Summary
כאן, אנו מציגים הידרוליזה יעיל והגנה Fmoc הבאות של חומצת אמינו מבודדת מתסביך Ni-שיף-בסיס. תנאים הידרוליזה שהוצגו כאן מתאימים לשימוש כאשר השמירה של קבוצות הגנה חומצה-רָפִיף בצד שרשרת נדרשת. טכניקה זו עשויה להיות להתאמה למגוון של מצעי חומצות אמינו לא טבעיים.
Abstract
חומצות אמינו לא טבעיות, חומצות אמינו המכילות פונקציות שרשרת צד לא נראות לרוב בטבע, נמצאות יותר ויותר רצפים פפטיד סינטטיים. סינתזה של כמה חומצות אמינו לא טבעיות כוללת בדרך כלל את השימוש מבשר מורכב שייף-בסיס התייצב ידי קטיון ניקל. ניתן להתקין בצד שרשראות טבעי על עמוד השדרה חומצת אמינו הנמצאת במתחם שיף-בסיס זה. חומצת האמינו טבעי וכתוצאה מכך יכול להיות מבודד אז הידרוליזה באמצעות מורכבות זו של בסיס שיף, בדרך כלל על ידי העסקת ריפלוקס בתמיסה חומצית מאוד. תנאים חומציים ביותר אלה עשויים להסיר שרשרת הצד רָפִיף-חומצה הגנה על קבוצות הכרחי חומצות אמינו לא טבעיות כדי לשמש סינתזה פפטיד מוצק שלב מיקרוגל בסיוע. בעבודה זו, אנו מציגים הידרוליזה יעיל והגנה Fmoc הבאות של חומצת אמינו מבודדת מתסביך בסיס Ni-שיף. תנאים הידרוליזה שהוצגו בעבודה זו מתאימים שמירה של ים חומצה-רָפִיףIDE-שרשרת הגנה על קבוצות ועשויות להיות להתאמה למגוון של מצעי חומצות אמינו לא טבעיים.
Introduction
חומצות אמינו לא טבעיות שרשרות צד נושאת (של UAA) כי שונות מאלו של עשרים חומצות אמינו נמצאו באופן טבעי בטבע מצאו שירות בתוך טווח רחב של יישומים. סינתזה של UAA של אלה, עם זאת, יכול להיות קשה תלוי במבנה-שרשראות הצד ואת סטראוכימיה של עמוד השדרה חומצת אמינו. הפעלת הקשר CH של גליצין בהקשר של מתחם שיף-בסיס ניקל נעשה שימוש כדי לייצר מגוון של נגזרים חומצת אמינו כולל α, חומצות-diamino β 1 ונושאת של UAA fluorinated 2 או בצד שרשראות heterocyclic. 3
לאחר תוספת של שרשרות צד לא טבעיות, פונקציונלי UAA של כלל מוסרים מהמתחם שייף-הבסיס ידי ריפלוקס חומצה הידרוכלורית 4 ובהמשך המבודד באמצעות כרומטוגרפיה-חילוף יונים. אמנם בדרך כלל יעיל, פרוטוקול זה מייצרחומצות המינים שעשויות להיות מתאים לשימוש סינתזת פפטיד מוצק שלב (SPPS). אופי SPPS מחייב נוכחות של הגנה על קבוצות שרשרת בצד חומצה-רָפִיף ואת אופי חומצי מאוד של תנאי הפירוק טיפוסי Ni-שיף-בסיס מונע בידוד של UAA של עם קבוצות הגנה אלה ללא פגע. למיטב ידיעתנו, רק אחד שיטת פירוק אלטרנטיבה דווחה: שימוש בחומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ו הידרזין בטמפרטורות גבוהות, 5 תנאים עצמם לא יכולים להיות מתאימים כמה שרשרת בצד הגנה על קבוצות כגון phthalimides.
