que variam desde aqueles dos vinte aminoácidos que ocorrem naturalmente encontrados na natureza têm encontrado utilidade numa vasta gama de aplicações. Síntese destes UAA de, no entanto, pode ser difícil, dependendo da estrutura das cadeias laterais e a estereoquímica do esqueleto de aminoácidos. CH activação ligação de glicina no contexto de um complexo de base de Schiff de níquel tem sido usada para produzir uma variedade de derivados de amino ácidos incluindo α, ácidos p-diamino 1 e rolamento da UAA fluorado 2 ou cadeias laterais heterocíclicas. 3
Após a adição de cadeias laterais não naturais, funcionalizado UAA de são tipicamente removidos a partir do complexo de base de Schiff por refluxo em ácido clorídrico 4 e são, subsequentemente, isolado usando cromatograf ia de permuta iónica. Embora geralmente eficiente, este gera um protocoloácidos mino que podem ser inadequados para utilização na sintese de péptidos em fase sólida (SPPS). A natureza da SPPS requer a presença de grupos ácido-lábil de protecção da cadeia lateral e a natureza fortemente ácida de condições típicas de decomposição de Ni-base de Schiff impede isolamento de SAU de com estes grupos protectores intactas. Para nosso conhecimento, apenas um método de decomposição alternativa tem sido relatada: utilização do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e de hidrazina a temperaturas elevadas, 5 condições que se não pode ser adequado para algumas das cadeias laterais grupos protectores tais como ftalimidas.
Figura 1: Síntese de Ni-PBP-Gly a partir de Ni 2+, PBP, e glicina (Gly). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Relata-se um método para a hidrólise de um complexo de Ni-base de Schiff, Ni-PBP-Gly (Figura 1). Este complexo, derivado de Ni 2+, glicina, e piridina-2-carboxílico (2-benzoil-fenil) -amida do ido (PBP), 6, tem sido demonstrado ser uma plataforma útil para a síntese de uma variedade de SAU de e é facilmente acessíveis usando uma via de síntese em duas fases. 7 Síntese de este complexo é, com elevado rendimento precedentes-literatura. 6 Os resultados descritos a seguir demonstram a aplicabilidade de condições de hidrólise utilizando EDTA a levemente ácido a condições de pH neutros adequados para uso com cadeia lateral lábil-ácido rolamento de UAA grupos protectores. A seguir à hidrólise, a solução aquosa resultante pode ser isolado e submetido imediatamente a condições-padrão de protecção Fmoc, para se obter um aminoácido protegido com Fmoc (Figura 2).
Figura 2: Hidrólise e Fmoc-protecção de um aminoácido isolada a partir de Ni-PBP-Gli. Condições de reação: i. EDTA (12 equiv), pH 4,5; ii. Acetato de etilo de lavagem e ajustamento do pH a 7; iii. Fmoc-OSu (1 equiv), NaHCO 3 (2 eq). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. A hidrólise do complexo de Ni-base de Schiff
- Dissolve-se 1 mmol do complexo de Ni-PBP-base de Schiff em 40 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) com agitação num balão de 250 ml de fundo redondo à temperatura ambiente.
- Adicionar 60 ml de solução aquosa de EDTA 0,2 M, pH 4,5.
- Usando uma barra de agitação magnética e agitou-se placa, agita-se a solução combinada durante a noite. Como o complexo de base de Schiff é hidrolisado, a cor vai mudar de um vermelho escuro para branco.
- Depois de se completar a reacção, conforme indicado pela ausência de qualquer coloração vermelha, transferir a reacção para um funil de separação de 250 mL.
- Adicionar 50 mL de diclorometano, a tampa do funil de separação, e misturar. Drenar a lavagem orgânico em um copo de resíduos. Repetir este processo três vezes para remover PBP e qualquer complexo de Ni-PBP-base de Schiff residual. Recolher a camada aquosa restante em um balão de fundo redondo de 250 mL.
