Summary
A continuación, presentamos una hidrólisis eficiente y la posterior protección Fmoc de un aminoácido aislado a partir de un complejo de Ni-Schiff-base. condiciones de hidrólisis se presentan aquí son adecuados para su uso cuando se requiere retención de los grupos protectores de la cadena lateral lábil en medio ácido. Esta técnica puede ser adaptable a una variedad de sustratos de aminoácidos no naturales.
Abstract
Los aminoácidos no naturales, aminoácidos que contienen funcionalidades de la cadena lateral no se ven comúnmente en la naturaleza, se encuentran cada vez más en las secuencias de péptidos sintéticos. Síntesis de algunos aminoácidos no naturales a menudo incluye el uso de un precursor que consiste en una base de Schiff estabilizado por un catión de níquel. Unnatural cadenas laterales se pueden instalar en una cadena principal de aminoácido que se encuentra en este complejo Schiff-base. El aminoácido no natural resultante puede ser aislado de este complejo utilizando la hidrólisis de la base de Schiff, típicamente mediante el empleo de reflujo en solución fuertemente ácida. Estas condiciones altamente ácidas pueden eliminar el ácido lábil cadena lateral de los grupos protectores necesarios para los aminoácidos no naturales a ser utilizados en la síntesis de péptidos en fase sólida con ayuda de microondas. En este trabajo, se presenta una hidrólisis eficaz y posterior protección Fmoc de un aminoácido aislado de un complejo de base Ni-Schiff. condiciones de hidrólisis se presentan en este trabajo son adecuados para la retención de s lábiles en medio ácidoDe cadena ide grupos protectores y puede ser adaptable a una variedad de sustratos de aminoácidos no naturales.
Introduction
Los aminoácidos no naturales cadenas laterales de apoyo (de SAU) que varían de los de los veinte aminoácidos de origen natural encontrados en la naturaleza han encontrado utilidad en una amplia gama de aplicaciones. La síntesis de estos de UAA, sin embargo, puede ser difícil dependiendo de la estructura de las cadenas laterales y la estereoquímica de la cadena principal de aminoácidos. CH activación de la unión de la glicina en el contexto de un complejo de base de Schiff de níquel se ha usado para producir una variedad de derivados de aminoácidos incluyendo α, ácidos 1 ß-diamino y el cojinete de UAA fluorado 2 o heterocíclicos cadenas laterales. 3
Después de la adición de no naturales cadenas laterales, funcionalizado UAA de se eliminan típicamente del complejo de base de Schiff por el reflujo en ácido clorhídrico 4 y están aislados posteriormente utilizando cromatografía de intercambio iónico. Aunque generalmente eficaz, este protocolo genera unaácidos mino que pueden ser inadecuados para el uso en la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). La naturaleza de SPPS requiere la presencia de grupos de ácido lábil proteger la cadena lateral y la naturaleza fuertemente ácida de condiciones típicas de descomposición Ni-Schiff-base evita el aislamiento de UAA de con estos grupos protectores intactos. Para nuestro conocimiento, se ha informado sólo un método de descomposición alternativa: uso de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) e hidrazina a temperaturas elevadas, 5 condiciones que en sí mismos pueden no ser adecuado para algunos protectores de cadena lateral grupos tales como ftalimidas.
Figura 1: Síntesis de Ni-PBP-Gly de Ni2 +, PBP, y glicina (Gly). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Aquí, se presenta un método para la hidrólisis de un complejo de Ni-Schiff-base, Ni-PBP-Gly (Figura 1). Este complejo, derivado de Ni2 +, glicina y 2 piridina-carboxílico (2-benzoil-fenil) -amida del ácido (PBP), 6 se ha demostrado ser una plataforma útil para la síntesis de una variedad de UAA de y es de fácil accesibles mediante una ruta sintética de dos pasos. 7 Síntesis de este complejo es la literatura-precedentes de alto rendimiento. 6 Nuestros resultados descritos a continuación demuestran la aplicabilidad de condiciones de hidrólisis utilizando EDTA a ligeramente ácido a condiciones de pH neutro apropiados para su uso con el cojinete lábil en medio ácido cadena lateral de UAA grupos protectores. Después de la hidrólisis, la solución acuosa resultante puede ser aislado y sometido inmediatamente a las condiciones de protección de Fmoc estándar para producir un aminoácido protegido con Fmoc (Figura 2).
