Summary
هنا، نقدم والتحلل كفاءة وحماية FMOC اللاحقة من الأحماض الأمينية معزولة عن مجمع ني شيف قاعدة. شروط التحلل المقدمة هنا هي مناسبة للاستخدام عند الحاجة الاحتفاظ مجموعات حماية حمض عطوب جنبا إلى سلسلة. قد تكون هذه التقنية قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من ركائز الأحماض الأمينية غير طبيعية.
Abstract
الأحماض الأمينية غير طبيعية، والأحماض الأمينية التي تحتوي على وظائف جنبا إلى سلسلة لا ينظر عادة في الطبيعة، تم العثور على نحو متزايد في تسلسل الببتيد الاصطناعية. تركيب بعض الأحماض الأمينية غير طبيعية وغالبا ما تتضمن استخدام السلائف تتألف من شيف قاعدة استقرت كاتيون النيكل. يمكن تثبيت غير طبيعية جنبا إلى سلاسل على العمود الفقري الأحماض الأمينية الموجودة في هذا المجمع شيف قاعدة. الناتجة من الأحماض الأمينية غير طبيعي ويمكن بعد ذلك تكون معزولة عن ذلك باستخدام التحلل المعقد للشيف قاعدة، وعادة عن طريق استخدام الجزر في المحاليل الحمضية بقوة. هذه الظروف الحمضية للغاية قد يزيل حمض عطوب جانب سلسلة حماية الفئات اللازمة لالأحماض الأمينية غير طبيعية لاستخدامها في الحالة الصلبة الببتيد التوليف بمساعدة الميكروويف. في هذا العمل، ونحن تقديم والتحلل كفاءة وحماية FMOC اللاحقة من الأحماض الأمينية معزولة عن مجمع قاعدة ني شيف. شروط التحلل الواردة في هذا العمل هي مناسبة لاستبقاء الصورة حمض عطوببيئة تطوير متكاملة سلسلة حماية الفئات ويمكن أن تكون قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من ركائز الأحماض الأمينية غير طبيعية.
Introduction
وقد وجدت الأحماض الأمينية غير طبيعية السلاسل الجانبية تحمل (UAA) والتي تختلف عن تلك التي والعشرين التي تحدث بشكل طبيعي الأحماض الأمينية الموجودة في الطبيعة فائدة في مجموعة واسعة من التطبيقات. توليف هذه لUAA، ومع ذلك، يمكن أن يكون صعبا اعتمادا على هيكل سلاسل الجانبية والفراغية من العمود الفقري من الأحماض الأمينية. وقد استخدم تفعيل تش بوند من الجلايسين في سياق النيكل مجمع شيف قاعدة لإنتاج مجموعة متنوعة من مشتقات الأحماض الأمينية بما في ذلك α، β-diamino الأحماض 1 وتحمل UAA في المفلورة 2 أو الحلقية غير المتجانسة سلاسل الجانب. 3
بعد إضافة غير طبيعية الجانب سلاسل، functionalized عادة تتم إزالة لUAA من مجمع شيف قاعدة من الجزر في حمض الهيدروكلوريك (4) ويتم عزل في وقت لاحق باستخدام التبادل الأيوني اللوني. في حين كفاءة عموما، هذا البروتوكول يولدالأحماض مينو التي قد تكون غير صالحة للاستخدام في الحالة الصلبة الببتيد التوليف (SPPS). طبيعة SPPS يتطلب وجود جماعات حمض عطوب جانب سلسلة حماية والطبيعة الحمضية بقوة من الظروف ني شيف قاعدة التحلل النموذجية يمنع عزل في UAA مع هذه الجماعات حماية سليمة. على حد علمنا، تم الإبلاغ عن واحد فقط طريقة التحلل البديل: استخدام ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) والهيدرازين في درجات حرارة مرتفعة، 5 الشروط التي أنفسهم قد لا تكون مناسبة لبعض جنبا إلى سلسلة تحمي جماعات مثل phthalimides.