איור 1: סינתזה של Ni-PBP-גלאי מ Ni 2+, PBP, ו גליצין (גלאי). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. a>
בזאת, אנו מדווחים על שיטה הידרוליזה של קומפלקס Ni-שיף-בסיס, Ni-PBP-גלאי (איור 1). מורכבות זו, נגזרת Ni 2+, גליצין, וחומצה קרבוקסילית-פירידין-2 (2-בנזואיל-פניל) -amide (PBP), 6 הודגמה להיות פלטפורמה שימושית עבור סינתזה של מגוון UAA של והוא בקלות נגיש באמצעות מסלול סינטטי שני שלבים. סינתזה 7 של מורכבות זו היא-precedented ספרות בתשואה גבוהה. 6 התוצאות שלנו מפורטות להלן להדגים את תחולת התנאים הידרוליזה ניצול EDTA ב במתינות חומצי לתנאי pH ניטראליים המתאים לשימוש עם הגנה על קבוצות השרשרת בצד החומצה-יציבה בעמידתו של UAA. בעקבות הידרוליזה, הפתרון מימי וכתוצאה אפשר לבודד נתון מייד לתנאי הגנת Fmoc תקן להרשות חומצת אמינו-מוגנת Fmoc (איור 2).
o: לשמור-together.within-page = "1"> 
איור 2: הידרוליזה Fmoc-הגנה של חומצת אמינו מבודדת מן Ni-PBP-גלאי. תנאי תגובה: i. EDTA (12 equiv), pH 4.5; ii. אתיל אצטט לשטוף וכוונון ל- pH 7; iii. Fmoc-אוס (1 equiv), NaHCO 3 (2 equiv). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הידרוליזה של קומפלקס Ni-שיף-Base
- ממיסים 1 מילימול של המתחם Ni-PBP-שיף-בסיס ב 40 מ"ל של N, -dimethylformamide N (DMF) עם בוחש בה 250 מ"ל עגול הבקבוק התחתון בטמפרטורת החדר.
- להוסיף 60 מ"ל של 0.2 פתרון EDTA מימית M, 4.5 pH.
- שימוש בר ומערבבים מגנטי ומערבבים צלחת, ומערבבים הפתרון המשולב לילה. כמתחם שיף-בסיס הוא הידרוליזה, הצבע יהיה לעבור ממדיניות מוניטרית אדום עמוק ללבן.
- לאחר השלמת התגובה כפי שצוין על ידי בהעדר כל צבע אדום, להעביר את התגובה משפך 250 מ"ל separatory.
- להוסיף 50 מ"ל dichloromethane, מכסה את המשפך separatory, ומערבבים. מסננים את לשטוף אורגני לתוך מבחנה פסולת. חזור על תהליך זה שלוש פעמים כדי להסיר PBP וכל מורכבים Ni-PBP-שיף-בסיס שיורית. אסוף את השכבה המימית שנותרה בבקבוק תחתי עגול 250 מיליליטר.
2. הגנה Fmoc של Hydrolyzed חומצת אמינו
- הוספת 168 מ"ג סודיום ביקרבונט (2.00 מילימול, 2 equiv) לפתרון ומערבבים בעזרת בר ומערבבים מגנטי ומערבבים צלחת.
- ממיסים 337 אסתר Fmoc N -hydroxysuccinimide מ"ג (1.00 מילימול, 1 equiv) בסכום מינימלי של dioxane (בערך 4 או 5 מ"ל) ב בקבוקון 10 מ"ל. העבר פתרון זה בתמיסה מימית ומערבבים במשך הלילה.
- לאחר המאפשר תגובה לעורר לילה, להפוך לחומצה הפתרון שהתקבל ל- pH 2 עם 1 חומצה הידרוכלורית M. בדוק מעת לעת pH באמצעות רצועות מבחן ה- pH.
- מעבירים את התגובה משפך 250 מ"ל separatory ולהוסיף 50 אתיל אצטט מ"ל. כיסוי או משפך separatory, לערבב היטב, ולאסוף את השכבה האורגנית בבקבוק מ"ל Erlenmeyer 250. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות, שילוב תמציות אורגניות. יבש את תמציות אורגניות בשילוב עם בערך 3 גרם של מגנזיום sulfate.