Figura 2: La hidrólisis y Fmoc-protección de un aminoácido Aislado de Ni-PBP-Gly. Condiciones de reacción: i. EDTA (12 equiv), pH 4,5; ii. Etil lavado de etilo y ajuste a pH 7; iii. Fmoc-OSu (1 equiv), NaHCO3 (2 equiv). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
1. La hidrólisis del complejo Ni-Schiff-Base
- Disolver 1 mmol del complejo de Ni-PBP-Schiff-base en 40 ml de N, N-dimetilformamida (DMF) con agitación en un matraz de 250 ml de fondo redondo a temperatura ambiente.
- Añadir 60 ml de solución acuosa de EDTA 0,2 M, pH 4,5.
- Usando una barra de agitación magnética y placa de agitación, se agita la solución combinada durante la noche. Como se hidroliza el complejo de base de Schiff, el color cambiará de un color rojo oscuro a blanco.
- Después de la terminación de la reacción, como se indica por la ausencia de cualquier colorante rojo, la transferencia de la reacción a un embudo de separación de 250 ml.
- Añadir 50 ml de diclorometano, la tapa del embudo de separación, y mezclar. Escurrir el lavado orgánico en un vaso de precipitados de residuos. Repita este proceso tres veces para eliminar PBP y cualquier complejo de Ni-PBP-Schiff-base residual. Se recoge la capa acuosa restante en un matraz de fondo redondo de 250 mL.
2. Protección Fmoc de Hidrolizado de Aminoácidos
- Añadir 168 mg de bicarbonato de sodio (2,00 mmol, 2 equiv) a la solución y se agita usando una barra de agitación magnética y placa de agitación.
- Disolver 337 éster de hidroxisuccinimida Fmoc N mg (1,00 mmol, 1 equiv) en una cantidad mínima de dioxano (aproximadamente 4 o 5 ml) en un vial de 10 mL. Transfiera esta solución a la solución acuosa y se agita durante la noche.
- Después de dejar que la reacción en agitación durante la noche, se acidifica la solución resultante a pH 2 con ácido clorhídrico 1 M. Verificar el pH periódicamente utilizando tiras de prueba de pH.
- La transferencia de la reacción a un embudo de separación de 250 ml y añadir 50 ml de acetato de etilo. Se tapa el embudo de decantación, se mezcla bien, y recoger la capa orgánica en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Repetir este proceso dos veces más, la combinación de los extractos orgánicos. Se secan los extractos orgánicos combinados con aproximadamente 3 g de Sulfat magnesiomi.
- Se concentran los extractos orgánicos combinados usando un evaporador rotatorio para dar el crudo aminoácido protegido con Fmoc.
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Representative Results
La hipótesis de que la retirada de la Ni 2+ desde el complejo de Ni-PBP-Gly podría permitir una hidrólisis acuosa eficiente de la base de Schiff sin la necesidad de condiciones de pH severas. Como EDTA es un agente quelante de bajo costo y bien estudiado, 10 La hipótesis de que la adición de EDTA a una solución de Ni-PBP-Gly facilitaría la quelación de iones Ni2 +, promoviendo así la hidrólisis del complejo.
Para probar nuestra teoría de que EDTA por sí sola podría promover eficazmente la hidrólisis del complejo, hemos sometido una solución de Ni-PBP-Gly en DMF a temperatura ambiente para aumentar equivalentes de EDTA en pH 4,5 solución acuosa, el pH sin ajustar de la solución de sal disódica de EDTA acuosa . El progreso de la reacción de hidrólisis se puede controlar por el observando el color de la solución; sin reaccionar Ni-PBP-Gly en solución muestra un color rojo profundo mientras PBP aisladode este complejo es de color blanco. Tenemos un seguimiento del progreso de la reacción de hidrólisis mediante la supervisión del cambio de color de la solución de rojo a blanco (Tabla 1). Las reacciones que implican menos de ocho equivalentes mostraron alguna transición de la coloración de rojo a blanco, pero la reacción fue incompleta en cada caso. No cambio de color fue evidente para condiciones sin EDTA.