الشكل 1: توليف ني PBP-الغليسين من ني 2+، PBP، وجليكاين (الغليسين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. و>
هنا، ونحن التقرير وسيلة لالتحلل من مجمع ني شيف قاعدة، ني PBP-الغليسين (الشكل 1). وقد تجلى هذا المجمع، والمستمدة من ني 2+، الجلايسين، والبيريدين-2-متيل حمض (2-بيروكسايد-فينيل) -amide (PBP) (6)، لتكون منبرا مفيدا لتوليف مجموعة متنوعة من وUAA وبسهولة يمكن الوصول إليها باستخدام طريق الاصطناعية من خطوتين. 7 توليف هذا المجمع هو في ارتفاع العائد سوابق أدب. 6 نتائجنا الموضحة أدناه توضح مدى انطباق شروط التحلل استخدام EDTA في حموضة أقل ما يقال لظروف الأس الهيدروجيني محايدة مناسبة للاستخدام مع تأثير حمض عطوب جانب سلسلة UAA لحماية الفئات. وبعد التحلل، ومحلول مائي الناتجة يمكن عزل ويتعرضون على الفور لشروط الحماية FMOC القياسية لتحمل الأحماض الأمينية FMOC المحمية (الشكل 2).
س: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 2: التحلل وFMOC الحماية من الأحماض الأمينية المعزولة من ني PBP-الغليسين. شروط التفاعل: ط. EDTA (12 م equiv)، ودرجة الحموضة 4.5. ثانيا. إيثيل غسل خلات والتكيف مع درجة الحموضة 7؛ ثالثا. FMOC-جامعة ولاية أوهايو (1 EQUIV)، NaHCO 3 (2 EQUIV). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التحلل من مجمع ني شيف-قاعدة
- حل 1 مليمول مجمع ني PBP شيف القاعدي في 40 مل من N، N -dimethylformamide (DMF) مع التحريك في 250 مل قارورة أسفل جولة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 60 مل من 0.2 M حل EDTA مائي، ودرجة الحموضة 4.5.
- باستخدام شريط مغناطيسي ويقلب لوحة، وإثارة الحل الجمع بين ليلة وضحاها. كما تحلل مجمع شيف قاعدة، ولون التحول من أحمر عميق إلى الأبيض.
- بعد الانتهاء من رد فعل كما يدل على ذلك عدم وجود أي اللون الأحمر، ونقل رد فعل على قمع فصل 250 مل.
- إضافة 50 مل ثنائي كلورو ميثان، حدا لقمع فصل، وتخلط. استنزاف غسل العضوية في كوب من النفايات. كرر هذه العملية ثلاث مرات لإزالة PBP وأي مجمع ني PBP شيف قاعدة المتبقية. جمع طبقة مائية المتبقية في 250 مل جولة أسفل القارورة.
2. حماية FMOC من تحلل الأحماض الأمينية
- إضافة 168 ملغ بيكربونات الصوديوم (2.00 ملمول، 2 م equiv) إلى حل ويحرك باستخدام شريط مغناطيسي ويقلب لوحة.
- حل 337 ملغ FMOC N -hydroxysuccinimide استر (1.00 ملمول، 1 م equiv) في الحد الأدنى من ديوكسان (حوالي 4 أو 5 مل) في قارورة 10 مل. نقل هذا الحل إلى محلول مائي ويقلب بين عشية وضحاها.
- بعد السماح للرد فعل لإثارة بين عشية وضحاها، يحمض المحلول الناتج لدرجة الحموضة 2 مع 1 M حمض الهيدروكلوريك. تحقق درجة الحموضة بشكل دوري باستخدام شرائط اختبار درجة الحموضة.
- نقل رد فعل على قمع فصل 250 مل وإضافة 50 مل خلات الإيثيل. يضع حدا لقمع فصل، وتخلط جيدا، وجمع طبقة العضوية في قارورة مخروطي سعة 250 مل. كرر هذه العملية مرتين إضافية، والجمع بين مقتطفات العضوية. تجفيف مقتطفات العضوية جنبا إلى جنب مع ما يقرب من 3 غرام من المغنيسيوم sulfatه.
