Summary
Här presenterar vi en effektiv hydrolys och efterföljande Fmoc-skyddning av en aminosyra som isolerats från en Ni-Schiff-bas-komplex. Hydrolysbetingelser som presenteras här är lämpliga för användning när det krävs retention av syralabil sidokedjeskyddande grupper. Denna teknik kan vara anpassningsbar till en mångfald av onaturliga aminosyrasubstrat.
Abstract
Onaturliga aminosyror, aminosyror innehållande sidokedjefunktionaliteter inte oftast ses i naturen, i allt högre grad finns i syntetiska peptidsekvenser. Syntes av vissa onaturliga aminosyror innefattar ofta användning av en prekursor bestående av en Schiffsk bas stabiliseras av en nickel katjon. Onaturliga sidokedjor kan installeras på en aminosyraskelettet finns i detta Schiff-bas-komplex. Den resulterande onaturliga aminosyran kan sedan isoleras från detta komplex med användning av hydrolys av den Schiffska-bas, typiskt genom användning av återloppskokning i starkt sur lösning. Dessa mycket sura förhållanden kan avlägsna syralabila sidokedjeskyddande grupper som är nödvändiga för de onaturliga aminosyrorna som skall användas i mikrovågsassisterad fast-fas-peptidsyntes. I detta arbete, presenterar vi en effektiv hydrolys och efterföljande Fmoc-skyddning av en aminosyra som isolerats från en Ni-Schiff-bas-komplex. Hydrolysbetingelser som presenteras i detta arbete är lämpliga för bibehållande av syra-labila side-kedja skyddande grupper och kan vara anpassningsbar till en mångfald av onaturliga aminosyrasubstrat.
Introduction
Onaturliga aminosyror (UAA s) lagersidokedjor som varierar från de av de tjugo naturligt förekommande aminosyrorna som finns i naturen har funnit användning inom ett brett spektrum av applikationer. Syntes av dessa UAA s dock kan vara svårt beroende på strukturen av de sidokedjor och stereokemin av aminosyraryggraden. CH bond aktivering av glycin i samband med en nickel Schiff-bas-komplex har använts för att tillverka en mängd olika aminosyraderivat inklusive α, p-diamino syror 1 och UAA s lager fluorerad 2 eller heterocykliska sidokedjor. 3
Efter tillsats av onaturliga sidokedjor, funktionaliserad UAA s avlägsnas typiskt från Schiff-bas-komplex genom återflöde i saltsyra 4 och därefter isoleras med användning av jonbyteskromatografi. Medan generellt effektiv, detta protokoll genererar enmino syror som kan vara olämpliga för användning i fast-fas peptidsyntes (SPPS). Naturen av SPPS kräver närvaron av syralabil sidokedjeskyddande grupper och det kraftigt sura naturen hos typiska Ni-Schiff-bas sönderdelningsbetingelser förhindrar isolering av UAA-talet med dessa skyddsgrupper intakta. Såvitt vi vet har endast ett alternativ nedbrytningsmetod rapporterats: användning av etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och hydrazin vid förhöjd temperatur, 5 villkor som själva inte kan vara lämpliga för vissa sidokedjeskyddande grupper såsom ftalimider.
Figur 1: Syntes av Ni-PBP-Gly från Ni2 +, PBP, och Glycine (Gly). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Häri, rapporterar vi ett förfarande för hydrolys av en Ni-Schiff-bas-komplex, Ni-PBP-Gly (fig 1). Detta komplex, som härrör från Ni2 +, glycin och pyridin-2-karboxylsyra- (2-bensoyl-fenyl) -amid (PBP), 6 har visat sig vara en användbar plattform för syntes av en mängd olika UAA s och är lätt tillgängliga med användning av en tvåstegs syntetisk väg. 7 Syntes av detta komplex är litteratur-precedented i högt utbyte. 6 Våra resultat som beskrivs nedan demonstrerar användbarheten av hydrolysbetingelser som utnyttjar EDTA vid milt sura till neutrala pH-betingelser som är lämpliga för användning med UAA s lager syralabil sidokedjeskyddande grupper. Efter hydrolys, kan den resulterande vattenlösningen isoleras och underkastas omedelbart till standardbetingelser Fmoc skydds till bildning av en Fmoc-skyddad aminosyra (Figur 2).