2. Protecção Fmoc de Hidrolisado de Aminoácidos
- Adicionar 168 mg de bicarbonato de sódio (2,00 mmol, 2 equiv) à solução e agita-se utilizando uma barra de agitação magnética e agitar placa.
- Dissolve-se 337 mg de éster hidroxisuccinimida de Fmoc N (1,00 mmol, 1 equiv) numa quantidade mínima de dioxano (cerca de 4 ou 5 mL) num frasco de 10 mL. Transferir esta solução à solução aquosa e agita-se durante a noite.
- Depois de deixar a reacção a agitar durante a noite, acidifica-se a solução resultante para pH 2 com ácido clorídrico 1 M. Verificar o pH periodicamente usando tiras de teste do pH.
- Transferir a mistura reaccional para um funil de separação de 250 ml e adicionar 50 ml de acetato de etilo. Tapar o funil de separação, misturar bem, e recolher a camada orgânica num frasco de Erlenmeyer de 250 mL. Repetir este processo mais duas vezes, combinando-se os extractos orgânicos. Secam-se os extractos orgânicos combinados com cerca de 3 g de magnésio sulfate.
- Concentra-se os extractos orgânicos combinados, utilizando um evaporador rotativo para proporcionar o aminoácido protegido com Fmoc em bruto.
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Representative Results
Colocámos a hipótese de que remoção do Ni2 + a partir do complexo de Ni-PBP-Gly pode permitir a uma hidrólise aquosa eficiente da base de Schiff, sem a necessidade de condições de pH duras. Como o EDTA é um agente quelante barato e bem estudada, 10 a hipótese de que a adição de EDTA a uma solução de Ni-PBP-Gly facilitaria a quelação de iões de Ni 2+, promovendo, assim, a hidrólise do complexo.
Para testar a teoria de que o EDTA por si só poderia promover eficazmente a hidrólise do complexo, que submetido uma solução de Ni-PBP-Gly em DMF à temperatura ambiente para aumentar equivalentes de EDTA em pH da solução aquosa a 4,5, o pH não ajustado de solução de sal dissódico de EDTA aquoso . O progresso da reacção de hidrólise pode ser monitorizada pelo observando a cor da solução; que não reagiu Ni-PBP-Gli em solução exibe uma cor vermelho escuro, enquanto PBP isoladoa partir deste complexo é branco. Seguimos o progresso da reacção de hidrólise por monitorização da alteração de cor da solução de vermelho a branco (Tabela 1). As reacções que envolvem menos do que oito equivalentes mostrou alguma transição de coloração de vermelho para branco, mas a reacção estava incompleta, em cada caso. Sem mudança de cor foi evidente para condições sem EDTA.
O efeito do pH na hidrólise foi avaliado da mesma forma. Sujeição do complexo de Ni-PBP-Gly a condições de hidrólise utilizando 12 equivalentes de EDTA durante a noite com diferentes pH, à temperatura ambiente mostrou hidrólise bem sucedida do complexo ocorre sob condições de pH que variam 4,5-7,5. Isto demonstra a flexibilidade da hidrólise de EDTA; O pH pode ser aumentado para ter em conta mais grupos protectores de cadeia lateral sensível a ácido.
| Condição | pH da solução de EDTA | Conclusão overnight | |
| 1 | 0 | 4,5 | Nenhum |
| 2 | 2 | 4,5 | Parcial |
| 3 | 4 | 4,5 | Parcial |
| 4 | 6 | 4,5 | Parcial |
| 5 | 8 | 4,5 | Cheio |
| 6 | 10 | 4,5 | Cheio |
| 7 | 12 | 4,5 | Cheio |
| 8 | 12 | 5 | Cheio |
| 9 | 12 | 5.5 | Cheio |
| 10 | 12 | 6 | Cheio |
| 11 | 12 | 6,5 | Cheio |
| 12 | 12 | 7 | Cheio |
| 13 | 12 | 7,5 | Cheio |
| 14 | 12 | 8 | Parcial |
Tabela 1: Ni-PBP-Gly hidrólise Condições.