- تركيز مقتطفات العضوية جنبا إلى جنب باستخدام المبخر الدوار على تحمل الخام الأحماض الأمينية FMOC المحمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
افترضنا أن إزالة ني 2+ من مجمع ني PBP-الغليسين يمكن أن تسمح لالتحلل المائي الفعال للشيف قاعدة دون الحاجة لظروف الأس الهيدروجيني قاسية. كما EDTA هو عامل خالب غير مكلفة ومدروسة، 10 افترضنا أن إضافة EDTA إلى حل ني PBP-الغليسين من شأنه أن يسهل عملية إزالة معدن ثقيل ني 2+ الأيونات، وبالتالي تعزيز التحلل من المجمع.
لنختبر نظريتنا بأن EDTA وحدها يمكن تعزيز فعالية التحلل من المجمع، وأخضعنا حل ني PBP-الغليسين في DMF في درجة حرارة الغرفة لزيادة حكمه من EDTA في درجة الحموضة 4.5 محلول مائي، ودرجة الحموضة غير المعدلة من EDTA مائي حل ثنائي الصوديوم الملح . التقدم من رد فعل التحلل يمكن رصدها من قبل مراقبة لون المحلول. غير المتفاعل ني PBP-الغليسين في حل يعرض لون أحمر عميق بينما معزولة PBPمن هذا المجمع هو الأبيض. نحن تتبع التقدم من رد فعل التحلل من خلال رصد تغير لون الحل من الأحمر إلى الأبيض (الجدول 1). وأظهرت ردود الفعل التي تنطوي على أقل من ثمانية في حكمه بعض الانتقال من التلوين من الأحمر إلى الأبيض، ولكن كان رد الفعل الناقص في كل حالة. وكان أي تغيير اللون واضح للشروط دون EDTA.
وجرى تقييم مماثل تأثير درجة الحموضة في التحلل. أظهر الخضوع للمجمع ني PBP-الغليسين لظروف التحلل المائي باستخدام 12 يعادله من EDTA بين عشية وضحاها مع اختلاف درجة الحموضة في درجة حرارة الغرفة التحلل الناجح لمجمع يحدث في ظل ظروف درجة الحموضة تتراوح 4،5-7،5. وهذا يدل على مرونة EDTA التحلل. درجة الحموضة ويمكن زيادة لحساب أكثر من مجموعات حماية حمض حساسة جنبا إلى سلسلة.
| شرط | درجة الحموضة من EDTA الحل | إكمال بين عشية وضحاها | |
| 1 | 0 | 4.5 | لا شيء |
| 2 | 2 | 4.5 | جزئي |
| 3 | 4 | 4.5 | جزئي |
| 4 | 6 | 4.5 | جزئي |
| 5 | 8 | 4.5 | ممتلئ |
| 6 | 10 | 4.5 | ممتلئ |
| 7 | 12 | 4.5 | ممتلئ |
| 8 | 12 | 5.0 | ممتلئ |
| 9 | 12 | 5.5 | ممتلئ |
| 10 | 12 | 6.0 | ممتلئ |
| 11 | 12 | 6.5 | ممتلئ |
| 12 | 12 | 7.0 | ممتلئ |
| 13 | 12 | 7.5 | ممتلئ |
| 14 | 12 | ثمانية | جزئي |
الجدول 1: ني PBP-الغليسين التحلل الشروط.
للتحقق من كان أن التحلل الكامل باستخدام الشرط الأكثر كفاءة، 7، استخرجنا رد فعل ثلاث مرات مع ثنائي كلورو ميثان، جنبا إلى جنب والمجففة طبقات العضوية وتحليل المخلفات الناتجة باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR). أظهر الطيف NMR أي دليل على ني PBP-الغليسين في العينة. الأصداء الوحيدة التي وجدت في الطيف الملائمة تقارير أدب PBP، مما يدل على التحلل الكامل للمجمع.
