Summary
Her presenterer vi en effektiv hydrolyse og påfølgende Fmoc-beskyttelse av en aminosyre isolert fra en Ni-Schiff-base-kompleks. Hydrolysebetingelser som er presentert her er egnet for bruk ved oppbevaring av syrelabile sidekjedebeskyttelsesgrupper er nødvendig. Denne teknikk kan tilpasses til en rekke forskjellige unaturlige aminosyre-substrater.
Abstract
Unaturlige aminosyrer, aminosyrer inneholdende sidekjede-funksjonaliteter ikke er vanlig ved natur, blir i økende grad funnet i syntetiske peptidsekvenser. Syntesen av noen ikke-naturlige aminosyrer inkluderer ofte bruk av en forløper bestående av en Schiff-base-stabilisert av en nikkel-kation. Unaturlige sidekjeder kan være installert på en aminosyre hovedkjede som finnes i denne Schiff-base-kompleks. Den resulterende unaturlig aminosyre kan deretter isoleres fra dette komplekset ved hjelp av hydrolyse av Schiff-basen, for eksempel ved anvendelse av tilbakeløpskjøling i sterkt sur løsning. Disse sterkt sure betingelser kan fjerne syrelabile sidekjedebeskyttende grupper som er nødvendig for de ikke-naturlige aminosyrer som skal anvendes i mikrobølgeassistert fast-fase peptidsyntese. I dette arbeidet presenterer vi en effektiv hydrolyse og påfølgende Fmoc-beskyttelse av en aminosyre isolert fra en Ni-Schiff-base-kompleks. Hydrolysebetingelser som er presentert i dette arbeidet er egnet for oppbevaring av syrelabile side-kjedebeskyttende grupper, og kan være tilpasningsdyktig til forskjellige unaturlige aminosyre-substrater.
Introduction
Unaturlige aminosyrer (UAA s) bærende sidekjeder som varierer fra de av de tyve naturlig forekommende aminosyrer som finnes i naturen, har funnet anvendelse i et bredt spekter av anvendelser. Syntese av disse UAA s, men kan være vanskelig avhengig av strukturen av sidekjedene og stereokjemien av aminosyren ryggrad. CH bond aktivering av glycin i forbindelse med en nikkel Schiff-basen komplekset har blitt anvendt for å fremstille en rekke av amino- syrederivater inkludert α, p-diamino-syrer 1 og UAA peiling fluorert 2 eller heterocykliske sidekjeder. 3
Etter tilsetning av unaturlige sidekjeder, funksjonaliserte UAA-er er typisk fjernet fra Schiff-base-kompleks ved tilbakeløp i saltsyre og 4 blir deretter isolert ved hjelp av ionebyttekromatografi. Mens vanligvis effektiv, genererer denne protokollen enMino syrer som kan være uegnet for bruk i fastfase-peptidsyntese (SPPS). Naturen av SPPS krever tilstedeværelse av syrelabile sidekjedebeskyttende grupper, og den sterkt sure natur av typiske Ni-Schiff-basen dekomponeringsbetingelser forhindrer isolering av UAA s med disse beskyttelsesgruppene intakt. Så vidt vi vet, har bare ett alternativ dekomponeringsmetoden blitt rapportert: anvendelse av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og hydrazin ved forhøyede temperaturer, 5 betingelser som i seg selv ikke kan være egnet for noen sidekjedebeskyttende grupper slik som ftalimider.
Figur 1: Syntese av Ni-PBP-Gly fra Ni2 +, PBP, og glysin (Gly). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Heri, rapporterer en metode for hydrolyse av en Ni-Schiff-base-kompleks, Ni-PBP-Gly (figur 1). Dette komplekset, avledet fra Ni2 +, glycin, og pyridin-2-karboksylsyre (2-benzoyl-fenyl) -amid (PBP), 6 har vist seg å være en nyttig plattform for syntese av en rekke UAA og er lett tilgjengelige ved hjelp av en to-trinns synteseveien. 7 Syntese av dette komplekset er litteratur-precedented i høyt utbytte. 6 Våre resultater som er beskrevet nedenfor demonstrerer anvendeligheten av hydrolyse-betingelser under anvendelse av EDTA ved svakt sur til nøytral pH-betingelser som er passende for bruk sammen med UAA peiling syrelabile sidekjedebeskyttende grupper. Etter hydrolyse, kan den resulterende vandige oppløsning bli isolert og umiddelbart underkastet standard Fmoc beskyttelsesbetingelser for å gi et Fmoc-beskyttet aminosyre (figur 2).