Para verificar que a hidrólise estava completa utilizando a condição mais eficiente, 7, extraiu-se a mistura reaccional três vezes com diclorometano, combinadas e secas as camadas orgânicas e analisou-se o resíduo resultante utilizando espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). O espectro de RMN mostrou nenhuma evidência de Ni-PBP-Gli na amostra; as ressonâncias únicas encontradas no espectro correspondeu com relatos da literatura de PBP, sugerindo a hidrólise completa do complexo.
Foi examinada a viabilidade das nossas condições de hidrólise óptimas com aminoácidos contêming uma variedade de grupos protectores de cadeia lateral. Amostras de Fmoc-L-glutâmico ácido 5- terc-butil éster (Fmoc-Glu (tBu) -OH), Fmoc-O - terc-butil-L-treonina (Fmoc-Thr (tBu) -OH), Fmoc - O - terc-butil-L-tirosina (Fmoc-Tyr (tBu) -OH), e N (em) Boc- N α Fmoc-L-triptofano (Fmoc-Trp (Boc) -OH) foram dissolvidos em DMF e submetida a hidrólise à temperatura ambiente utilizando-se 12 equivalentes de EDTA a pH 4,5. Depois de ter sido deixada a agitar durante a noite, as soluções foram extraídas com diclorometano e analisado por RMN. Um RMN representativo é incluído por Fmoc-Glu-OH (tBu) (Figura 3). Em cada caso, os dados espectrais mostraram a retenção completa de grupos de protecção de cadeia lateral. 11, 12, 13
Figura 3: RMN representativas de um Fmoc-monómero de rolamento uma cadeia lateral de ácido-lábil Grupo de Protecção após sujeição a condições de hidrólise.
O grupo protector da cadeia lateral instável em meio ácido é realçada com uma caixa azul. valores de integração arredondados para os sinais de prótons deste composto estão incluídos entre parênteses. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Após hidrólise e extracção orgânica, a camada aquosa restante contém o amino ácido livre, juntamente com EDTA residual e iões de Ni 2+. Para assegurar que a presença dessas substâncias não iria interferir com a protecção Fmoc subsequente do amino ácido livre, foi realizada uma reacção de teste através da dissolução de glicina em uma solução aquosa contendo iões de EDTA e de Ni 2+ com concentrações semelhantes de entrada 7. hidrólise We, em seguida, submetidos a esta solução uma protecção aquosa padrão Fmoc. 8 Depois do final da reacção e processamento, determinou-se a reacção deu um rendimento de 25% de glicina protegido com Fmoc. Esta percentagem de rendimento não é surpreendente considerando a concentração diluída da reacção e sugere que a presença de iões de Ni2 + e EDTA não interferem com uma reacção de protecção Fmoc padrão.