- לרכז את התמציות אורגניות בשילוב באמצעות מאייד סיבובי כדי להרשות חומצת אמינו Fmoc המוגנת הגולמית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
החוקרים שיערו כי הסרת Ni 2+ מהמתחם Ni-PBP-גלאי עלולה לאפשר הידרוליזה מימית יעיל של בסיס שיף ללא צורך בתנאים קשים pH. כמו EDTA הוא סוכן chelating זול היטב למד, 10 שיערנו כי תוספת של EDTA לפתרון של Ni-PBP-גלאי יקל קלאציה של יוני Ni 2+, ובכך לקדם הידרוליזה של המתחם.
כדי לבחון את התיאוריה שלנו כי EDTA לבד יכול לקדם הידרוליזה ביעילות של המתחם, חשפנו פתרון של Ni-PBP-גלאי ב DMF בטמפרטורת החדר כדי להגדיל ושווי של EDTA ב pH 4.5 בתמיסה מימית, ה- pH ללא התאמות של תמיסת מלח disodium EDTA מימית . התקדמות התגובה הידרוליזה ניתן לנטר ידי התבוננות הצבע של הפתרון; unreacted Ni-PBP-גלאי בתמיסה מציג צבע אדום עמוק תוך PBP מבודדממתחם זה הוא לבן. אנחנו במעקב אחר התקדמות התגובה הידרוליזה על ידי ניטור שינוי הצבע של פתרון מאדום ללבן (לוח 1). התגובות היה מעורבים פחות משמונה ושווי הראו כמה מעבר של צביעת מאדום ללבן, אבל התגובה לא הייתה שלמה בכל מקרה. אין שינוי צבע בלטת תנאים בלי EDTA.
השפעת ה- pH על הידרוליזה הוערכה באופן דומה. כפיפות של מתחם Ni-PBP-הגלאי לתנאים הידרוליזה באמצעות 12 ושווי של EDTA לילה עם משתנה pH בטמפרטורת החדר הראו הידרוליזה מוצלחת של המתחם מתרחשת בתנאי pH הנעים בין 4.5 ל -7.5. זה מדגים את הגמישות של הידרוליזה EDTA; pH ניתן להגדיל לתת דין וחשבון על קבוצות הגנת חומצה רגישה יותר בצד שרשרת.
| מַצָב | pH של פתרון EDTA | השלים לילה | |
| 1 | 0 | 4.5 | אף אחד |
| 2 | 2 | 4.5 | חלקי |
| 3 | 4 | 4.5 | חלקי |
| 4 | 6 | 4.5 | חלקי |
| 5 | 8 | 4.5 | מלא |
| 6 | 10 | 4.5 | מלא |
| 7 | 12 | 4.5 | מלא |
| 8 | 12 | 5.0 | מלא |
| 9 | 12 | 5.5 | מלא |
| 10 | 12 | 6.0 | מלא |
| 11 | 12 | 6.5 | מלא |
| 12 | 12 | 7.0 | מלא |
| 13 | 12 | 7.5 | מלא |
| 14 | 12 | 8.0 | חלקי |
טבלה 1: Ni-PBP-גלאי הידרוליזה תנאי.
כדי לוודא הידרוליזה הושלם באמצעות התנאי היעיל ביותר, 7, שחילצנו את התגובה שלוש פעמים עם dichloromethane, בשילוב מיובשים שכבות אורגניות וניתח את שאריות וכתוצאה באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR). ספקטרום התמ"ג הראה שום הוכחה של Ni-PBP-גלאי במדגם; את ההדים רק נמצאים בספקטרום מתאים דיווחים בספרות של PBP, דבר המצביע על הידרוליזה מלאה של המתחם.