Figur 2: Hydrolyse og Fmoc-beskyttelse av en aminosyre Isolert fra Ni-PBP-Gly. Reaksjonsbetingelser: i. EDTA (12 ekv), pH 4,5; ii. Etylacetat-vaskematerialet og justering til pH 7; iii. Fmoc-OSu (1 ekv), NaHCO3 (2 ekv). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hydrolyse av Ni-Schiff-basekompleks
- Oppløs 1 mmol av Ni-PBP-Schiff-base-kompleks i 40 ml N, N-dimetylformamid (DMF) med omrøring i en 250 ml rundbunnet kolbe ved romtemperatur.
- I 60 ml 0,2 M vandig EDTA-oppløsning, pH 4,5.
- Ved hjelp av en magnetisk rørestav og røreplate, røre den kombinerte løsning over natten. Som Schiff-basen komplekset hydrolysert, vil fargen skifte fra en dyp rød til hvit.
- Etter fullførelse av reaksjonen som indikert ved fravær av noen rød farge, overføre reaksjonsblandingen til en 250 ml skilletrakt.
- Tilsett 50 ml diklormetan, cap skilletrakt, og bland. Drenere den organiske vaske i en avfallsbegerglass. Gjenta denne prosess tre ganger for å fjerne PBP og eventuelt gjenværende Ni-PBP-Schiff-base-kompleks. Oppsamle det gjenværende vandige sjikt i en 250 ml rundbunnet kolbe.
2. Fmoc Beskyttelse av Hydrolysert Amino Acid
- Legg 168 mg natriumbikarbonat (2,00 mmol, 2 ekv) til oppløsningen og omrørt ved hjelp av en magnetisk rørestav og røreplate.
- Oppløs 337 mg Fmoc-N-hydroksysuccinimid-ester (1,00 mmol, 1 ekv) i en minimal mengde dioksan (omtrent 4 eller 5 ml) i et 10 mL vial. Overføre denne løsning til den vandige oppløsning og omrørt over natten.
- Etter at reaksjonen ble omrørt over natten, surgjøres den resulterende oppløsning til pH 2 med 1 M saltsyre. Undersøk pH verdien periodisk ved hjelp av pH-teststrimler.
- Overfør reaksjonsblandingen til en 250 ml skilletrakt og tilsett 50 ml etylacetat. Cap skilletrakt, bland godt, og samle det organiske lag i en 250 mL Erlenmeyer kolbe. Gjenta denne prosessen to ganger til, og kombinerer de organiske ekstrakter. Tørk de kombinerte, organiske ekstrakter med omtrent 3 g magnesium sulfate.
- Konsentrer de kombinerte organiske ekstrakter ved bruk av en rotasjonsfordamper for å gi det rå Fmoc-beskyttet aminosyre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi antok at fjerning av Ni 2+ fra Ni-PBP-Gly-komplekset kan tillate en effektiv vandig hydrolyse av Schiff-base uten behovet for sterke pH-betingelser. Som EDTA er et billig og godt studert gelateringsmiddel, 10 vi antatt at tilsetning av EDTA til en oppløsning av Ni-PBP-Gly ville lette chelatering av Ni2 + -ioner, og dermed fremme hydrolyse av komplekset.
For å teste vår teori om at EDTA alene effektivt kunne fremme hydrolyse av komplekset, vi utsettes en oppløsning av Ni-PBP-Gly i DMF ved romtemperatur for å øke ekvivalenter av EDTA i pH 4,5 vandig oppløsning, ujustert pH av vandig EDTA-dinatriumsalt oppløsning . Fremdriften av hydrolysereaksjonen kan overvåkes ved å observere fargen på oppløsningen; ureagert Ni-PBP-Gly i løsning viser en dyp rød farge, mens PBP isolertfra dette komplekset er hvit. Vi sporet fremdriften av hydrolysereaksjonen ved å overvåke fargeendring av oppløsningen fra rødt til hvit (tabell 1). Reaksjoner som omfatter færre enn åtte ekvivalenter viste noen overgang av fargestoffer fra rød til hvit, men reaksjonen var ufullstendig i hvert tilfelle. Ingen fargeendring var tydelig for forhold uten EDTA.