Se evaluó de manera similar el efecto del pH en la hidrólisis. La sujeción del complejo de Ni-PBP-Gly a condiciones de hidrólisis utilizando 12 equivalentes de EDTA durante la noche con diferentes pH a temperatura ambiente mostró hidrólisis exitosa del complejo se produce en condiciones de pH que varían de 4,5 a 7,5. Esto demuestra la flexibilidad de EDTA hidrólisis; pH puede aumentarse para tener en cuenta más grupos protectores de cadena lateral sensibles a los ácidos.
| Condición | pH de la solución de EDTA | Finalización noche a la mañana | |
| 1 | 0 | 4.5 | Ninguna |
| 2 | 2 | 4.5 | Parcial |
| 3 | 4 | 4.5 | Parcial |
| 4 | 6 | 4.5 | Parcial |
| 5 | 8 | 4.5 | Completo |
| 6 | 10 | 4.5 | Completo |
| 7 | 12 | 4.5 | Completo |
| 8 | 12 | 5.0 | Completo |
| 9 | 12 | 5.5 | Completo |
| 10 | 12 | 6.0 | Completo |
| 11 | 12 | 6.5 | Completo |
| 12 | 12 | 7.0 | Completo |
| 13 | 12 | 7.5 | Completo |
| 14 | 12 | 8.0 | Parcial |
Tabla 1: Ni-PBP-Gly hidrólisis Condiciones.
Para verificar que la hidrólisis fue completa usando la condición más eficiente, 7, se extrajo la reacción tres veces con diclorometano, se combinaron y se secaron las capas orgánicas y se analizaron el residuo resultante usando espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). El espectro de RMN no mostró evidencia de Ni-PBP-Gly en la muestra; los únicos resonancias que se encuentran en el espectro emparejados informes de la literatura de PBP, lo que sugiere la hidrólisis completa del complejo.
Se examinó la viabilidad de nuestras condiciones óptimas de hidrólisis con aminoácidos contieneing una gama de grupos protectores de la cadena lateral. Las muestras de Fmoc-L-glutámico ácido 5- éster terc-butílico (Fmoc-Glu (t Bu) -OH), Fmoc- O - terc -butil-L-treonina (Fmoc-Thr (t Bu) -OH), Fmoc - O - terc -butil-L-tirosina (Fmoc-Tyr (t Bu) -OH), y N (en) Boc- N α-Fmoc-L-triptófano (Fmoc-Trp (Boc) -OH) se disolvieron en DMF y se sometió a la hidrólisis a temperatura ambiente usando 12 equivalentes de EDTA a pH 4,5. Después de dejar en agitación durante la noche, las soluciones se extrajo con diclorometano y se analizaron por RMN. A RMN representante está incluido para-Glu Fmoc -OH (tBu) (Figura 3). En cada caso, los datos espectrales mostraron retención completa de los grupos protectores de la cadena lateral. 11, 12, 13
Figura 3: Representante de RMN de una Fmoc-monómero que lleva un ácido lábil protectores de cadena lateral de grupo después de sometimiento a la hidrólisis Condiciones.
El grupo protector de la cadena lateral lábil en medio ácido se pone de relieve con una caja azul. valores de integración redondeados para las señales de protones de este compuesto se incluyen entre paréntesis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Después de la hidrólisis y la extracción orgánica, la capa acuosa restante contiene el aminoácido libre junto con EDTA residual y los iones de Ni 2+. Para asegurarse de que la presencia de estas sustancias no interferiría con protección Fmoc subsiguiente del aminoácido libre, se realizó una reacción de ensayo por disolución de glicina en un soluciones acuosas que contienen iones de EDTA y Ni 2+ con concentraciones similares a la entrada hidrólisis 7. We luego se sometió esta solución a una protección acuosa estándar Fmoc. 8 Después de terminación de la reacción y el trabajo en marcha, se determinó la reacción proporcionó un rendimiento del 25% de la glicina protegida con Fmoc. Este porcentaje de rendimiento no es sorprendente teniendo en cuenta la concentración diluida de la reacción y sugiere que la presencia de 2 + iones y EDTA de Ni no interfieren con una reacción estándar de la protección Fmoc.