בוחנים את הכדאיות של תנאי הידרוליזה האופטימליים שלנו עם חומצות אמינו המכילהing מגוון של קבוצות הגנה-שרשרת בצד. דוגמאות של Fmoc-L-חומצה גלוטמית 5 אסתר טרט -butyl (Fmoc-Glu (t Bu) -OH), Fmoc- O - טרט -butyl-L-תראונין (Fmoc-Thr (t Bu) -OH), Fmoc - O - טרט -butyl-L-tyrosine (Fmoc-טיר (t Bu) -OH), ו- N (ב) -Boc- N α -Fmoc-L- טריפטופן (Fmoc-TRP (בוק) -OH) התמוססו ב DMF נתון הידרוליזה בטמפרטורת החדר באמצעות 12 ושווי של EDTA ב- pH 4.5. לאחר שהורשה ומערבבים לילה, הפתרונות חולצו עם dichloromethane ונותחו על ידי התמ"ג. נציג NMR כלול עבור Fmoc-Glu (TBU) -OH (איור 3). בכל מקרה, נתונים ספקטרליים הראו שימור מלא של קבוצות הגנה-שרשרת בצד. 11, 12, 13
איור 3: נציג התמ"ג של Fmoc-מונומר Bearing שרשרת-סייד חומצה-רָפִיף הגנה קבוצה אחרי כפיפות תנאי הידרוליזה.
הקבוצה בהגנת החומצה-רָפִיף בצד השרשרת מסומנת עם קופסא כחולה. ערכי אינטגרציה מעוגלים עבור אותות הפרוטון של תרכובת זו כלולים בסוגריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
לאחר הידרוליזה מיצוי אורגני, את השכבה המימית הנותרים מכיל את חומצת האמינו חינם יחד עם EDTA שיורית ויונים Ni 2+. כדי להבטיח כי הנוכחות של חומרים אלה לא מפריעה הגנה עוקבת Fmoc של חומצת אמינו החופשית, בצענו תגובת מבחן על ידי המסת גליצין בתוך תמיסות מימיות המכילות EDTA ו Ni 2+ יונים עם ריכוזי דומה כניסה הידרוליזה 7. Wדואר אז נתון פתרון זה הגנה Fmoc תקן מימית. 8 לאחר השלמת התגובה ועבודה-אפ, קבענו התגובה המוענקת תשואה 25% של גליצין Fmoc המוגנים. תשואת אחוז זה אינה מפתיעה בהתחשב הריכוז המדולל של התגובה ואת מצביעה על הנוכחות של Ni 2 + יונים ו EDTA לא להפריע תגובת הגנת Fmoc סטנדרטית.
עם ראיות התומכות כי כל רכיב בודד של המתודולוגיה שלנו (הידרוליזה, בידוד של חומצת אמינו חופשית, והגנת Fmoc) אינו ריאלי, בצענו ניסוי הוכחה של מושג באמצעות Ni-PBP-גלאי. החוקרים העריכו את יכולת הקיום של תנאי הידרוליזה שתוארו לעיל והגנת Fmoc עוקבת באמצעות פרוטוקול סטנדרטי 8 להרשות חומצת אמינו-מוגנת Fmoc בתשואה סבירה. לפתרון עורר של Ni-PBP-גלאי (404 מ"ג, 0.971 mmol, 1 equiv) ב 40 מ"ל DMF בטמפ 'החדרerature נוספה 0.2 M פתרון EDTA על 4.5 pH (65 מ"ל, 13 מילימול, 13 equiv). תגובת הורשה ומערבבת לילה ולאחר מכן לשטוף ארבע פעמים עם dichloromethane. את השכבה המימית אז הותאמה ל- pH 7 באמצעות סודיום ביקרבונט מוצק. לשכבה מימית נוספה סודיום ביקרבונט (163 מ"ג, 1.93 מילימול, 2 equiv) ו Fmoc-אוס (327 מ"ג, 0.971 mmol, 1 equiv) המומסים כמות מינימלית של dioxane. התגובה הורשה ומערבבים לילה ואחר acidified עם 1 חומצה הידרוכלורית M והוציא שלוש פעמים עם אתיל אצטט. תמציות אורגניות אוחדו, נשטף שש פעמים עם מלח, מרוכז, יבשים עם מגנזיום סולפט, מיובשים תחת ואקום כדי להרשות תערובת של unreacted Fmoc-אוס ו Fmoc-גלאי-OH (160 מ"ג, 0.540 mmol, 54% תשואה). נתוני ספקטרום לא התאימו שפורסמו ספקטרה בעבר עבור Fmoc-גלאי-OH. 9 הניסוי הסופי זה מעיד על כך שהוא אינו ריאלי לבודד גליצין חינם מהמתחם Ni-PBP-גלאי ולשאת אותו קדימה כדי Fmoc-prot שלהטופס ected.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר לעיל הנו שימושי ביכולתה להקל על הבידוד של עמוד שדרת חומצת אמינו מתסביך Ni-שייף-בסיס בתנאי pH קלים והגנה עוקבת Fmoc של חומצת אמינו מבודדת זו דרך שני שלבים קריטיים. השלב הראשון כולל ערבוב פתרון DMF / מים המכיל EDTA כדי להקל שחרור חומצת אמינו מהמתחם. תוצרי לוואי מורכבים שיורים או אורגניים ניתן להסיר בקלות עם חילוץ. השלב השני של פרוטוקול זה כרוך הגנת Fmoc של חומצות אמינו הנמצאות את השכבה המימית לאחר בידוד על ידי מיצוי בשלב הראשון. הוכחנו את היכולת לשנות נוהל זה במגוון pH של 4.5-7.5, מה שמאפשר גמישות רבה אשר עשוי להיות נחוץ עבור כמה קבוצות הגנה pH רגיש בצד שרשרת.