Effekten av pH på hydrolyse ble likeledes undersøkt. Underkastelse av den Ni-PBP-Gly-komplekset for å hydrolysebetingelser ved anvendelse av 12 ekvivalenter av EDTA natten over med varierende pH-verdien ved romtemperatur viste vellykket hydrolyse av komplekset skjer under pH-forhold som strekker seg 4,5 til 7,5. Dette demonstrerer fleksibiliteten i EDTA hydrolyse; pH-verdien kan økes for å gjøre rede for mer ømfintlig overfor syre sidekjedebeskyttelsesgrupper.
| Betingelse | pH av EDTA-oppløsning | Night Completion | |
| 1 | 0 | 4.5 | Ingen |
| 2 | 2 | 4.5 | Delvis |
| 3 | 4 | 4.5 | Delvis |
| 4 | 6 | 4.5 | Delvis |
| 5 | 8 | 4.5 | Full |
| 6 | 10 | 4.5 | Full |
| 7 | 12 | 4.5 | Full |
| 8 | 12 | 5.0 | Full |
| 9 | 12 | 5.5 | Full |
| 10 | 12 | 6.0 | Full |
| 11 | 12 | 6.5 | Full |
| 12 | 12 | 7.0 | Full |
| 1. 3 | 12 | 7.5 | Full |
| 14 | 12 | 8,0 | Delvis |
Tabell 1: Ni-PBP-Gly hydrolysebetingelser.
For å kontrollere at hydrolysen var fullstendig ved hjelp av den mest effektive tilstand, 7, ekstrahert vi reaksjonen tre ganger med diklormetan, forenes og tørkes de organiske lag og analyseres den resulterende rest ved hjelp av kjernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR). NMR-spekteret viste ingen tegn på Ni-PBP-Gly i prøven; de eneste resonanser som finnes i spektrumet samsvarer med litteraturrapporter for PBP, noe som tyder på fullstendig hydrolyse av komplekset.
Vi undersøkte hvorvidt vår optimale hydrolysebetingelser med aminosyrer inneholdeing en rekke sidekjedebeskyttelsesgrupper. Prøver av Fmoc-L-glutaminsyre-5-tert.-butylester (Fmoc-Glu (t Bu) -OH), Fmoc- O - tert-butyl-L-treonin (Fmoc-Thr (t Bu) -OH), Fmoc - O - tert-butyl-L-tyrosin (Fmoc-Tyr (tBu) -OH), og N (i) Boc- N α Fmoc-L-tryptofan (Fmoc-Trp (Boc) -OH) ble det oppløst i DMF og underkastet hydrolyse ved romtemperatur ved anvendelse av 12 ekvivalenter av EDTA ved pH 4,5. Etter å ha blitt omrørt over natten, ble oppløsningene ble ekstrahert med diklormetan og analysert ved NMR. En representativ NMR er inkludert for Fmoc-Glu (tBu) -OH (figur 3). I hvert tilfelle, spektrale data viste fullstendig oppbevaring av sidekjedebeskyttelsesgrupper. 11, 12, 13
Figur 3: Representative NMR av et Fmoc-monomer som bærer en syrelabile sidekjedebeskyttende gruppe etter underkastelse for hydrolysebetingelser.
Den syrelabile sidekjedebeskyttende gruppe er markert med en blå-boksen. Avrundede integrasjonsverdier for de protonsignaler av denne forbindelse er inkludert i parentes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Etter hydrolyse og organisk ekstraksjon, inneholder den gjenværende vandige lag den frie aminosyre sammen med gjenværende EDTA og Ni2 + -ioner. For å sikre at tilstedeværelsen av disse substanser ikke ville forstyrre påfølgende Fmoc-beskyttelse av den frie aminosyren, utførte vi en testreaksjon ved oppløsning av glycin i en vandig løsning inneholdende EDTA og Ni2 + -ioner med konsentrasjoner tilsvarende hydrolyse adgang 7. We deretter underkastet denne løsningen til en standard vandig Fmoc-beskyttelse. 8 Etter at reaksjonen var fullført og opparbeidelsen fant vi ut at reaksjonen ga et 25% utbytte av Fmoc-beskyttede glycin. Denne prosent utbytte er ikke overraskende med tanke på fortynnede konsentrasjonen av reaksjonen og antyder at nærværet av Ni2 + -ioner og EDTA ikke kommer i konflikt med en standard Fmoc-beskyttelsesreaksjon.