Con pruebas que corroboren que cada componente individual de nuestra metodología (hidrólisis, aislamiento de aminoácido libre, y la protección Fmoc) es factible, se realizó un experimento de prueba de concepto utilizando Ni-PBP-Gly. Se evaluó la viabilidad de las condiciones de hidrólisis descritas anteriormente y protección Fmoc posterior utilizando un protocolo estándar 8 para producir un aminoácido protegido con Fmoc con un rendimiento razonable. A una solución agitada de Ni-PBP-Gly (404 mg, 0,971 mmol, 1 equiv) en 40 ml de DMF a temperatura ambienteeratura se añadió una solución 0,2 M de EDTA a pH 4,5 (65 ml, 13 mmol, 13 equivalentes). La reacción se dejó en agitación durante la noche y luego se lavó cuatro veces con diclorometano. Después, la capa acuosa se ajustó a pH 7 usando bicarbonato sódico sólido. Para bicarbonato se añadió la fase acuosa de sodio (163 mg, 1,93 mmol, 2 equiv) y Fmoc-OSu (327 mg, 0,971 mmol, 1 equiv) disuelto en una cantidad mínima de dioxano. La reacción se dejó en agitación durante la noche y después se acidificó con ácido clorhídrico 1 M y se extrajo tres veces con acetato de etilo. Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron seis veces con salmuera, se concentraron, se secaron con sulfato de magnesio, y se secaron a vacío para proporcionar una mezcla de sin reaccionar Fmoc-OSu y Fmoc-Gly-OH (160 mg, 0,540 mmol, 54% de rendimiento). Los datos espectrales emparejado publicados anteriormente espectros para Fmoc-Gly-OH. 9 Este experimento final indica que es factible para aislar glicina libre de la Ni-PBP-Gly complejo y llevarlo adelante a su Fmoc-protforma reflejada.
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Discussion
El protocolo descrito anteriormente es útil en su capacidad para facilitar el aislamiento de un esqueleto de aminoácidos de un complejo de Ni-Schiff-base en condiciones de pH suaves y posterior protección Fmoc de esta aislada de ácido amino a través de dos pasos críticos. El primer paso implica la agitación de una solución de DMF / agua que contenía EDTA para facilitar la liberación del ácido amino del complejo. subproductos complejas o orgánicos residuales se pueden eliminar fácilmente con la extracción. El segundo paso de este protocolo implica una protección Fmoc del aminoácido que se encuentra en la capa acuosa después del aislamiento por extracción en la primera etapa. Hemos demostrado la capacidad de modificar este procedimiento en un rango de pH de 4.5 hasta 7.5, lo que permite una flexibilidad significativa que puede ser necesario para algunos grupos protectores de cadena lateral sensibles al pH.
Una limitación potencial de esta técnica es la baja concentración de reacción de la protección Fmoc de la aislada de ácido amino. Como facilitando correohidrólisis ficiente requiere varios equivalentes de EDTA con respecto al sustrato, las condiciones de reacción requieren una solución significativa cantidad acuosa EDTA (60 ml para una reacción de 1 mmol a escala). El uso de este volumen de disolvente en una resultados de protección Fmoc en una concentración relativamente baja (~ 0.015 M) de los reactivos. Si bien una reacción de prueba de concepto utilizando estas condiciones producto dio con un rendimiento prometedor 55% a pesar de las condiciones de reacción diluida, puede ser necesario aumentar esta concentración cuando se utiliza aminoácidos con nucleophilicty reducido con respecto a la glicina resultante del aumento de volumen estérico.
En resumen, hemos demostrado la utilidad de EDTA para fomentar la hidrólisis de un complejo de base Ni-Schiff usado típicamente para la síntesis de UAA de. Estas condiciones de hidrólisis no requieren la condición fuertemente ácida típica a estos hidrólisis, lo que permite la retención de los grupos de ácido lábil protección de cadena lateral. experimentos futuros deberían centrarse en la aplicación de tsu estrategia general a una variedad de sustratos de aminoácidos no naturales. El trabajo con este fin está en curso.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La financiación proporcionada por la Universidad de Slippery Rock. Nos gustaría dar las gracias a T. III boro (Universidad de Slippery Rock) y C. Haney (Universidad de Pennsylvania) por sus ideas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
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