מגבלה פוטנציאלית אחת של טכניקה זו היא ריכוז התגובה הנמוך של גינת Fmoc של חומצת אמינו המבודדת. כמו דואר הקלההידרוליזה fficient דורש ושווי כמה היחסית EDTA למצע, התנאים התגובה דורשים פתרון EDTA מימית כמות משמעותית (60 מ"ל עבור לתגובה 1 מילימול מידה). תוך שימוש בנפח הזה של ממס בתוך תוצאות גינת Fmoc בריכוז של ריאגנטים נמוך יחסית (~ 0.015 M). בעוד תגובת הוכחה של מושג באמצעות התנאים הללו המוענקת מוצר ב תשואת 55% מבטיחה למרות תנאי התגובה לדלל, זה עשוי להיות נחוץ כדי להגביר את הריכוז הזה כאשר ניצול חומצות אמינו עם היחסי nucleophilicty מופחת גליצין הנובע בתפזורת סטרית מוגברת.
לסיכום, אנו הדגימו את התועלת של EDTA לטפח הידרוליזה של מתחם הבסיס Ni-שיף משמש בדרך כלל את הסינתזה של UAA של. תנאים הידרוליזה אלו אינם מחייבים את מצבו חומצי מאוד אופייני הידרוליזה אלה, המאפשרים שימור של קבוצות הגנה-שרשרת צד חומצה-יציבה. ניסויים עתידיים צריכים להתמקד חלי tהאסטרטגיה הכללית שלו מגוון מצעי חומצות אמינו לא טבעיים. עבודה לקראת סוף זה הוא מתמשך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
במימון Slippery Rock האוניברסיטה. ברצוננו להודות ט בורון III (אוניברסיטת סלע חלקלק) ו ג הייני (אוניברסיטת פנסילבניה) על התובנות שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
- Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic α,β-diamino acids. J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).
- Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear ω,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine. J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).
- Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-β,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles. Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).
- Belokon, Y. N. Highly efficient catalytic synthesis of α,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).
- Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate. J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).
- Belokon, Y. N. Synthesis of α,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases. J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).
- Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine. Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).
- Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries. Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).
- Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. "One-pot", preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide. Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).
- Hart, J. R. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2000).
- Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine. J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).
- Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes. Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).
- Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of α,-peptide-β,-peptoid chimeras. Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).