Med bevis som støtter at hver enkelt komponent av vår metode kan (hydrolyse, isolering av fri aminosyre, og Fmoc-beskyttelses) er gjennomførbart, utførte vi en proof-of-concept eksperiment ved anvendelse av Ni-PBP-Gly. Vi vurderte levedyktighet av hydrolysebetingelser som er beskrevet ovenfor, og påfølgende Fmoc-beskyttelse under anvendelse av en standard protokoll 8 for å tilveiebringe et Fmoc-beskyttet aminosyre i rimelig utbytte. Til en omrørt oppløsning av Ni-PBP-Gly (404 mg, 0,971 mmol, 1 ekv) i 40 ml DMF ved romtemperaturerature ble det tilsatt 0,2 M EDTA-løsning ved pH 4,5 (65 ml, 13 mmol, 13 ekv). Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten og deretter vasket fire ganger med diklormetan. Det vandige laget ble deretter justert til pH 7 ved bruk av fast natriumbikarbonat. Til det vandige laget ble det tilsatt natriumbikarbonat (163 mg, 1,93 mmol, 2 ekv) og Fmoc-OSu (327 mg, 0,971 mmol, 1 ekv) ble oppløst i en minimal mengde dioksan. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten og deretter surgjort med 1 M saltsyre og ekstrahert tre ganger med etylacetat. De organiske ekstraktene ble kombinert, vasket seks ganger med saltvann, konsentrert, tørket med magnesiumsulfat, og tørket under vakuum for å gi en blanding av ureagert Fmoc-OSu og Fmoc-Gly-OH (160 mg, 0,540 mmol, 54% utbytte). Spektraldata matchet tidligere utgitt spektra for Fmoc-Gly-OH. 9. Dette siste forsøket viser at det er mulig å isolere fri glycin fra Ni-PBP-Gly-komplekset og føre den frem til sin Fmoc-protected form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokoll som er beskrevet ovenfor er hensiktsmessig ved sin evne til å lette isoleringen av en aminosyre hovedkjede fra en Ni-Schiff-base-kompleks under milde pH-betingelser og påfølgende Fmoc-beskyttelses av dette isolerte aminosyre gjennom to kritiske trinn. Det første trinn medfører røring av en DMF / vann-oppløsning inneholdende EDTA for å lette frigivelse av aminosyren fra komplekset. Gjenværende komplekse eller organiske biprodukter kan lett fjernes med ekstraksjon. Det andre trinnet av denne protokollen involverer en Fmoc-beskyttelse av aminosyren som finnes i det vandige lag etter isolering ved ekstraksjon i det første trinnet. Vi har vist evne til å modifisere denne fremgangsmåte i et pH-område på 4,5 til 7,5, slik at betydelig fleksibilitet som kan være nødvendig for noen pH-følsomme side-kjede beskyttende grupper.
Én potensiell begrensning ved denne teknikk er den lave reaksjons konsentrasjon av Fmoc-beskyttelses av det isolerte aminosyre. Som tilrettelegging for efficient hydrolyse krever flere ekvivalenter av EDTA i forhold til underlaget, de reaksjonsbetingelser som krever en betydelig mengde vandig EDTA-løsning (60 ml av en 1 mmol-skala-reaksjon). Ved hjelp av dette volum av løsningsmiddel i en Fmoc-beskyttelses resulterer i en forholdsvis lav (~ 0,015 M) konsentrasjon av reagenser. Mens en proof-of-concept reaksjon under anvendelse av disse betingelser ga produktet i et lovende 55% utbytte til tross for de fortynnede reaksjonsbetingelser, kan det være nødvendig å øke denne konsentrasjon når det anvendes aminosyrer med redusert nucleophilicty i forhold til glycin som følge av øket sterisk bulk.
I sammendrag er det demonstrert nytten av EDTA for å fremme hydrolyse av en Ni-Schiff-basekompleks som typisk anvendes for syntese av UAA s. Disse hydrolysebetingelser krever ikke den sterkt sure betingelser for typisk for disse hydrolyse, slik at for fastholdelse av syrelabile sidekjedebeskyttende grupper. Fremtidige eksperimenter bør fokusere på å bruke thans generell strategi for en rekke forskjellige unaturlige aminosyre-substrater. Arbeid mot dette målet er pågående.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Finansiering fra Slippery Rock-universitetet. Vi ønsker å takke T. Boron III (Slippery Rock-universitetet) og C. Haney (University of Pennsylvania) for sin innsikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
- Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic α,β-diamino acids. J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).
- Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear ω,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine. J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).
- Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-β,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles. Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).
- Belokon, Y. N. Highly efficient catalytic synthesis of α,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).
- Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate. J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).
- Belokon, Y. N. Synthesis of α,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases. J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).
- Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine. Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).
- Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries. Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).
- Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. "One-pot", preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide. Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).
- Hart, J. R. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2000).
- Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine. J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).
- Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes. Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).
- Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of α,-peptide-β,-peptoid chimeras. Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).