Figur 2: Hydrolys och Fmoc-skydd av en aminosyra Isolerad från Ni-PBP-Gly. Reaktionsbetingelser i. EDTA (12 ekv), pH 4,5; ii. Etylacetat tvätt och justering till pH 7; III. Fmoc-OSu (1 ekv), NaHCOa 3 (2 ekv). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hydrolys av Ni-Schiff-Base Complex
- Lös upp 1 mmol av Ni-PBP-Schiff-bas-komplex i 40 ml N, N-dimetylformamid (DMF) under omröring i en 250 ml rundbottnad kolv vid rumstemperatur.
- Tillsätt 60 ml 0,2 M vattenhaltig EDTA-lösning, pH 4,5.
- Användning av en magnetisk omrörarstav och rör om plattan, rör den kombinerade lösningen över natten. Som den Schiff-bas-komplexet hydrolyseras, kommer färgen att skifta från en djupröd till vitt.
- Efter fullbordan av reaktionen såsom indikeras av frånvaron av någon röd färg, överföra reaktionen till en 250 ml separationstratt.
- Lägga 50 ml diklormetan, cap separationstratten, och blanda. Dränera den organiska tvätt in i en avfallsbägare. Upprepa denna process tre gånger för att avlägsna PBP och eventuellt kvarvarande Ni-PBP-Schiff-bas-komplex. Uppsamling av resterande vattenskiktet i en 250 ml rundbottnad kolv.
2. Fmoc Skydd av hydrolyserat Aminosyra
- Lägg 168 mg natriumbikarbonat (2,00 mmol, 2 ekv) till lösningen och rör om med användning av en magnetisk omrörarstav och rör om plattan.
- Upplös 337 mg Fmoc N-hydroxisuccinimid-ester (1,00 mmol, 1 ekv) i en minimal mängd dioxan (ungefär 4 eller 5 ml) i en 10 mL vial. Överföra denna lösning till den vattenhaltiga lösningen och omrördes över natten.
- Efter att reaktions omröras över natten, surgör den resulterande lösningen till pH 2 med 1 M saltsyra. Kontrollera pH periodiskt med användning pH testremsor.
- Överföra reaktionen till en 250 ml separationstratt och tillsätt 50 ml etylacetat. Cap separationstratten, blanda väl, och samla det organiska skiktet i en 250 mL Erlenmeyer kolv. Upprepa denna process två ytterligare gånger, kombinering av de organiska extrakten. Torka de kombinerade organiska extrakten med ungefär 3 g magnesium sulfate.
- Koncentrera de kombinerade organiska extrakten med användning av en rotationsindunstare för att ge den råa Fmoc-skyddad aminosyra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi hypotesen att borttagande av Ni2 + från Ni-PBP-Gly-komplexet kan ge effektiv vattenhaltig hydrolys av Schiff-bas utan behov av hårda pH-betingelser. Såsom EDTA är ett billigt och väl studerade kelatbildare, 10 vi hypotesen att tillsats av EDTA till en lösning av Ni-PBP-Gly skulle underlätta kelatering av Ni2 + -joner och därigenom främja hydrolys av komplexet.
För att testa vår teori om att enbart EDTA effektivt kan främja hydrolys av komplexet, vi utsattes en lösning av Ni-PBP-Gly i DMF vid rumstemperatur till ökande ekvivalenter av EDTA i pH 4,5 vattenhaltig lösning, det ojusterade pH-värdet för vatten EDTA-dinatriumsalt-lösning . Fortskridandet av hydrolysreaktionen kan övervakas genom observation av lösningens färg; oreagerad Ni-PBP-Gly i lösning uppvisar en djup röd färg medan PBP isoleradefrån detta komplex är vita. Vi spårade fortskridandet av hydrolysreaktionen genom övervakning av färgförändring av lösningen från rött till vitt (tabell 1). Reaktioner som involverar färre än åtta ekvivalenter visade viss övergång av färgning från rött till vitt, men reaktionen var ofullständig i varje fall. Ingen färgförändring var uppenbart för förhållanden utan EDTA.