درسنا جدوى ظروفنا المائي الأمثل مع الأحماض الأمينية تحتوي علىجي مجموعة من جماعات حماية جانبية السلسلة. عينات من FMOC-L-الغلوتاميك حمض 5- ثالثي -butyl استر (FMOC-غلو (ر بو) -OH)، Fmoc- O - ثالثي -butyl-L-ثريونين (FMOC-منتدى المجالس الرومانسية (ر بو) -OH)، FMOC - O - ثالثي -butyl-L-التيروزين (FMOC في صور (ر بو) -OH)، وN (في) -Boc- N α -Fmoc-L-تريبتوفان (FMOC-التربتوفان (بوك) -OH) حلت في DMF وتعرض لالمائي في درجة حرارة الغرفة باستخدام 12 يعادله من EDTA في درجة الحموضة 4.5. بعد السماح لاثارة بين عشية وضحاها، تم استخراج الحلول مع ثنائي كلورو ميثان وتحليلها بواسطة NMR. يتم تضمين NMR تمثيلية للFMOC-غلو (TBU) -OH (الشكل 3). في كل حالة، أظهرت بيانات طيفية الاحتفاظ الكامل للجماعات حماية جانبية السلسلة. 11، 12، 13
وسلط الضوء على مجموعة حماية الجانب سلسلة حمض عطوب مع الصندوق الأزرق. تدرج قيم التكامل مدورة للإشارات البروتون من هذا المركب بين قوسين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
بعد التحلل واستخراج العضوية، وطبقة المائية المتبقية تحتوي على الأحماض الأمينية الحرة مع EDTA المتبقية وأيونات النيكل 2+. للتأكد من وجود هذه المواد لن تتداخل مع حماية FMOC لاحقة من الأحماض الأمينية الحرة، أجرينا رد فعل اختبار عن طريق إذابة الجلايسين في المحاليل المائية التي تحتوي على EDTA والنيكل 2+ أيونات مع تركيزات مماثلة لدخول التحلل 7. Wه ثم يتعرض هذا الحل لمعيار حماية FMOC المائية. 8 بعد الانتهاء رد فعل وعمل المتابعة، توصلنا إلى رد فعل الممنوحة العائد 25٪ من الجلايسين FMOC المحمية. هذا العائد في المئة ليس من المستغرب النظر في تركيز مخفف من التفاعل وتشير إلى أن وجود ني 2+ الأيونات وEDTA لا تتداخل مع معيار رد الفعل حماية FMOC.
مع الأدلة الداعمة أن كل فرد من عناصر منهجية لدينا (التحلل المائي وعزل الأحماض الأمينية الحرة، وحماية FMOC) هو ممكن عمليا، أجرينا تجربة إثبات صحة مفهوم استخدام ني PBP-الغليسين. قمنا بتقييم الجدوى الشروط التحلل المذكورة أعلاه وحماية FMOC اللاحقة باستخدام بروتوكول قياسي 8 إلى تحمل من الأحماض الأمينية FMOC المحمية في العائد المعقول. إلى حل أثار من ني PBP-الغليسين (404 ملغ، 0.971 مليمول، 1 م equiv) في 40 مل DMF في درجة حرارة الغرفةتمت إضافة erature 0.2 M حل EDTA في درجة الحموضة 4.5 (65 مل، 13 ملمول، 13 م equiv). سمح للرد فعل لاثارة بين عشية وضحاها ومن ثم غسلها أربع مرات مع ثنائي كلورو ميثان. ثم تم تعديل طبقة المائية لدرجة الحموضة 7 باستخدام بيكربونات الصوديوم الصلبة. لبيكربونات تم إضافة طبقة المائية الصوديوم (163 ملغ، 1.93 مليمول، 2 م equiv) وFMOC-جامعة ولاية أوهايو (327 ملغ، 0.971 مليمول، 1 م equiv) الذائب في الحد الأدنى من ديوكسان. سمح للرد فعل لإثارة المحمضة بين عشية وضحاها وبعد ذلك مع 1 M حمض الهيدروكلوريك واستخراج ثلاث مرات مع خلات الإيثيل. تم الجمع بين مقتطفات العضوية، وغسلها ست مرات مع الماء المالح، ركز، المجففة مع كبريتات المغنيسيوم، وتجفيفها في ظل فراغ على تحمل مزيجا من غير المتفاعل FMOC-جامعة ولاية أوهايو وFMOC-الغليسين-OH (160 ملغ، 0.540 مليمول، العائد 54٪). البيانات الطيفية المتطابقة التي تنطبق الأطياف لFMOC-الغليسين-OH. 9 وتشير هذه التجربة النهائية التي كان من الممكن لعزل الجلايسين خالية من ني-PBP-الغليسين معقدة ودفعها إلى الأمام لفي FMOC بروتشكل ECTED.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول الموصوفة أعلاه هو مفيد في قدرته على تسهيل العزلة من العمود الفقري من الأحماض الأمينية من مجمع ني شيف قاعدة تحت ظروف الأس الهيدروجيني خفيفة وحماية FMOC لاحقة من هذه الأحماض الأمينية معزولة من خلال اثنين من الخطوات الحاسمة. الخطوة الأولى تنطوي على إثارة حل DMF / المياه التي تحتوي على EDTA لتسهيل الإفراج عن الأحماض الأمينية من المجمع. يمكن بسهولة المشتقات المعقدة أو العضوية المتبقية يمكن إزالتها مع الاستخراج. الخطوة الثانية من هذا البروتوكول تنطوي على حماية FMOC من الأحماض الأمينية الموجودة في الطبقة المائية بعد العزلة التي كتبها استخراج في الخطوة الأولى. لقد أثبتت القدرة على تعديل هذا الإجراء في مجموعة ودرجة الحموضة من 4،5-7،5، مما يتيح مرونة كبيرة التي قد تكون ضرورية لحماية بعض الفئات الحساسة للدرجة الحموضة جنبا إلى سلسلة.