Com provas de que cada componente individual da nossa metodologia (hidrólise, o isolamento do aminoácido livre, e protecção com Fmoc) é viável, foi realizada uma experiência à prova de conceito utilizando Ni-PBP-Gli. Foi avaliada a viabilidade das condições de hidrólise descritas acima e subsequente protecção Fmoc utilizando um protocolo padrão de 8 para se obter um aminoácido protegido com Fmoc, com um rendimento razoável. A uma solução agitada de Ni-PBP-Gly (404 mg, 0,971 mmol, 1 equiv) em 40 mL de DMF à temperatura ambienteerature foi adicionada uma solução 0,2 M de EDTA a pH 4,5 (65 mL, 13 mmol, 13 equiv). A reacção foi deixada a agitar durante a noite e, em seguida, lavou-se quatro vezes com diclorometano. A camada aquosa foi em seguida ajustado para pH 7 utilizando bicarbonato de sódio sólido. Para bicarbonato a camada aquosa foi adicionado sódio (163 mg, 1,93 mmol, 2 equiv) e Fmoc-OSu (327 mg, 0,971 mmol, 1 equiv) dissolvido em uma quantidade mínima de dioxano. A reacção foi deixada a agitar durante a noite e, em seguida, acidificada com ácido clorídrico 1 M e extraiu-se três vezes com acetato de etilo. Os extractos orgânicos foram combinados, lavados seis vezes com salmoura, concentrou-se, secou-se com sulfato de magnésio, e secou-se sob vácuo para se obter uma mistura de n reagido Fmoc-OSu e Fmoc-Gli-OH (160 mg, 0,540 mmol, 54% de rendimento). dados espectrais coincidentes publicado anteriormente espectros por Fmoc-Gly-OH. 9 Esta experiência final indica que é possível isolar a partir de glicina livre o Ni-PBP-Gly complexo e transportá-lo para a frente para a sua Fmoc-protforma ected.
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Discussion
O protocolo descrito acima é útil na sua capacidade para facilitar o isolamento de um esqueleto de aminoácidos a partir de um complexo de Ni-base de Schiff em condições de pH leves e subsequente protecção Fmoc deste aminoácido isolado por meio de dois passos críticos. O primeiro passo envolve a agitação de uma solução de DMF / água contendo EDTA para facilitar a libertação do aminoácido a partir do complexo. Residuais subprodutos orgânicos complexos ou pode ser facilmente removido com extracção. O segundo passo deste protocolo envolve uma protecção Fmoc do aminoácido que se encontra na camada aquosa após isolamento por extracção no primeiro passo. Demonstrámos a possibilidade de modificar este procedimento em um intervalo de pH 4,5-7,5, permitindo uma flexibilidade significativa que pode ser necessária para alguns grupos de protecção de cadeia lateral sensível a pH.
Uma limitação potencial desta técnica é a baixa concentração de reacção de protecção Fmoc do aminoácido isolado. Como facilitando ehidrólise ficiente requer vários equivalentes de EDTA em relação ao substrato, as condições reaccionais requerem uma solução aquosa quantidade significativa de EDTA (60 ml de uma reacção de 1 mmol de escala). Usando este volume de solvente numa resultados de protecção com Fmoc de uma concentração relativamente baixa (~ 0,015 M) de reagentes. Enquanto uma reacção de prova de conceito utilizando estas condições produziu o produto com um rendimento de 55% promissor apesar das condições de reacção diluída, pode ser necessário aumentar esta concentração quando se utiliza aminoácidos com reduzida nucleophilicty relação à glicina, resultante do aumento do volume estérico.
Em resumo, demonstrámos a utilidade do EDTA para promover a hidrólise de um complexo de base de Schiff-Ni normalmente usado para a síntese de SAU de. Estas condições de hidrólise não requerem a condição fortemente ácida típico para estas hidrólises, permitindo a retenção de grupos ácido-lábil de protecção da cadeia lateral. Experimentos futuros devem se concentrar em aplicar tsua estratégia geral para uma variedade de substratos de aminoácidos não naturais. Trabalho nesse sentido está em curso.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Financiamento concedido pela Universidade de Slippery Rock. Nós gostaríamos de agradecer T. Boron III (Slippery Rock University) e C. Haney (Universidade da Pensilvânia) para seus insights.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
- Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic α,β-diamino acids. J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).
- Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear ω,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine. J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).
- Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-β,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles. Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).
- Belokon, Y. N. Highly efficient catalytic synthesis of α,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).
- Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate. J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).
- Belokon, Y. N. Synthesis of α,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases. J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).
- Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine. Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).
- Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries. Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).
- Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. "One-pot", preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide. Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).
- Hart, J. R. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2000).
- Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine. J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).
- Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes. Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).
- Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of α,-peptide-β,-peptoid chimeras. Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).