Effekten av pH på hydrolys på liknande sätt utvärderas. Underkastelse av Ni-PBP-Gly komplexet till hydrolysbetingelser med användning 12 ekvivalenter av EDTA över natten med varierande pH vid rumstemperatur visade framgångsrik hydrolys av komplexet sker under pH-betingelser som sträcker sig från 4,5 till 7,5. Detta visar flexibiliteten av EDTA hydrolys; pH-värdet kan ökas till står för fler syrakänslig sidokedjeskyddande grupper.
| Skick | pH av EDTA-lösning | övernattning Slutförande | |
| 1 | 0 | 4,5 | Ingen |
| 2 | 2 | 4,5 | Partiell |
| 3 | 4 | 4,5 | Partiell |
| 4 | 6 | 4,5 | Partiell |
| 5 | 8 | 4,5 | Full |
| 6 | 10 | 4,5 | Full |
| 7 | 12 | 4,5 | Full |
| 8 | 12 | 5,0 | Full |
| 9 | 12 | 5,5 | Full |
| 10 | 12 | 6,0 | Full |
| 11 | 12 | 6,5 | Full |
| 12 | 12 | 7,0 | Full |
| 13 | 12 | 7,5 | Full |
| 14 | 12 | 8,0 | Partiell |
Tabell 1: Ni-PBP-Gly hydrolysbetingelser.
Att verifiera att hydrolysen var fullbordad med användning av den mest effektiva tillstånd, 7, vi extraherade reaktionen tre gånger med diklormetan, kombinerades och torkades de organiska skikten och analyserades den resulterande återstoden med hjälp av kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR). NMR-spektrum visade inga tecken på Ni-PBP-Gly i provet; de enda resonanser finns i spektrum stämde överens med litteraturrapporter av PBP, vilket tyder på fullständig hydrolys av komplexet.
Vi undersökte möjligheten att våra optimala hydrolysbetingelser med aminosyror innehållering ett intervall av sidokedjeskyddande grupper. Prover av Fmoc-L-glutaminsyra 5-tert-butyl-ester (Fmoc-Glu (tBu) -OH), Fmoc-O - tert-butyl-L-treonin (Fmoc-Thr (tBu) -OH), Fmoc - O - tert-butyl-L-tyrosin (Fmoc-Tyr (^ Bu) -OH), och N (i) Boc-N α-Fmoc-L-tryptofan (Fmoc-Trp (Boc) -OH) löstes i DMF och underkastades hydrolys vid rumstemperatur med användning av 12 ekvivalenter av EDTA vid pH 4,5. Efter att ha fått stå under omröring över natten, var lösningarna extraherades med diklormetan och analyserades med NMR. Ett representativt NMR ingår för Fmoc-Glu (tBu) -OH (Figur 3). I varje fall, spektraldata visade fullständig retention av sidokedjeskyddande grupper. 11, 12, 13
Figur 3: Representant NMR av en Fmoc-monomer Bearing en syralabil sidokedjeskyddande gruppen efter utsättande för hydrolysbetingelser.
Den syralabila sidokedjeskyddande grupp är markerad med en blå låda. Avrundade värden för integration av protonsignalerna för denna förening ingår inom parentes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter hydrolys och organisk extraktion, innehåller det återstående vattenhaltiga skiktet den fria aminosyran tillsammans med kvarvarande EDTA och Ni 2+ joner. För att säkerställa att närvaron av dessa ämnen inte skulle interferera med efterföljande Fmoc skydd av den fria aminosyran, utförde vi en testreaktion genom upplösning av glycin i en vattenhaltig lösning innehållande EDTA och Ni 2 + -joner med koncentrationer liknande hydrolys inträde 7. We utsattes därefter denna lösning till en vattenhaltig standard Fmoc-skydd. 8 Efter reaktionens fullbordan och upparbetnings bestämde vi reaktionen gav ett 25% utbyte av Fmoc-skyddad glycin. Denna procent utbyte är inte förvånande med tanke på den utspädda koncentrationen av reaktionen och föreslår att närvaron av Ni2 + -joner och EDTA inte interfererar med en standard Fmoc skyddsreaktionen.