واحد الحد المحتمل لهذه التقنية هو انخفاض تركيز رد فعل حماية FMOC من الأحماض الأمينية معزولة. عن تسهيل هيتطلب التحلل fficient عدة مكافئات من EDTA نسبة إلى الركيزة، وظروف التفاعل تتطلب قدرا مائي حل EDTA كبير (60 مل لرد فعل 1 مليمول النطاق). باستخدام هذا الحجم من المذيب في النتائج حماية FMOC في منخفض نسبيا (~ 0.015 M) تركيز المواد الكيميائية. في حين أن رد فعل إثبات صحة مفهوم يستخدم هذه الشروط الممنوحة المنتج في اعد العائد 55٪ على الرغم من الظروف المخففة رد فعل، فإنه قد يكون من الضروري زيادة هذا التركيز عند استخدام الأحماض الأمينية مع انخفاض nucleophilicty نسبة إلى الجلايسين الناتجة عن زيادة الأكبر الفراغية.
وباختصار، لقد أثبتنا فائدة EDTA لتعزيز التحلل من مجمع قاعدة ني شيف تستخدم عادة لتوليف وUAA. هذه الشروط التحلل لا تتطلب حالة الحمضية بقوة نموذجية لهذه مائيا، مما يسمح للاحتفاظ الجماعات حمض عطوب جانب سلسلة حماية. ينبغي أن تركز التجارب المستقبلية على تطبيق راستراتيجيته العامة لمجموعة متنوعة من ركائز الأحماض الأمينية غير طبيعية. العمل لتحقيق هذه الغاية لا تزال مستمرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
بتمويل من جامعة زلق الصخرة. ونود أن نشكر T. البورون III (جامعة زلق روك) وC. هاني (جامعة بنسلفانيا) عن وجهات نظرهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
- Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic α,β-diamino acids. J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).
- Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear ω,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine. J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).
- Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-β,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles. Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).
- Belokon, Y. N. Highly efficient catalytic synthesis of α,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).
- Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate. J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).
- Belokon, Y. N. Synthesis of α,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases. J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).
- Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine. Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).
- Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries. Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).
- Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. "One-pot", preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide. Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).
- Hart, J. R. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2000).
- Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine. J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).
- Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes. Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).
- Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of α,-peptide-β,-peptoid chimeras. Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).