Med bevis som stöder att varje individuell komponent i vår metodik (hydrolys, isolering av fri aminosyra och Fmoc skydd) är genomförbart, utförde vi ett proof-of-concept experiment med användning av Ni-PBP-Gly. Vi bedömt viabiliteten av de hydrolysbetingelser som beskrivits ovan och efterföljande Fmoc-skyddning med användning av ett standardprotokoll 8 till bildning av en Fmoc-skyddad aminosyra i rimlig utbyte. Till en omrörd lösning av Ni-PBP-Gly (404 mg, 0,971 mmol, 1 ekv) i 40 ml DMF vid rumstemperaturerature sattes 0,2 M EDTA-lösning vid pH 4,5 (65 ml, 13 mmol, 13 ekv). Reaktionen tilläts att omröras över natten och tvättades sedan fyra gånger med diklormetan. Det vattenhaltiga skiktet justerades därefter till pH 7 med användning av fast natriumbikarbonat. Till vattenskiktet sattes natriumbikarbonat (163 mg, 1,93 mmol, 2 ekv) och Fmoc-OSu (327 mg, 0,971 mmol, 1 ekv) upplöstes i en minimal mängd av dioxan. Reaktionen tilläts att omröras över natten och surgjordes sedan med 1 M saltsyra och extraherades tre gånger med etylacetat. De organiska extrakten kombinerades, tvättades sex gånger med saltlösning, koncentrerades, torkades med magnesiumsulfat, och torkades under vakuum för att ge en blandning av oreagerad Fmoc-OSu och Fmoc-Gly-OH (160 mg, 0,540 mmol, 54% utbyte). Spektraldata matchad tidigare publicerats spektra för Fmoc-Gly-OH. 9 Denna slutliga experiment indikerar att det är möjligt att isolera fritt glycin från Ni-PBP-Gly komplex och föra den framåt till dess Fmoc-protected form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som beskrivits ovan är användbar i dess förmåga att underlätta isoleringen av en aminosyrahuvudkedja från en Ni-Schiff-bas-komplex under milda pH-betingelser och efterföljande Fmoc-skyddning av denna isolerade aminosyra genom två kritiska steg. Det första steget involverar att omröring en lösning DMF / vatten innehållande EDTA för att underlätta frigöring av aminosyran från komplexet. Rest komplexa eller organiska biprodukter kan lätt tas bort med extraktion. Det andra steget av detta protokoll involverar en Fmoc skydd av aminosyra som finns i det vattenhaltiga skiktet efter isolering genom extraktion i det första steget. Vi har visat förmåga att modifiera denna procedur i ett pH-område av 4,5-7,5, vilket tillåter betydande flexibilitet som kan vara nödvändigt för vissa pH-känsliga sidokedjeskyddande grupper.
En potentiell begränsning av denna teknik är den låga reaktionskoncentration av Fmoc-skydds av den isolerade aminosyran. Underlätta efficient hydrolys kräver flera ekvivalenter av EDTA i förhållande till substrat, reaktionsbetingelserna kräver en betydande mängd vattenhaltig EDTA-lösning (60 ml för en 1 mmol skala reaktion). Med användning av denna volym av lösningsmedlet i en FMOC resultat av skydd inom en relativt låg (~ 0,015 M) koncentration av reagens. Medan ett proof-of-concept reaktion med användning av dessa betingelser gav en produkt i en lovande 55% utbyte trots de utspädda reaktionsbetingelserna, kan det vara nödvändigt att öka denna koncentration vid användning av aminosyror med reducerad nucleophilicty relativt glycin följd av ökad sterisk bulk.
Sammanfattningsvis har vi visat användbarheten av EDTA för att främja hydrolys av en Ni-Schiff-bas-komplex som typiskt används för syntes av UAA s. Dessa hydrolysbetingelser kräver inte den starkt sura betingelser typiska för dessa hydrolyser, vilket möjliggör bibehållande av syra-labila sidokedjeskyddande grupper. Framtida experiment bör fokusera på att tillämpa thans allmänna strategin till en mängd av onaturliga aminosyrasubstrat. Arbetet mot detta pågår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Finansiering av Slippery Rock University. Vi vill tacka T. Boron III (Slippery Rock University) och C. Haney (University of Pennsylvania) för sina insikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
- Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic α,β-diamino acids. J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).
- Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear ω,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine. J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).
- Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-β,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles. Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).
- Belokon, Y. N. Highly efficient catalytic synthesis of α,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).
- Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate. J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).
- Belokon, Y. N. Synthesis of α,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases. J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).
- Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine. Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).
- Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries. Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).
- Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. "One-pot", preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide. Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).
- Hart, J. R. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2000).
- Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine. J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).
- Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes. Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).
- Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of α,-peptide-β,-peptoid chimeras. Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).
